СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА С ЭНДОИНУЛИНАЗНОЙ И САХАРАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ ПУТЕМ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ШТАММА МИЦЕЛИАЛЬНОГО ГРИБА PENICILLIUM CANESCENS Sopp INUA3

Изобретение в области биотехнологии относится к микробиологической промышленности и представляет собой способ получения ферментных препаратов с эндоинулиназной и сахаразной активностью путем культивирования рекомбинантного штамма мицелиального гриба Penicillium canescens Sopp INUA3 (ВКМ F-4564D), полученного в результате генетической трансформации фрагментом ДНК, содержащим гетерологичный ген эндоинулиназы Aspergillus niger.

Функциональные продукты питания и напитки на сегодняшний день являются самым быстрорастущим сегментом пищевой отрасли на мировом рынке. Тенденция массового перехода на «здоровые» продукты имеет место и в России. Уже сегодня спрос на продукты здорового питания устойчиво растет. Одним из компонентов здорового питания являются пребиотики, вещества, которые селективно ферментируются микрофлорой толстой кишки, вызывая активный рост полезных микроорганизмов, что, в свою очередь, приводит к улучшению пищеварения и усвояемости питательных веществ в организме. К пребиотикам относят соединения углеводной группы - моносахариды, полисахариды и олигосахариды, в частности, фруктоолигосахариды (ФОС). Наиболее популярными в мировой практике пребиотиками являются инулин, биополимер-олигофруктан, состоящий из β-2,1-связанной фруктозы, с остатком глюкозы на невосстанавливающем конце цепи, и фруктоолигосахариды, получающиеся путем расщепления инулина на более короткие полимерные цепочки.

Долгое время считалось, что возможностей для производства инулина и ФОС в РФ нет. Ведущие мировые производители ФОС в качестве сырья используют цикорий. В России же полностью отсутствуют посадки цикория инулиносодержащих сортов в связи с климатическими условиями. В этой связи, особого внимания заслуживает многолетнее растение топинамбур (Heliantnus tuberosus), который, благодаря исключительному биополимерному составу (линейному, в отличии от цикория) становится одной из самых популярных сырьевых культур.

Существует ряд технических решений, связанных с экстракцией фруктоолигосахаридов из клубней топинамбура [RU 2489445]. Данное техническое решение характеризуется высокой энергозатратностью и, как следствие, экономической неэффективностью процесса получения ФОС. В мировой практике существуют и другие способы выделения ФОС из инулинсодержащего сырья, например, связанные с применением кислотного гидролиза инулосодержащего сырья. Однако такие способы экологически небезопасны.

В отличии от вышеуказанных технологий, ферментативный гидролиз инулосодержащего сырья является экологически чистым процессом и происходит под действием так называемого инулиназного комплекса ферментов - набора эндо- и экзоинулиназ, гидролизующих молекулы инулина - основного полисахарида топинамбура с получением ФОС и простых (фруктозы и глюкозы) сахаров, в зависимости от типа используемого фермента. Прототипом такого способа может являться технология получения инулина у компании Sudzucker AG (Mannheim/Ochsenfurt, DE) [Process for the preparation of long-chain inulin with inulinase, US 5478732] и получения ФОС у компании Raffinerie Tirlemontoise (BE) [Fructooligosaccharide composition, process for its production and use, US 20110081449 A1]. Однако оба процесса в данных патентах предполагают использование цикория - основной инулосодержащей культуры Европы.

Таким образом, получение ФОС путем ферментативного гидролиза линейного инулина клубней топинамбура является для современной пищевой индустрии в РФ актуальной и социально-значимой задачей.

В качестве основного инулолитического фермента, используемого для деструкции инулина с получением ФОС применяется эндоинулиназа. Эндоинулиназа (2,1-β-D-фруктанфруктаногидролаза, КФ 3.2.1.7) является эндодеполимеразой и гидролизует β-2,1-связи инулина преимущественно до ФОС. Данный тип ферментов функционирует в более мягких условиях по сравнению с кислотным гидролизом, широко использующимся на сегодняшний день для деструкции инулина и требующим значительной концентрации ионов водорода, высокой температуры и специального оборудования, устойчивого к агрессивным средам [Yi, Н., Zhang, Lanwei, Hua, С., Sun, K., & Zhang, L. Extraction and Enzymatic Hydrolysis of Inulin from Jerusalem artichoke and their Effects on Textural and Sensorial Characteristics of Yogurt // Food and Bioprocess Tech. - 2009. - V. 3. - N. 2. - P. 315-319].

