ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ФЬЮЖН-КОНСТРУКЦИЯ ДЛЯ ОБЕСПЕЧЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ МУЛЬТИФЕРМЕНТНОГО КОМПЛЕКСА КАРБОГИДРАЗ В КЛЕТКАХ МИЦЕЛИАЛЬНОГО ГРИБА Penicillium verruculosum, ИСПОЛЬЗУЕМОГО В КАЧЕСТВЕ ХОЗЯИНА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ШТАММА ГРИБА Penicillium verruculosum И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА НА ЕГО ОСНОВЕ

Изобретение в области биотехнологии относится к микробиологической промышленности и представляет собой способ получения комплексных мультиферментных препаратов с целлобиогидролазной, эндоглюканазной, β-глюкозидазной (целлобиазной) активностями путем культивирования рекомбинантных штаммов мицелиальных грибов рода Penicillium verruculosum, трансформированных линейной фьюжн-конструкцией, представляющей собой последовательно состыкованные гомологичные и гетерологичный гены карбогидраз.

В последние годы процессы получения биоспиртов из возобновляемого целлюлозосодержащего сырья (ЦСС) предполагают использование гидролизатов исходных субстратов, содержащих сахара, с их последующей конверсией в целевой продукт.

Ферментативный гидролиз растительной биомассы во многом решает проблемы, существующие при использовании альтернативных методов получения простых сахаров (глюкозы, ксилозы), позволяя получать их в доступном для роста и утилизации микроорганизмов виде.

Ферментативный гидролиз ЦСС происходит под действием карбогидразного комплекса - совокупности ферментов различной специфичности, гидролизующих полисахаридные молекулы с получением олиго- и моносахаридов. Лучшими продуцентами целлюлозоразрушающих ферментов, на сегодняшний день, являются микроскопические грибы, преимущественно относящиеся к родам Trichoderma, Penicillium, а также Aspergillus. Это связано с их высокой способностью секретировать внеклеточные ферменты-карбогидразы. Глубокое осахаривание ЦСС с образованием простых сахаров, которые могут быть далее конвертированы в различные продукты микробиологического синтеза, эффективно осуществляется только при наличии сбалансированного состава различных ферментов в целлюлазном комплексе. Грибы рода Penicillium по сравнению с другими продуцентами секретируют целлюлазный ферментный комплекс достаточно сбалансированного состава, в который входят целлобиогидролазы, эндоглюканазы и β-глюкозидазы (целлобиазы). Гемицеллюлазы Penicillium представлены ксиланазами, маннаназами и другими. Данный состав ферментов карбогидразного комплекса Penicillium позволяет эффективно осуществлять гидролиз растительных полисахаридов, причем продуктами реакции оказываются, преимущественно, простые сахара.

Ранее было показано, что входящая в состав целлюлазного комплекса гриба Penicillium verruculosum целлобиогидролаза I обладает высокой удельной активностью, превосходящей аналогичную целлобиогидролазу Trichoderma более чем в полтора раза [Чекушина А.В., Доценко Г.С., Синицын А.П. Катализ в промышленности, №6, 2012, 68-75]. Также было показано, что в состав ферментов для эффективного гидролиза ЦСС должно входить 50-60% целлобиогидролазы I, около 30% эндоглюканаз и 10-15% β-глюкозидазы (целлобиазы) [А.В. Чекушина, Г.С. Доценко, Е.Г. Кондратьева, А.П. Синицын. Биотехнология, 2013, №3, стр.69-80]. Разработка новых рекомбинантных штаммов-продуцентов, секретирующих эти ферменты в заданных соотношениях в пределах одного рекомбинантного штамма, является актуальной научной и прикладной задачей, решение которой позволит элиминировать необходимость смешивания индивидуальных ферментных препаратов, что, в конечном счете, приведет к значимому экономическому эффекту при промышленном использовании ферментных препаратов для биоконверсиии ЦСС.

