Результат интеллектуальной деятельности: Индикатор для выявления биологических плёнок бактерий на медицинских инструментах (варианты)

Изобретения относятся к областям микробиологии, эпидемиологии, биохимии, санитарии, гигиены, представляют собой композиции и могут быть использованы для индикации биологических плёнок бактерий на различных поверхностях медицинских инструментов, например, на внешней поверхности и каналах гибких и жёстких эндоскопов.

Более 95% всех бактерий обитают на абиотических и биотических поверхностях в состоянии биоплёнки, а не в виде планктонных (свободноживущих) форм. Биоплёнки - это микробные ассоциации, представляющие собой непрерывный мультислой бактериальных клеток, прикреплённых к поверхности раздела фаз и друг к другу и заключенных в экзополисахаридный матрикс.

Формирование биоплёнки сопровождается образованием экзополимерного матрикса - продукта жизнедеятельности самих клеток. При созревании биоплёнки продуцируется значительное количество экзополимера, объединяющего соседние клетки и формирующего матрикс. Экзополимеры составляют 85% массы биоплёнки, а 15% - бактерии. Матрикс является основным структурным компонентом биоплёнки. Экзополисахариды составляют значительную часть матрикса. У прокариот, так же как и у эукариот, полисахариды формируют поверхностный слой клеточной оболочки (гликокаликс). У бактерий экзополисахариды образуют капсулу, слизистые слои и могут освобождаться во внешнюю среду, отделяясь от клеточной поверхности. Экзополисахаридный матрикс (ЭПМ) осуществляет также такие важнейшие функции как каркасная и защитная. ЭПМ защищает бактерии в биоплёнке от антибактериальных препаратов, негативных факторов внешней среды, таких, как УФ-облучение, радиация, изменения рН, осмотический шок, высыхание.

Таким образом, бактерии в биоплёнке заключены в полимерный матрикс, свойства которого определяют взаимоотношения внутри клеточного сообщества и с внешней средой. Матрикс у различных видов бактерий неодинаков по физическим свойствам и химическому составу, но, как правило, представляет собой анионный полимер.

Выявление и идентификация бактерий в состоянии биоплёнки затруднено, поскольку ЭПМ препятствует механическому переносу бактерий на питательные среды для последующей идентификации. В практике текущего санитарного надзора за критичными объектами лечебно-профилактических учреждений и предприятий пищевой промышленности широко используется метод смывов бактерий на питательные среды с целью контроля эффективности санитарной обработки поверхностей, инструментария, аппаратуры и оборудования.

В связи с увеличением использования малоинвазивных высокотехнологичных оперативных методов и манипуляций, эндоскопическая техника - жёсткие и гибкие эндоскопы используются в подавляющем большинстве оперативных вмешательств на желудочно-кишечном тракте и органах дыхания.

При этом некачественное обеззараживание эндоскопической техники может привести и инфицированию пациентов.

Известны диагностические процедуры по обнаружению бактерий в состоянии биоплёнки на поверхностях эндоскопов (СП 3.1.3263-15. Санитарно-эпидемиологические правила. Профилактика инфекционных заболеваний при эндоскопических вмешательствах. Утверждены постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации А.Ю. Поповой от 8 июня 2015 года N 20// «ТЕХЭКСПЕРТ» и «КОДЕКС», Электронный фонд правовой и нормативно-технической документации [Электронный ресурс], URL: http://docs.cntd.ru/document/420283545, дата обращения: 10.08.2019), заключающиеся во взятии смывов, которое производится с помощью стерильных увлажненных ватных тампонов или промывании стерильной водой каналов эндоскопов с последующим посевом на питательные среды. Стерильные ватные тампоны на стеклянных, металлических или деревянных палочках, вмонтированных в пробирки с ватными пробками, заготавливают заранее в лаборатории. Однако данная методика смывов с поверхностей может определять только лишь планктонные, т.е. отдельно растущие, формы бактерий или грибов, которые составляют незначительную часть вероятного микробного обременения поверхностей.

ЭПМ не позволяет качественно оценить санитарное состояние поверхностей, методом смывов, скрывая бактерии или патогенные грибы от посева при помощи тампона, препятствуя механическому переносу бактерий на питательные среды для последующей идентификации.

Таким образом, отрицательный результат санитарно-бактериологического контроля методом исследования смывов является недостаточно достоверным (ложноотрицательным) и не учитывает возможности существования бактерий и грибов в состоянии биоплёнки.