Ранее, на основе рекомбинантного штамма Penicillium canescens Sopp INUA3 (BКM F-4564D) был получен экспериментальный образец нового ферментного препарата эндоинулиназы (ЭНДИН), характеризующийся высоким содержанием эндоинулиназы с высокой удельной активностью. Данный ферментный препарат осуществляет гидролиз олигофруктана-инулина с образованием более коротких цепочек - фруктоолигосахаридов со степенью полимеризации от 2 до 8, что является оптимальным размером ФОС, использующихся в пищевой промышленности в качестве пребиотиков [Волков П.В. и др. Получение ферментных препаратов эндоинулиназы для высокоэффективного гидролиза клубней топинамбура, Хранение и переработка сельхозсырья 2012, №2, стр. 12-14; Волков П.В. и др. Получение ферментных препаратов на основе рекомбинантных штаммов Penicillium canescens с высокой способностью к гидролизу растительного сырья // Прикладная биохимия и микробиология, 2012, т. 48, N1, с. 66-73].

Стоит отметить, что ферментный препарат ЭНДИН, продуцентом которого является рекомбинантный штамм Penicillium canescens, является одним из ряда аналогичных ферментных препаратов инулиназ (2,1-β-D-фруктан-фруктаногидролазы эндо- и/или экзо-типа действия), используемых в мировой практике и предназначенных для гидролиза инулин-содержащего сырья с получением фруктоолигосахаридов и простых сахаров (фруктозы, глюкозы). К таким ферментным препаратам относятся: Novozym 230, Fructozyme SP 230, Fructozyme L (Novozymes) или, например, Oligofructase 3000 (Beldem/Puratos).

Однако, в технологическом процессе переработки топинамбура в ФОС существует стадия отделения фруктоолигосахаридов (ФОС) от низкомолекулярных продуктов (сахарозы и моносахаридов), где применяются мембранные или хроматографические методы разделения [Jerusalem artichoke/chicory comprehensive utilization method, CN 102504048, Continuous type nanofiltration purification and concentration device for inulin extraction, CN 202543120]. Присутствие сахарозы в разделяемой смеси значительно ухудшает параметры разделения, приводит к снижению степени чистоты ФОС на выходе процесса разделения и понижению качества конечной продукции.

Сахароза (a-D-глюкопиранозил-1,2-β-D-фруктофуранозид) под действием фермента сахаразы (α-β-(1,2)-глизозилгидролазы, сахарозо-α-глюкозидазы) расщепляется с образованием D-глюкозы и D-фруктозы. Наличие фермента сахаразы наряду с эндоинулиназной активностью, приведет к понижению уровня сахарозы в реакционной смеси, что приведет к улучшению технологических характеристик процесса биоконверсии топинамбура в ФОС.

Опытным путем было установлено, что штамм Penicillium canescens RN-3-11-7, который является реципиентом штамма Penicillium canescens Sopp INUA3 (ВКМ F-4564D), обладает ферментативной активностью по сахарозе на уровне 36±3 ед/мл культуральной жидкости при использовании стандартной ферментационной среды следующего состава, %: свекловичный жом - 3, пептон - 5, KH₂PO₄ - 2,5.

Таким образом, стоит задача в получении ферментного препарата, обладающего наряду с эндоинулиназной активностью, также и достаточной сахаразной активностью.

Поставленная задача решается путем модификации условий культивирования штамма P. canescens Sopp INUA3 с целью увеличения сахаразной активности в секретируемом комплексе рекомбинантного штамма.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение сахаразной активности, достаточной для снижения уровня сахарозы при гидролизе клубней топинамбура, что частично решает проблему эффективного выделения ФОС после ферментативного гидролиза инулина, при сохранении эндоинулиназной активности рекомбинантного штамма.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Культивирование рекомбинантного штамма Р. canescens Sopp INUA3 в 1-л ферментере на модифицированной ферментационной среде с целью получения сахаразной активности в секретируемом комплексе рекомбинантного штамма.

Культивирование штамма P. canescens Sopp INUA3 ВКМ F-4564D в лабораторном ферментере объемом 1 л, оснащенном системой автоматического регулирования pH, pO₂ и температуры, а также барботерами для подачи воздуха в аппарат и двухъярусной мешалкой. Получение инокулята в колбах для засева в ферментеры проводят на среде следующего состава, %: глюкоза - 2,0, KH₂PO₄ - 1,5, (NH₄)₂SO₄ - 0,5, дрожжевой экстракт - 1,0, CaCl₂ - 0,03, MgSO₄ × 7H₂O - 0,03. После суток культивирования при T=28±0,2°C и pH=6,2±0,2 инокулят переносят в ферментер и культивирование проводят на ферментационной среде следующего состава, масс. %: свекловичный жом - 3, пептон - 5, KH₂PO₄ - 2,5, пшеничные отруби - 1, вода - остальное. В качестве пеногасителя перед стерилизацией вносят 0,1% Лапрола. Ферментеры засевают 10% вегетативного посевного материала, выращенного в колбах. Температура культивирования - 28±0,2°C; pH в начале ферментации составляет 5,0-5,5, в течение ферментации поддерживается 4,5-5,0. На 3-и и 4-ые сутки культивирования рекомбинантного штамма P. canescens Sopp INUA3 проводят индукцию биосинтеза ферментов лактозой. Для этого 20 г лактозы растворяют в 100 мл стерильной воды и добавляют по 10 мл лактозы в ферментационную среду через 72 и 96 ч соответственно.

