Результат интеллектуальной деятельности: Штамм Rhodococcus erythropolis HO-KS22, обладающий высокой уреазной активностью, способный к генерации в нефтяном пласте нефтевытесняющего агента биоПАВ

Изобретение относится к нефтедобывающей промышленности, и может быть использовано в методах повышения нефтеизвлечения с использованием бактериальных штаммов. Известно, что объем добытой нефти зависит от коэффициента нефтевытеснения и степени охвата нефтеносного пласта применяемыми методами добычи. При использовании вторичного заводнения на нефтевытеснение влияет ряд факторов. Это ионно-молекулярные поверхностные силы на границах фаз в системе нефть-вода-порода, различия в плотности и вязкости нефти закачиваемой воды и нефти и анизотропия по проницаемости нефтесодержащей породы.

Штамм Rhodococcus erythropolis HO-KS22 обладает свойствами, позволяющими влиять на указанные параметры и использовать его в микробных технологиях нефтеизвлечения.

1. Штамм R. erythropolis HO-KS22 способен расти на углеводородах нефти, что не требует использования дополнительных источников углерода при его закачке в нефтеносный пласт. При росте на углеводородах штамм R. erythropolis HO-KS22 выделяет биосуфактанты, снижающие величину молекулярных сил на границах фаз в системе вода-нефть-порода.

2. Для повышения нефтеотдачи недостаточно обеспечить низкое межфазное натяжение на границе нефть-водная фаза. Вытеснение водой нефти затруднено вследствие структурирования адсорбционных слоев на межфазных границах в системе нефть-порода-пластовая вода. Гелеобразная структура этих слоев характеризуется большой вязкостью, что создает структурно-механический барьер, который обусловливает кинетическую устойчивость дисперсной системы и препятствует протеканию термодинамически выгодных процессов. В системе нефть-вода-порода главная роль в структурировании (упрочнении) межфазных слоев принадлежит водородным связям. Повышение рН водной фазы разрушает водородные связи и ослабляет гидрофобные взаимодействия между компонентами нефти, составляющими эти слои. Деструктурирование межфазных слоев при повышении рН обусловлено разнообразными химическими реакциями с участием гидроксил-иона: нейтрализацией кислотных групп (карбоксильных, фенольных и тиольных); омылением сложноэфирных связей; депротонированием донорных гетероатомов (азота, серы); ассоциацией гидроксил-иона с ароматическими фрагментами молекул нефтяных компонентов, влиянием на структуру воды и тем самым на гидрофобное связывание и т.п. В результате таких взаимодействий с гидроксил-ионами снижается межфазное натяжение на границе нефть-вода, уменьшается вязкость межфазных слоев и увеличивается смачиваемость водой породы-коллектора и нефтяной фазы.

Штамм R. erythropolis HO-KS22 обладает высокой уреазной активностью и способен при росте на мочевине в качестве источника азота и углеводородах в качестве источника углерода подщелачивать среду до величины рН 9,4.

CO(NH₂)₂+2Н₂O=2NH₄⁺+СO₃^2-

3. При подщелачивании среды степень гидролизации гидрокарбонат-иона до карбонат-иона возрастает, что приводит к осаждению ионов кальция из пластовой воды

СO₃^2-+Са²⁺=СаСO₃↓

Выпадение кальцита приводит к снижению проницаемости промытых зон пласта, и в целом изменяется область охвата нефтеносного пласта применяемым воздействием. В конечном итоге это приводит к дополнительному вытеснению нефти из ранее непромытых областей нефтесодержащего матрикса.

Техническим результатом использования штамма Rhodococcus erythropolis HO-KS22 является улучшение извлечения нефти за счет образования биоПАВ непосредственно в зоне контакта с нефтью, что приводит к значительному снижению межфазного натяжения и уменьшению влияния капиллярных сил, удерживающих нефть в микропорах нефтесодержащей породы. Разложение мочевины приводит к осаждению карбонатов в промытых зонах пласта, изменению направления гидродинамических потоков и увеличению охвата залежи заводнением. В результате воздействия биоПАВ и увеличения рН пластовой воды повышается подвижность нефти и увеличивается степень ее извлечения из пласта.

Штамм R. erythropolis HO-KS22, выделен из нагнетаемой воды Восточно-Анзирского нефтяного месторождения (Набережные Челны, РФ). Штамм депонирован во Всероссийскую коллекцию микроорганизмов (ВКМ Ac-2807D)

Характеристика штамма Rhodococcus erythropolis HO-KS22.

Штамм представлен грамположительными палочками в молодой культуре, переходящими в кокко-палочки в старой культуре. На агаризованной среде РСА (бакто-триптон - 5,0 г/л, дрожжевой экстракт - 2,5 г/л, глюкоза - 1,0 г/л, NaCl - 10,0 г/л, агар микробиологический - 18,0 г/л) образует глянцевые слизистые круглые колонии светло-розового цвета диаметром 2-4 мм. Штамм растет аэробно в среде с содержанием NaCl от 0 до 120 г/л (оптимальное значение 70 г/л), в интервале рН от 5.5 до 9.5 (оптимум рН 7.0-7.5), при температуре от 5 до 37°С (оптимум 28°С).

Штамм HO-KS22 был идентифицирован методом анализа гена 16S рРНК как представитель вида Rhodococcus erythropolis (сходство гена 16S рРНК с геном штамма R. erythropolis DSM 43066 составляло 99.8%).