Наиболее близким аналогом изобретений является индикатор для выявления бактерий, в том числе в состоянии биоплёнки (Biofilm Remove
[Электронный ресурс]: Detection of biofilms with BioFinder, URL: https://biofilmremove.com/en/, дата обращения: 20.10.2018), представляющий собой водно-спиртовой раствор пероксида водорода. Такой индикатор малоэффективен для выявления бактерий, находящихся в состоянии зрелой и подсушенной биоплёнки, вследствие наличия мощного экзополисахаридного матрикса, так как не содержит специальных веществ для его разрушения.

Задачей предлагаемой группы изобретений является создания веществ-индикаторов, позволяющих повысить качество оценки медицинских инструментов на наличие бактерий в состоянии биоплёнки, кроме того, индикаторы должны не портить и не окрашивать обрабатываемые поверхности, быть хорошо растворимыми в воде и легко смываться, быть экологически безопасными и биоразлагаемыми.

Технический результат изобретений заключается в повышении достоверности выявления бактерий в состоянии биоплёнки на различных поверхностях медицинских инструментов.

Указанный результат достигается индикатором для выявления биологических плёнок бактерий на медицинских инструментах, имеющим гелеобразную структуру и содержащим пероксид водорода, стабилизатор пероксида водорода, N-кокоалкил-N,N-диметиламин оксид, NN-бис(3-аминопропил)додециламин, ингибитор коррозии, комплексообразователь, загуститель и воду при следующем соотношении компонентов, масс. %:

пероксид водорода 3,0-10,0;

стабилизатор пероксида водорода 0,5;

N-кокоалкил-N,N-диметиламин оксид 1,5;

NN-бис(3-аминопропил)додециламин 0,25;

ингибитор коррозии 0,05;

комплексообразователь 0,5;

загуститель 2,0;

вода остальное.

Индикатор может содержать хлоргексидина диглюконат в концентрации 1,5% до 3,0%.

Также результат достигается индикатором для выявления биологических плёнок бактерий на медицинских инструментах, который представляет собой водный раствор и содержит пероксид водорода, коллоидное серебро, стабилизатор пероксида водорода, ингибитор коррозии, комплексообразователь и воду при следующем соотношении компонентов, масс. %:

пероксид водорода 3,0-10,0;

коллоидное серебро 0,0012-0,0024;

стабилизатор пероксида водорода 0,5;

ингибитор коррозии 0,05;

комплексообразователь 0,5;

вода остальное.

Индикаторы с высокой достоверностью позволяют выявлять грамположительные и грамотрицательные бактерии в состоянии биоплёнки на различных абиотических поверхностях, таких как нержавеющая сталь, плитка, полипропилен, окрашенные поверхности и пр.

Преимущество данного вида обнаружения заключается ещё и в том факте, что биоплёнки, как правило, имеют поливидовую структуру и для детекции (обнаружения, выявления) достаточно одного вида каталазо-позитивных бактерий в биоплёнке. Тем не менее, индикаторы позволяют выявлять и моновидовые биоплёнки.

Каталаза является основным первичным антиоксидантом системы защиты, которая катализирует разложение пероксида водорода до воды. Пероксид водорода разрушается двумя классами родственных ферментов, катализирующих её двухэлектронное восстановление до H₂O и использующих в качестве донора электронов H₂O₂ в случае каталазы или различные органические соединения - в случае пероксидазы.

Каталазная и пероксидазная активности обнаружены у всех аэробных и факультативно анаэробных прокариот. Среди облигатных анаэробов эти ферменты распространены значительно в меньшей степени, чем супероксиддисмутаза.

Разработанная формула индикаторов подразумевает большую эффективность по сравнению с аналогами за счёт наличия специальных веществ, разрушающих защитный ЭПМ биоплёнки и тем самым увеличивающих количество бактериальных клеток, вступающих в реакцию.

Разработана рецептура индикатора на основе пероксида водорода, созданы опытные образцы индикатора и подобраны рабочие концентрации активных ингредиентов водного раствора образца методом серийных разведений с выявлением максимальной активности на зрелых биоплёнках грамположительных и грамотрицательных бактерий.