В последнее десятилетие получили широкое распространение мультикопийные грибные суперпродуценты ферментов, у которых амплификация генов, кодирующих секретируемые ферменты, позволила резко увеличить продуктивность штаммов микроорганизмов для получения дешевых промышленных ферментов. К известным мультикопийным продуцентам эндо-β1,4-глюканаз относятся штаммы на основе Trichoderma longibrachiatum [Clarkson et al, 1995, US Patent 5419778], T.reesei [Saloheimo et al., 1994, WO Patent 94/28117] и Humicola insolens [Rasmussen et al., 1991, Patent WO 91/17243]. Известны различные грибные мультикопийные продуценты ксиланаз - Aspergillus niger [van den Broek et al, 1994, US Patent 5358864], T.reesei [Nevalainen et al., 1994, US Patent 5298405], Thermoascus auranticus [Yu et al., 1990, US Patent 4966850], H.insolens [Schulein et al, 1997, US Patent 5610048].

Из грибов рода Penicillium большой интерес представляют Р.verruculosum.

Прототипом разработанного технического решения может служить патент РФ №2378372 «Генетическая конструкция для обеспечения экспрессии целевых гомологичных и гетерологичных генов в клетках мицелиального гриба Penicillium verruculosum, используемого в качестве хозяина, способ получения штамма гриба Penicillium verruculosum и способ получения ферментного препарата». Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения фермента, предпочтительно целлюлазы или ксиланазы, расщепляющих целлюлозу или ксиланы соответственно, путем культивирования штамма гриба Р.verruculosum. При этом указанный штамм получают трансформацией клетки гриба Р.verruculosum генетической конструкцией, содержащей одну целевую кодирующую последовательность фермента, функционально связанную с регуляторными элементами гена целлобиогидролазы I P.verruculosum, которые представляют собой промотор и терминатор гена целлобиогидролазы I, а сигнальный пептид при этом зависит от того, каков целевой фермент.

Техническая задача, решаемая группой разработанных технических решений, состоит в создании способа получения ферментных препаратов с заданным соотношением ферментов карбогидразного комплекса при ферментации рекомбинантных штаммов, полученных при трансформации реципиентного высокопродуктивного штамма P.verruculosum фьюжн-конструкцией, содержащей три различных гена (два гомологичных и один гетерологичный ген, кодирующие целлобиогидролазу I, эндо-1,4-β-глюканазу (эндоглюканазу) и β-глюкозидазу (целлобиазу), соответственно) в пределах одной кодирующей последовательности.

Технический результат, получаемый при реализации разработанных технических решений, состоит в получении промышленных ферментных препаратов (ФП) сбалансированного состава с высокой целлюлолитической активностью при культивировании новых мультикопийных штаммов грибов рода P.verruculosum, полученных с привлечением методов рекомбинантных ДНК и микробиологии.

Для получения указанного технического результата предложено использовать генетическую линейную фьюжн-конструкцию для обеспечения экспрессии целевых гомологичных и гетерологичного генов в клетках мицелиального гриба P.verruculosum, используемого в качестве хозяина, содержащую целевую кодирующую последовательность гена целлобиогидролазы I P.verruculosum, гена эндоглюканазы P.verruculosum и гена β-глюкозидазы (целлобиазы) A.niger, функционально связанную с регуляторными элементами гена целлобиогидролазы I P.verruculosum, которые представляют собой промотор и терминатор гена целлобиогидролазы I.

Для получения указанного технического результата предложено также использовать способ получения штамма гриба P.verruculosum - продуцента карбогидразного комплекса ферментов, кодирующихся нуклеотидной последовательностью фьюжн-конструкции, предусматривающей трансформацию клетки гриба P.verruculosum генетической фьюжн-констркуцией, содержащей целевую кодирующую последовательность, функционально связанную с регуляторными элементами гена целлобиогидролазы I P.verruculosum, которые представляют собой промотор и терминатор гена целлобиогидролазы I.