Штамм использует в качестве единственного источника углерода сахара (глюкозу, сахарозу), спирты (этанол, глицерин), натриевую соль уксусной кислоты, а также пептон, индивидуальные углеводороды и сырую нефть. Рост на н-алканах нефти сопровождается образованием поверхностно-активных веществ (биоПАВ, биосурфактантов), которые снижают межфазное натяжение на границе водной и углеводородной фазы до 0,2-1,0 мН/м. Штамм хранится на скошенном РСА агаре и в лиофилизированном состоянии при температуре +4°С.

Для получения биомассы клеток штамм наращивают в жидкой питательной среде следующего состава, г/л: K₂НРO₄- 1,5, KН₂РO₄ - 0,75, NH₄Cl - 1,0, СаCl₂⋅2Н₂O - 0,02, MgSO₄⋅7H₂O - 0,2, KCl - 0,1, NaCl - 50,0, микроэлементы - 1 мл/л, вода водопроводная, рН 7,0-7,2. В качестве единственного источника углерода используют углеводороды нефти или растворимые субстраты, позволяющие легче отделять микробную биомассу. Культивируют при температуре 28°С в аэробных условиях до достижения в культуральной жидкости титра бактерий не менее 10⁹ КОЕ/мл.

Указанные выше свойства углеводородокисляющего штамма R. erythropolis НО-KS22 предполагается использовать при его закачке и активации непосредственно в нефтяном пласте. При этом в качестве органического субстрата будет использоваться остаточная нефть в призабойной зоне нагнетательной скважины, а в качестве источника азота будет использоваться мочевина.

Свойства штамма R. erythropolis HO-KS22, способствующие изменению поверхностного и межфазного натяжения среды и образованию продуктов, полезных для повышения нефтеизвлечения, иллюстрируют следующие примеры.

Пример 1. Исследование образования биоПАВ штаммом R. erythropolis HO-KS22 при культивировании в среде с сырой нефтью в качестве единственного источника углерода.

Для оценки образования биоПАВ бактериями определяют величину поверхностного натяжения культуральной жидкости на границе с воздухом (ПН) и межфазное натяжение на границе с гексадеканом (МН), которые измеряют полустатическим методом отрыва кольца на полуавтоматическом тензиометре Surface Tensiomat 21 (Cole-Parmer, США), снабженном платино-иридиевым кольцом.

Штамм R. erythropolis HO-KS22 выращивают на среде следующего состава, г/л: K₂НРO₄ - 1,5, KН₂РO₄ - 0,75, NH₄Cl - 1,0, СаCl₂⋅2Н₂O - 0,02, MgSO₄⋅7H₂O - 0,2, KCl - 0,1, NaCl - 10,0, микроэлементы - 1 мл/л, дрожжевой экстракт - 0.2, стерильная нефть (Черноозерское месторождение, Татарстан, РФ) - 1% (об./об.), рН 7,0-7,2.

После охлаждения стерильной минеральной среды до комнатной температуры в колбы стерильно вносят культуру R. erythropolis HO-KS22 с конечным титром около 10⁷ КОЕ/мл среды, закрывают ватной пробкой и помещают на качалку (110 об/мин). Инкубирование проводят при температуре 30°С. Для контроля на качалку ставят колбу со средой и нефтью без внесения в нее бактериального штамма. Через 7 суток инкубирования колбу снимают с качалки и в культуральной среде, содержащей биомассу и эмульгированную нефть, измеряют поверхностное натяжение культуральной жидкости на границе с воздухом и межфазное натяжение на границе с гексадеканом. Дополнительно проводят центрифугирование культуральной жидкости и отделяют супернатант от биомассы и остаточной нефти. В супернатанте проводят аналогичные измерения.

Результаты исследований, приведенные в таблице 1, показывают, что среда, содержащая биомассу и эмульгированную нефть, после 7 суток культивирования характеризовалась низкими значениями поверхностного и межфазного натяжения. Показано, что супернатант, отделенный от клеток, также снижает поверхностное и межфазное натяжение.

Пример 2. Штамм R. erythropolis HO-KS22 выращивают на среде следующего состава, г/л: K₂НРO₄ - 1,5, KН₂РO₄ - 0,75, CH₄N₂O - 20,0, СаCl₂⋅2Н₂O - 0,02, MgSO₄⋅7H₂O - 0,2, KCl - 0,1, NaCl - 10,0, микроэлементы - 1 мл/л. После охлаждения стерильной минеральной среды до комнатной температуры в колбы стерильно вносят культуру R. erythropolis HO-KS22 с конечным титром около 10⁸ КОЕ/мл среды. Затем в колбу добавляют 1% (об./об.) сырой стерильной нефти (Черноозерское месторождение, Татарстан, РФ), закрывают ватной пробкой и помещают на качалку (ПО об/мин). Инкубируют при температуре 28°С. Для контроля на качалку ставят колбу со средой, не содержащей мочевину, нефть и бактериальный штамм. Через 7 суток инкубирования колбу снимают с качалки и в культуральной жидкости, содержащей биомассу и эмульгированную нефть, измеряют рН, содержание иона аммония и щелочность.

После культивирования биомассу отделяют от культуральной жидкости центрифугированием, и в супернатант вносят 5 мл 0,5 М раствора CaCl₂×2H₂O. После отстаивания образовавшийся осадок отфильтровывают и взвешивают.

Результаты, представленные в таблице 2, показывают, что в течение короткого времени рост штамма R. erythropolis HO-KS22 за счет окисления нефти в присутствии мочевины приводит к значительному увеличению рН и щелочности среды. При добавлении к среде ионов кальция образуется осадок карбоната кальция.