Первый индикатор для выявления биологических плёнок бактерий на медицинских инструментах имеет гелеобразную структуру и содержит пероксид водорода, стабилизатор пероксида водорода, N-кокоалкил-N,N-диметиламин оксид,NN-бис(3-аминопропил)додециламин, ингибитор коррозии, комплексообразователь, загуститель, дополнительно включает краситель Е133, и воду при следующем соотношении компонентов, масс. %:

пероксид водорода 3,0-10,0;

стабилизатор пероксида водорода 0,5;

N-кокоалкил-N,N-диметиламин оксид 1,5;

NN-бис(3-аминопропил)додециламин 0,25;

ингибитор коррозии 0,05;

комплексообразователь 0,5;

загуститель 2,0;

краситель Е133 0,05;

вода остальное.

Дополнительно первый индикатор может содержать хлоргексидина диглюконат в концентрации от 1,5% до 3,0%.

Второй индикатор для выявления биологических плёнок бактерий на медицинских инструментах представляет собой водный раствор и содержит пероксид водорода,коллоидное серебро, стабилизатор пероксида водорода, ингибитор коррозии, комплексообразователь и воду при следующем соотношении компонентов, масс. %:

пероксид водорода 3,0-10,0;

коллоидное серебро 0,0012-0,0024;

стабилизатор пероксида водорода 0,5;

ингибитор коррозии 0,05;

комплексообразователь 0,5;

вода остальное.

Первый индикатор для выявления биоплёнок бактерий представляет собой густой гелеобразный раствор, что способствует пролонгации визуализации пузырьков (барботирования). Он практичен для применения на внешних поверхностях различных медицинских инструментов, например, на эндоскопической технике. Второй индикатор в силу своей жидкой структуры подходит для нанесения на имеющиеся внутренние поверхности медицинских инструментов, например, каналы эндоскопов. Описанное применение индикаторов является рекомендуемым, но не обязательным.

В качестве стабилизатора пероксида водорода для двух индикаторов могут использоваться салициловая кислота или пирофосфорнокислый натрий 0,5%, ингибитора коррозии - алкилдиметилбензиаммония хлорид 0,05% или другие анионные, катионные и смешанные ингибиторы коррозии, комплексообразователя - силикаты/метасиликаты натрия, например, карбонат натрия, загустителя - полиакриловая кислота.

Приведём примеры индикаторов с различными возможными концентрациями составляющих веществ.

Таблица 1. Примеры концентраций составляющих (масс. %) веществ первого индикатора

Таблица 2. Примеры концентраций составляющих (масс. %) веществ второго индикатора

Таблица 2. Продолжение

Возможность осуществления изобретений подтверждается следующими примерами.

Первый пример получения раствора первого индикатора. Для получения 100 мл первого индикатора в виде гелеобразного готового к применению раствора при комнатной температуре 1,5 мл N-кокоалкил-N,N-диметиламин оксид (ʺBarlox-12ʺ (Барлокс-12), каталог фирмы ʺLonzaʺ (Лонза) растворяют в 100 мл воды, добавляют 6,0 мл 50%-ного пероксида водорода, 1,5 г NN-бис(3-аминопропил)додециламина, пирофосфорнокислый натрий 0,2 мл, карбонат натрия 0,5 г, полиакриловая кислота 3 мл, 0,01 г красителя Е133.

Второй пример получения растворапервого индикатора. Осуществляют аналогично первому примеру получения раствора первого индикатора, но средство включает 1,5 мл хлоргексидина диглюконата, 1,0 мл N-кокоалкил-N,N-диметиламин оксида, 12 мл 50%-ного пероксида водорода.

Третий пример получения раствора первого индикатора. Осуществляют аналогично первому примеру, но средство включает 2,0 мл хлоргексидина диглюконата, 2,0 мл N-кокоалкил-N,N-диметиламин оксида, 16 мл 50%-ного пероксида водорода.

Четвертый пример получения раствора первого индикатора. Осуществляют аналогично первому примеру, но средство включает 2,5 мл хлоргексидина диглюконата, 2,0 мл N-кокоалкил-N,N-диметиламин оксида, 20 мл 50%-ного пероксида водорода.

Первый пример получения раствора второго индикатора. Для получения 100 мл второго индикатора в виде жидкого готового к применению раствора при комнатной температуре 6,0 мл 50%-ного пероксида водорода растворяют в 100 мл воды, добавляют 6,0 мл 50%-ного пероксида водорода, добавляют 1,2 мл 10%-ного коллоидного серебра, пирофосфорнокислый натрий 0,2 мл, карбонат натрия 0,5 г.

