Способ получения низкомолекулярного хитозана и олигомеров хитозана

Изобретение относится к области химии биополимеров, а именно к способу получения низкомолекулярного хитозана и олигомеров хитозана. Полученные продукты могут быть использованы в медицине, а именно в хирургической стоматологии при лечении переломов, дистракционном остеогенезе, лечении остеомиелита; в области тканевой инженерии, при регенерации хрящевой ткани, стимуляции роста фибробластов; в качестве детоксицирующего сорбента, при воспалительных заболеваниях желудочно-кишечного тракта; в качестве системы доставки лекарств, генов.

В качестве прототипа выбран патент, который включает гидролиз гранул хитозана в присутствии соляной кислоты. Гидролиз осуществляется без растворения хитозана, при перемешивании гетерогенной системы. После гидролиза разделение и очистку проводят в органическом растворителе, получают деполимеризованный хитозан как в форме гидрохлорида, так и со свободной аминогруппой [patent JP 4759151 В2 «The preparation of low molecular weight chitosan due to non-uniform system», 16.02.2011].

Недостатком данного способа является получение продукта только высокомолекулярных масс 360-144 кДа, получают одну фракцию, не указывая индекс полидисперсности.

Задачей заявленного изобретения является создание способа получения низкомолекулярного хитозана и олигомеров хитозана методом химической деполимеризации.

Технический результат заключается в эффективном методе получения продуктов гидролиза, содержащих в себе низкомолекулярный хитозан и олигомеры за счет использования гидролиза азотной кислотой.

Хитозан является продуктом переработки хитина - одного из самых распространенных биополимеров в природе. За счет своих уникальных свойств: биоразлагаемости, низкой токсичности, биосовместимости, и проявляемых биологических активностей он находит широкое применение в различных областях науки [Dutta Р.K. et al. Chitin and chitosan: Properties and applications. Journal of Scientific & Industrial Research, 2004, v. 63, p. 20-31]. Для применения хитозана в медицине и ветеринарии требуется увеличить его растворимость при нейтральных значениях рН, этому способствует снижение его молекулярной массы. Деполимеризация хитозана чаще проводится ферментативным или химическим способом.

Ферментативный гидролиз расщепляет О-гликозидные связи между соседними звеньями, что позволяет сохранить основную структуру и степень дезацетилирования. При этом в основном используются ферментные комплексы с хитинолитической активностью микробиологического происхождения [Хасанова Л.М. и др. Деполимеризация хитозана с использованием ферментного комплекса, продуцируемого Myceliophthora sp. Прикладная биохимия и микробиология, 2014, т. 50, №4, с. 1-7, патент RU 2425844 С2 «Способ получения низкомолекулярного хитозана в бессолевой среде путем ферментативной деполимеризации», 17.08.2009], ферментные комплексы гепатопанкреаса краба и криля [Быкова В.М, Немцев С.В. Сырьевые источники и способы получения хитина и хитозана. В кн.: Хитин и хитозан: получение, свойства и применение. Под ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова. Москва: Наука, 2002. С. 7-23]. Также могут использоваться гидролазы, не обладающие специфической активностью в отношении хитозана, например липазы, протеазы, карбогидразы, целлюлазы, амилазы, пектиназы. Однако зачастую использование высокоочищенных ферментов является экономически нецелесообразным за счет их высокой стоимости. Ферментативный метод имеет еще ряд недостатков: высокая полидисперсность получаемых фракций, присутствие белковых примесей, а также компонентов питательной среды, ферментных препаратов и, как следствие, сложная система очистки продуктов гидролиза.

Для деполимеризации хитозана также используют химический метод, например под действием окислительно-восстановительного разрушения, один из подходов использует в качестве главного реагента перекись водорода. Данная реакция характеризуется высокой скоростью реакции и, как правило, приводит к высокому содержанию мономеров (40-50%). Однако конечный продукт темнеет, что свидетельствует о деструкции и модификации сахарных остатков [Немцев С.В. и др. Получение низкомолекулярного водорастворимого хитозана. Биотехнология 2001, №6, С. 37-42, Tian F. et al. Study of the depolymerization behavior of chitosan by hydrogen peroxide. Carbohydrate Polymers, 2004, v. 57, p. 31-37]. Также в качестве реагента окислительно-восстановительного разрушения может использоваться азотистая кислота, этот подход является селективным и легко контролируемым, так как азотистые группы кислоты селективно атакуют аминогруппы, а не ацетильные остатки и разрушают β-гликозидные связи хитозана. Недостатком же данного подхода является побочный процесс дезаминирования, приводящий к появлению 2,5-ангидро-D-маннозы на редуцирующем конце полимера, что обуславливает изменение первичной структуры хитозана, которая приводит к неконтролируемому изменению биологической активности [Tømmeraas K. et al. Preparation and characterisation of oligosaccharides produced by nitrous acid depolymerisation of chitosans. Carbohydrate Research, 2001, v. 333, №2, p. 137-144].