Кроме того, для получения указанного технического результата предложено использовать способ получения ферментных препаратов, включающих ферменты карбогидразного комплекса, расщепляющие растительные полисахариды, путем культивирования микроорганизмов, причем ранее указанным способом получают штамм гриба P.verruculosum, осуществляют культивирование полученного штамма и выделяют целевой продукт из культуральной жидкости гриба. При реализации указанного способа для получения комплексного ферментного препарата получают штамм P.verruculosum FUS3 (ВКМ F-4512 D), мультикопийный по гену cbhI - целлобиогидролазы I, гену eglII - эндоглюканазы II P.verruculosum и гену bglI-β - глюкозидазы (целлобиазы) A.niger.

Указанные варианты не исчерпывают возможности разработанного способа.

Схема разработки способа получения каждого из ферментных препаратов, обладающего комплексом карбогидразных активностей, складывается из трех типовых этапов.

Этап 1. Амплифицируют целевые гены ферментов карбогидразного комплекса - cbhI, кодирующий целлобиогидролазу I P.verruculosum, eglII, кодирующий эндо-1,4-β-глюканазу Р. Verruculosum, и bglI, кодирующий β-глюкозидазу (целлобиазу) A.niger, а также промоторную и терминаторную область гена cbhI P.verruculosum. Конструируют линейную фьюжн-конструкцию, представляющую собой полинуклеотидную последовательность, состоящую из промоторной области гена cbhI, гена bglI, гена eglII, гена cbhI и терминаторной области гена cbhI.

Этап 2. Проводят трансформацию реципиентного высокопродуктивного штамма P.verruculosum 537(niaD^-) фьюжн-конструкцией, полученной на Этапе 1, в условиях котрансформации вместе с линеаризованной плазмидой (или фрагментом ДНК в линейной форме), несущей последовательность niaD гена, как маркера селекции, и осуществляют отбор трансформантов, секретирующих в культуральную жидкость искомые ферменты карбогидразного комплекса. Проводят ферментацию отобранных трансформантов в качалочных колбах и среди них выбирают наиболее продуктивный вариант(ы) штамма(ов)-продуцента(ов) комплекса карбогидраз с искомым соотношением карбогидраз.

Этап 3. Проводят процесс ферментации отобранного наиболее активного варианта(ов) штамма-продуцента(ов) в ферментерах, получают и характеризуют ФП с высокой активностью искомых ферментов карбогидразного комплекса.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Конструирование фьюжн-конструкции состояло из амплификации генов bglI A.niger (GenBank AN:DQ220304), eglII P.verruculosum [РФ №2378372], промоторной области гена cbhI Pen.verruculosum [РФ №2378372], гена cbhI P.verruculosum, совместно с его терминаторной областью [РФ №2378372] и финальной амплификации линейного продукта, состоящего из состыкованных генов, соответствующих промоторной области гена cbhI, гена bglI, гена eglII и cbhI P.verruculosum, совместно с его терминаторной областью.

Для индивидуальной амплификации каждой из частей фьюжн-конструкции использовались следующие олигонуклеотиды:

Далее с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и праймеров (7 и 2) синтезируют отдельно промоторную область гена cbhI размером 1303 п.н. В качестве матрицы для ПЦР используют геномную ДНК штамма P.verruculosum, выделенную из мицелия. Нуклеотидную последовательность полученного фрагмента определяют методом Сэнгера по обеим цепям.

Далее с помощью ПЦР и праймеров (1 и 3) синтезируют отдельно ген bglI размером 2959 п.н., из которых 2935 п.н. составляет ген bglI и 24 п.н. относится к синтетическому линкерному участку, соединяющему ген bglI и ген eglII с 3`-конца гена bglI. В качестве матрицы для ПЦР используют геномную ДНК штамма A.niger, выделенную из мицелия. Нуклеотидную последовательность полученного фрагмента определяют методом Сэнгера по обеим цепям.