Второй пример получения раствора второго индикатора. Осуществляют аналогично первому примеру получения раствора второго индикатора, но средство включает 2,4 мл 10%-ного коллоидного серебра.

Третий пример получения раствора второго индикатора. Осуществляют аналогично первомупримеру, но средство включает 12 мл 50%-ного пероксида водорода и 2,4 мл 10%-ного коллоидного серебра.

Четвертый пример получения раствора второго индикатора. Осуществляют аналогично первому примеру, но средство включает 12 мл 50%-ного пероксида водорода и 2,4 мл 10%-ного коллоидного серебра.

Пятый пример получения раствора второго индикатора. Осуществляют аналогично первому примеру, но средство включает 16 мл 50%-ного пероксида водорода и 1,2 мл 10%-ного коллоидного серебра.

Шестой пример получения раствора второго индикатора. Осуществляют аналогично первому примеру, но средство включает 16 мл 50%-ного пероксида водорода и 2,4 мл 10%-ного коллоидного серебра.

Седьмой пример получения раствора второго индикатора. Осуществляют аналогично первому примеру, но средство включает 20 мл 50%-ного пероксида водорода и 1,2 мл 10%-ного коллоидного серебра.

Восьмой пример получения раствора второго индикатора. Осуществляют аналогично первому примеру, но средство включает 20 мл 50%-ного пероксида водорода и 2,4 мл 10%-ного коллоидного серебра.

Активность индикаторов протестированана зрелых сформированных биоплёнках следующих штаммов:

Грамположительный:

- Staphilococcusaureus 15 и

Грамотрицательные:

- E.coli 717,

- Pseudomonas aeruginosa 32,

- Acinetobacter baumanii 503,

- Klebsiella pneumoniae 1553,

- Salmonella typhimurium C53,

SalmonellatyphimuriumC53rpoS с мутацией в гене rpoS, приводящей к нарушению синтеза ферментакаталазы.

Как известно, фермент каталаза, является катализатором в реакции разложения пероксида водорода, при которой образуются вода и молекулярный кислород: Н2О2 + Н2О2 = О2 + 2Н2О.

Биологическое значение каталазы заключается именно в разложении пероксида водорода, которая образуется в клетках при воздействии ряда флавопротеиновых оксидаз, чем обеспечивается действенная защита клеточных структур от разрушения, которое осуществляет пероксид водорода. Каталаза имеется в тканях растений, животных и человека, а также и в бактериях, хотя у ряда анаэробных бактерий этот фермент отсутствует.

Каталаза - один из самых быстрых ферментов. Всего одна его молекула способна превращать миллионы молекул пероксид водорода в воду и кислород за секунду. С точки зрения энзимологии это значит, что для фермента каталазы характерно большое число оборотов. Что касается бактерий, то визуально это легко наблюдать - при взаимодействии бактериальных клеток с ферментом начинается активное выделение пузырьков кислорода.

Для того чтобы это было четко видно в нашем случае, в тестируемую коллекцию штаммов была включена изогенная пара штаммов S. typhimurium - исходного дикого штамма и штамма, несущего мутацию rpoS - глобального регулятора экспрессии генов, которая приводит к нарушению синтеза каталазы.

Тестирование чувствительности индикаторов

Вариант I

1. Клетки суточных культур S. aureus 15 и P. Aeruginosa 32 осадили центрифугированием (10 мин при 7.000 об/мин), ресуспендировали в 200 мкл физ. раствора и в прозрачных пробирках в 5 мл физ. раствора приготовили исходные суспензии бактерий в концентрации n х 10⁸кл/мл.

2. В пробирках Эппендорф сделали десятикратные разведения исходных бактериальных суспензий на физ. растворе и/или воде (от 10⁸ до 10³кл/мл).

3. В большие лунки 24-х луночных планшет осторожно внесли в центр плоского донышка по 100 мкл последовательных десятикратных разведений бактериальных суспензий каждой культуры.

Вариант II

После приготовления исходных суспензий бактерий (10⁸кл/мл) смешали равные объемы обоих культур, также как в I варианте сделали последовательные десятикратные разведения и также внесли по 100 мкл каждого разведения смешанной культуры на донышко больших лунок.