Через каждые 24 ч отбирают пробы культуральной жидкости и после удаления биомассы определяют активности целевых ферментов и концентрацию растворимого белка.

Ферментативные активности инулиназы, сахаразы и ксиланазы через 144 ч ферментации, а также концентрация растворимого белка в культуральной жидкости штамма P. canescens Sopp INUA3, выращенного на стандартной среде культивирования, включающей свекловичный жом - 3, пептон - 5, KH₂PO₄ - 2,5, вода - остальное, и модифицированной среде культивирования с добавками лактозы на 72 и 96 ч культивирования с финальной концентрацией 0,2% приведены в таблице 1.

Из культуральной жидкости штамма P. canescens Sopp INUA3, наработанного в соответствии с примером 1 на средах без добавок лактозы и с добавкой лактозы, получают концентрированные ферментные препараты (ФП) ЭНДИН и INUA-SAC, соответственно, методом лиофильного высушивания ультраконцентрата.

Пример 2. Определение качественного и количественного состава ФП и ЭНДИН и INUA-SAC.

Качественный и количественный состав ФП INUA-SAC определяли хроматографическим методом. Навеску ФП растворяли в 0,1 М Na-ацетатном буфере (pH 5,0), центрифугировали и обессоливали с заменой буфера при помощи гель-проникающей хроматографии на носителе Bio-Gel P-6 фирмы Bio-Rad (США) в 20 мМ буфере bis-Tris-HCl, pH 6,9. Подготовленный таким образом ФП фракционировали с помощью FPLC-системы фирмы «Pharmacia» (Швеция) на анионообменном носителе Source 15Q («Amersham Biosciences), (Швеция) объем колонки составил 1 мл. Образец наносили в стартовом буфере Bis-Tris/HCl при pH 6,9; связавшиеся белки элюировали в градиентой концентрации NaCl от 0 до 0,4М. В полученных в ходе элюирования фракциях, а также в несвязавшейся фракции, определяли инулиназную, ксиланазную и сахаразную активности, а также содержание белка. Ксиланазную активность определяли по начальной скорости образования BC при гидролизе березового ксилана, активность выражали в международных единицах (одна единица активности соответствует количеству фермента, гидролизующего 1 мкмоль гликозидных связей ксилана за 1 мин).

Инулиназную активность по отношению к инулину топинамбура и олигосахаридному субстрату - сахарозе определяли по начальным скоростям образования восстанавливающих сахаров (BC) модифицированным методом Шомоди-Нельсона.

Активность выражали в международных единицах на 1 мг белка (одна единица активности соответствует количеству фермента, гидролизующего 1 мкмоль гликозидных связей субстрата за 1 мин).

Аналогичным образом был определен состав контрольного ФП ЭНДИН.

Содержание целевых и других ферментов в ФП INUA-SAC и ЭНДИН приведено в табл. 2.

Таким образом, путем изменения ферментационной схемы культивирования рекомбинантного штамма P. canescens Sopp INUA3 (ВКМ F-4564D), продуцента гетерологичной эндонулиназы Aspergillus niger, удалось повысить уровень собственной секретируемой сахаразы, без изменения уровня содержания гетерологичной эндоинулиназы.

Пример 3. Применение ФП INUA-SAC и коммерческого препарата Oligofructase 3000 (Beldem/Puratos) при гидролизе клубней топинамбура.

Предварительно вымытые в проточной воде, измельченные на лабораторной мельнице клубни топинамбура подвергали гидролизу в естественных условиях pH среды (в воде) при 50°C, в течение 3 ч, при перемешивании 250 об/мин на орбитальной качалке. Концентрация клубней топинамбура составляет 100 г/л по сухому веществу. Дозировка ФП INUA-SAC и Oligoofructase 3000 - 10 ед/г сухого субстрата. Через 3 ч ферментативного гидролиза отбирают пробу объемом 0,5 мл и центрифурируют для осаждения непрогидролизованного субстрата. С помощью ВЭЖХ с амперометрической детекцией в супернатанте определяют качественный и количественный состав ФОС, содержащийся в клубнях топинамбура. В качестве неподвижной фазы используется сильный анионообменник (колонка типа Carbopak РА 100), подвижной фазы 100 мМ раствор NaOH, элюирование проводилось в градиенте от 0 до 500 мМ NaOAc в течение 20 мин. Результаты представлены на рисунке 1, где получаемые ФОС представлены инулоолигосахаридами со степенью полимеризации от 2 до 6. Из Рисунка 1 следует, что использование ФП INUA-SAC (в тех же условиях и в той же концентрации, что и ФП Oligofructase 3000) приводит к образованию существенно меньшего количества сахарозы при образовании сходного качества и количества ФОС.