Далее с помощью ПЦР и праймеров (4 и 5) синтезируют отдельно ген eglII размером 1367 п.н., из которых 1319 п.н. составляет ген eglII, 24 п.н. относится к синтетическому линкерному участку, соединяющему ген bglI и ген eglII с 5`-конца гена eglII, и 24 п.н. относится к синтетическому линкерному участку, соединяющему ген eglII и ген cbhI с 3` -конца гена eglII. В качестве матрицы для ПЦР используют геномную ДНК штамма P.verruculosum, выделенную из мицелия. Нуклеотидную последовательность полученного фрагмента определяют методом Сэнгера по обеим цепям.

Далее с помощью ПЦР и праймеров (6 и 8) синтезируют ген cbhI и его терминаторную область размером 2172 п.н., из которых 1578 п.н. составляет ген cbhI, 570 п.н. относится к терминаторной области гена cbhI и 24 п.н. относится к синтетическому линкерному участку, соединяющему ген eglII и ген cbhI с 5`-конца гена cbhI. В качестве матрицы для ПЦР используют геномную ДНК штамма P.verruculosum, выделенную из мицелия. Нуклеотидную последовательность полученного фрагмента определяют методом Сэнгера по обеим цепям.

Полученные ПЦР-фрагменты смешивают в эквимолярном соотношении и используют в качестве матрицы для финальной ПЦР-реакции при помощи праймеров (7) и (8). Синтезированная линейная фьюжн-конструкция имеет размер 7753 п.н. Нуклеотидную последовательность полученного фрагмента определяют методом секвенирования по Сэнгеру по обеим цепям. Общая структура фьюжн-конструкции PVER-FUS представлена на фиг.1. Полинуклеотидная последовательность PVER-FUS представлена на фиг.2

Транслируемая аминокислотная последовательность состоит из трех ферментов карбогидразного комплекса - целлобиогидролазы I, эндоглюканазы II и β-глюкозидазы (целлобиазы). Первичные аминокислотные последовательности ферментов представлены на фиг.3.

Пример 2. Трансформация высокопродуктивного штамма-реципиента Pen.verruculosum 537(niaD^-) фьюжн-конструкцией, полученной в Примере 1, для получения набора рекомбинантных штаммов, обладающих карбогидразными активностями.

К смеси двух ДНК (1 мкг котрансформационной плазмиды PSTA10 (несущей ген niaD⁺ A.niger)), линеаризованной с помощью HindIII эндонуклеазы рестрикции и 3 мкг фьюжн-конструкции FUS объемом 20 мкл, добавляют 200 мкл раствора протопластов штамма P.verruculosum 537(niaD^-), полученных по методике, описанной в статье [A.Y. Aleksenko, N.А. Makarova, I.V. Nikolaev, A.J. Clutter buck Integrative and replicative transformation of Penicillium canescens with a heterologous nitrate-reductase gene, Curr. Genet. - 1995. - V.28. - P.474-477], и 50 мкл буфера РСТ1, содержащего 50%-ный ПЭГ 4000 (по объему) + 0.01М трис-HCl pH 7.5+0.02М CaCl₂. Смесь аккуратно перемешивают и оставляют на 20 мин во льду. Затем добавляют 500 мкл буфера РСТ1 и оставляют на 5 мин при комнатной температуре. Параллельно проводят эксперимент с контрольными протопластами без добавления ДНК. Далее пробирки со смесью протопластов и ДНК центрифугируют при 5000 об/мин в течение 20 мин. Супернатант сливают, а осадок ресуспендируют в 200 мкл стерильного раствора сорбитола (182,2 г/л). Трансформационную смесь стерильно переносят над пламенем горелки в 5 мл верхнего агара (для приготовления 100 мл верхнего агара берут 21,86 г 1,2 М сорбитола, 0,7 г агара, 0,8 г глюкозы, 1 мл 1М источника азота), перемешивают и распределяют агар по поверхности предварительно подготовленных чашек с нижним агаром (для приготовления 100 мл нижнего агара берут 21,86 г 1,2 М сорбитола, 2 г агара, 0,8 г глюкозы, 1 мл 1М источника азота). Так же переносят и контрольные смеси.