Оба планшета с двумя вариантами опыта поставили подсушиваться в термостат на 37°C на 18 часов. На следующий день внесли в один ряд лунок с разведениями каждой культуры или микст-культуры раствор второго индикатора, а в другой раствор первого индикатора.

Визуально наблюдалось образование пузырьков в пробах с 10⁷ до 10⁴кл/100 мкл. При этом в лунках с высокой концентрацией клеток (10⁷-10⁶кл/пробу) пузырьки образуются довольно быстро - в течение 1 мин. Меньшие концентрации клеток формируют видимые пузырьки несколько позднее - через 5 мин. Такие мелкие пузырьки можно определить только с лупой, т.к. они очень малы и редки.

Поэтому говорить о чувствительности этой реакции можно только, как о чувствительности микроскопического тестирования: n х10⁴ - n х10⁶кл/пробу.

Пробы микст-культур дают такую же чувствительность визуального наблюдения.

Следует отметить, что первый гелевый индикатор оказывает стабилизирующее воздействие на микропузырьки на более длительное время, что может несколько повысить чувствительность выявления клеток в подсушенной бактериальной биоплёнке.

Проводилось исследование эффективности индикаторов в отношении биоплёнок выращенных на дистальном конце эндоскопа, пластиковом элементе корпуса и головке дистального конца эндоскопа.

Для осуществления эксперимента исходно была приготовлена смесь культур S.aureus 15 и P.aeruginosa 32 в LB (1:100).

В стеклянный стакан с подготовленной микст-культурой был помещён и закреплён дистальный конец эндоскопа. Конструкцию поместили в термостат для инкубации при 37°C в течение 20 часов. На следующий день дистальный конец извлекли из бактериальной суспензии и три раза промыли водой.

В первом варианте опыта промытый конец эндоскопа опустили в стеклянный стакан с прозрачным раствором второго индикатора.

В первые секунды было отмечено, что началась бурная реакция клеток, входящих в состав микст-биоплёнки, с компонентами раствора, стали активно образовываться пузырьки кислорода.

Реакция барботирования через несколько минут продемонстрировала снижение эффекта, т.к. каталазная реакция истощалась. Наиболее заметной осталась реакция клеток в биоплёнке, сформировавшейся на границе воздушной и водной фаз, т.к. на границе двух фаз аэрофильные микроорганизмы формируют более интенсивную биоплёнку.

Во втором варианте опыта промытый дистальный конец эндоскопа опустили в стеклянный стакан с первым гелевым индикатором. Как и в первом вариантеопыта было отмечено, что началась бурная реакция клеток, входящих в состав микст-биоплёнки, с компонентами раствора, также активно стали образовываться пузырьки кислорода.

Отдельные детали эндоскопа также, как и дистальный конец самого эндоскопа, помещали в бактериальную суспензию микст-культуры S. aureus 15 и P. aeruginosa 32 в LB(1:100). Формирование бактериальной биоплёнки также проводили при инкубировании в термостате при 37°C в течение 20 часов. Детали эндоскопа также промывали в воде три раза и подсушивали. Затем на отдельную черную пластиковую деталь наносили 300 мклпервого гелевого индикатора. Реакция бактериальных клеток биоплёнки с индикатором отмечалась мгновенно.

Головку дистального конца эндоскопа с отмытыми и подсушенными бактериальными биоплёнками помещали в маленькую чашечку Петри и также вносили первый гелевый индикатор. Эффект взаимодействия бактериальных клеток биоплёнки с гелевым пероксидным индикатором также отмечался мгновенно.

Таким образом, можно сделать следующие выводы.

1. Разработанные индикаторы основаны на реакции пероксида водорода с ферментом антиоксидантной защиты бактериальной клетки - каталазой.

2. Индикаторы могут применяться на различных абиотических поверхностях и имеют допустимые для использования в различных областях народного хозяйства характеристики безопасности.

3. Эффективность индикаторов зависит от количества бактериальных клеток, а визуализируемый невооруженным глазом количественный показатель бактерий находится в пределах 10⁴ - 10⁶ клеток на мл.

4. Исследования эффективности индикаторов, проведенные на различных материалах, в том числе на эндоскопической технике, подтвердили возможность использования их для определения наличия бактериального контаминирования, в том числе в состоянии биоплёнки на абиотических поверхностях, включая медицинские инструменты, аппаратуру и оборудование, в том числе гибкие и жёсткие эндоскопы.