Готовят три чашки Петри с нижним агаром, две с селективной средой (источник азота: NaNO₃ 10 mM) и одна - с неселективной (источник азота: NH₄Cl 10 mM). Чашки Петри помещают в инкубатор на 30°C и оставляют там на 6 дней. На шестой день роста трансформанты переносят на селективную минимальную среду (источник азота: NaNO₃ 10 mM). В результате трансформации реципиентного штамма P.verruculosum 537 фьюжн-конструкцией получают 90 трансформантов на 3 мкг введенной целевой ДНК, что соответствует стандартной частоте трансформации грибных штаммов.

Для определения наличия встроенного экзогенного генетического материала в хромосому рекомбинантных штаммов проводят первичный скрининг трансформантов с использованием ПНР-реакции. Поскольку фьюжн-конструкция содержит гетерологичный ген β-глюкозидазы (целлобиазы), то скрининг гена bglI осуществляют с использованием пары праймеров (1) и (3). Полученный ПЦР-продукт, анализируемый методом электрофореза в агарозном геле, должен иметь размер ~3000 п.н., что соответствует размеру полинуклеотидной последовательности гена bglI из A.niger.

Пример 3. Получение ферментного препарата рекомбинантного штамма серии FUS P.verruculosum, мультикопийного по cbhI, eglII генам P.verruculosum (ген целлобиогидролазы I, 7-е семейство гликозидгидролаз, молекулярная масса 66 кДа и ген эндо-1,4-β-глюканазы II, 5-е семейство гликозидгидролаз, молекулярная масса 40 кДа, соответственно) и bglI гену β-глюкозидазы A.niger (3-е семейство гликозидгидролаз, молекулярная масса 120 кДа).

Полученные в Примере 2 позитивные по гену bglI трансформанты пересевают на чашки с минимальной средой и источником азота NaNO₃ и инкубируют при 30°C в течение 140 часов до образования конидий. Затем трансформанты ферментируют в качалочных колбах, используя водную ферментационную среду следующего состава, г/л: МКЦ - 40, пшеничные отруби - 10, дрожжевой экстракт - 10, (NH₄)₂SO₄ - 5, KH₂PO₄ - 5, MgSO₄×7H₂O - 0,3, CaCl₂×2H₂O - 0,3, pH 4,5. Колбы инкубируют на качалке при 32°C и 200 об/мин, в течение 144 ч. Далее отбирают трансформанты с увеличенной по сравнению с реципиентным штаммом P.verruculosum 537 целлобиогидролазной, эндоглюканазной и β-глюкозидазной (целлобиазной) активностью.

Для отобранных штаммов определяют в культуральной жидкости активности по следующим субстратам: МКЦ (микрокристаллическая целлюлоза, нерастворимый субстрат), КМЦ (Na-соль карбоксиметилцеллюлозы, растворимый субстрат), глюкуроноксилану березы, ПНФГ (п-нитрофенил-β-D-глюкопиранозид). Активность по отношению к МКЦ (авицелазная активность характеризует активность целлобиогидролаз) определяют при 40°C и рН=5,0 по начальной скорости образования восстанавливающих сахаров (ВС). Активность по отношению к КМЦ (характеризует активность эндоглюканаз) и к глюкуроноксилану березы (характеризует активность ксиланаз) определяют при 50°C и pH=5,0 по начальной скорости образования ВС. Концентрация полисахаридных субстратов в реакционной смеси составляла 5 г/л. Концентрацию ВС определяли методом Шомоди-Нельсона. [М. Somogui, 1945, JBC, №61, p. 160].

Активность по ПНФГ (характеризует активность β-глюкозидаз (целлобиаз)) определяют по начальной скорости образования п-нитрофенола (ПНФ). Раствор 0,05 М субстрата в 0,1 М, Na-ацетатном буфере, pH 5,0, инкубируют с ферментом при 40°C в течение 10 мин. Реакцию останавливают добавлением раствора 1М Na₂CO₃. Образовавшийся в растворе ПНФ определяли спектрофотометрически при длине волны 400 нм, используя коэффициент молярного поглощения (ε=18300 моль*см^-1).

Активность ферментов выражают в международных единицах: 1 единица соответствует образованию 1 мкмоль продукта за 1 мин при действии ферментов на соответствующий субстрат

Для культуральных жидкостей проводят ДДС-электрофорез в денатурирующих условиях для идентификации полос, соответствующих зонам, занимаемым целлобиогидролазой I (66 кДа), эндоглюканазой II (40 кДа) и β-глюкозидазой (140 кДа).

Проводят ферментацию наиболее продуктивного трансформанта P.verruculosum FUS3 (ВКМ F-4512D) в 10-литровом ферментере, используя питательную среду того же состава, что в качалочных колбах, и проводя подпитку глюкозой при pH 4,5 и 32°C в течение 144 час. После окончания ферментации с помощью ультрафильтрации культуральной жидкости на полых волокнах (с пределом отсечения 10 KDa) и последующего лиофильного высушивания получают сухой ФП и характеризуют их по уровню карбогидразных активностей (см. таблицу 1).

Карбогидразные активности отобранного наиболее активного трансформанта P.verruculosum FUS3 (ВКМ F-4512D) в культуральной жидкости составляют: 18 ед./мл целлобиогидролазной активности, 60 ед./мл ксиланазной активности, 850 ед./мл КМЦ-азной активности, 210 ед./мл β-глюкозидазной активности.

Пример 4. Определение количественного состава ферментного препарата FUS3.

Качественный и количественный состав ФП определяют хроматографическим методом. Навеску ФП растворяют в 0,1 М Na-ацетатном буфере (pH 5,0), центрифугируют и обессоливают с заменой буфера при помощи гель-проникающей хроматографии на носителе Bio-Gel Р-6 фирмы Bio-Rad (США) в 20 мМ буфере bis-Tris-HCl, pH 6,9. Подготовленный таким образом ФП фракционируют с помощью FPLC-системы фирмы «Pharmacia» (Швеция) на анионообменном носителе Source 15Q («Amersham Biosciences», Швеция), объем колонки составляет 1 мл. Образец наносят в стартовом буфере Bis-Tris/HCl при pH 6,9; связавшиеся белки элюируют в градиентой концентрации Nad от 0 до 0,4М. В полученных в ходе элюирования фракциях, а также в несвязавшейся фракции определяют авицелазную, КМЦ-азную, ксиланазную и β-глюкозидазную (целлобиазную) активности, а также содержание белка.

Содержание целевых ферментов в ФП FUS3, полученном с помощью трансформанта P.verruculosum FUS3, и контрольном ФП 537, полученном с помощью исходного штамма P.verruculosum 537, приведено в таблице 2.

В ФП FUS3 представлены три мажорных компонента: это рекомбинантные белки - ЦБГI (45%), ЭГ II (32%) и β-глюкозидаза (целлобиаза) A.niger 116 кДа (12%), обнаружено также наличие в незначительных количествах других ферментов.

Контрольный ФП 537 имел в своем составе 68% различных целлобиогидролаз (ЦБГI 38%, ЦБГII - 30%,), 16% различных эндоглюканаз, 4% собственной (гомологичной) β-глюкозидазы (целлобиазы).

Таким образом, путем трансформации реципиентного высокопродуктивного штамма P.verruculosum фьюжн-конструкцией с гомологичными и гетерологичным генами, кодирующими целлобиогидролазу I, эндо-1,4-β-глюканазу (эндоглюканазу) и β-глюкозидазу (целлобиазу), удалось создать штамм P.verruculosum FUS3 (ВКМ F-4512D) - продуцент целлюлазного комплекса с заданым и близким к оптимальному соотношением ферментов целлюлазного комплекса для получения простых сахаров из ЦСС.