Для деполимеризации хитозана также используют химический способ, происходящий под действием различных кислот, при этом расщепляются как гликозидные связи, так и амидные, то есть происходят процессы дезацетилирования, деполимеризации. При кислотном гидролизе низкомолекулярный хитозан получают под действием неорганических кислот, например 0.1 М соляной, при 83°С, продолжительности реакции от 10 до 30 ч, при концентрации хитозана 10 мг/мл, получаемая степень полимеризации от 41.5 до 12.9; также 12 М соляной при 30°С, продолжительности реакции 60-240 мин, получаемая степень полимеризации от 20.8 до 7.81 [Varum K.М. et al. Acid hydrolysis of chitosans. Carbohydrate Polymers, 2001, v 46, p. 89-98]. Данным методом получают узкий диапазон молекулярных масс (ММ) от 1.5 кДа до 7 кДа. Также используют фосфорную кислоту 85%, при различных температурах и времени реакции (8 часов - 35 дней), получая при этом продукт с выходом от 68 до 40%, и диапазоном ММ от 21 до 7 кДа. Недостатком данного подхода является длительность процесса, достигающая 35 дней [Jia Zh., Shen D. Effect of reaction temperature and reaction time on the preparation of low-molecular-weight chitosan using phosphoric acid. Carbohydrate Polymers, 2002, v. 49, №4, p. 393-396].

Известно, что деполимеризация происходит также при воздействии на хитозан органическими кислотами: винной, пировиноградной, аскорбиновой, лимонной, молочной, пропионовой, уксусной и их смесями. Реакции проводились в автоклаве при температурах от 100 до 150°С, ММ исходного хитозана 310-375 кДа, в результате гидролиза вязкость растворов хитозана изменялась от 2 до 80 сП [patent KR 1019990084226 «Process for producing chitosan oligosaccharide», 01.05.1998]. Недостатком можно считать большую гетерогенность и сложность выделения и обработки получаемых продуктов.

Задача, решаемая настоящим изобретением, заключается в получении низкомолекулярного хитозана и олигомеров хитозана.

Способ осуществляется следующим образом.

Хитозан в количестве 10 г с ММ 300-1000 кДа и степенью дезацетилирования (СД) 75-95% суспендируют в 200 мл разбавленной азотной кислоты (2.5-12.5%). Полученную суспензию при перемешивании нагревают до 70°С и проводят гидролиз в течение 8 часов. Реакцию останавливают охлаждением до 0°С. Выпавший осадок отделяют фильтрованием на пористом стеклянном фильтре, а также собирают прошедший через фильтр маточный раствор. Осадок представляет собой низкомолекулярный хитозан со среднечисловой ММ (M_n) 10-70 кДа, индексом полидисперсности (ИП) 1.7-2.3 и СД 92-98%. Из маточного раствора после добавления изопропилового спирта и охлаждения до минус 18°С с помощью фильтрации на пористом стеклянном фильтре выделяют выпавшие в осадок олигомеры хитозана со M_n 0.5-1.0 кДа, ИП 1.2-1.4 и СД 98-99%, что соответствует набору олигомеров со степенью полимеризации от 3 до 7.

Пример 1. К 10 г хитозана с ММ 1000 кДа и СД 85% добавляют при комнатной температуре 200 мл разбавленной 10% азотной кислоты. Полученную суспензию при перемешивании нагревают до 70°С и проводят гидролиз в течение 8 часов. Реакцию останавливают охлаждением до 0°С. Выпавший осадок отделяют фильтрованием на пористом стеклянном фильтре, а также собирают прошедший через фильтр маточный раствор. К маточному раствору добавляют 150 мл изопропилового спирта и оставляют при минус 18°С на 16 часов, а осадок промывают 100 мл изопропилового спирта для удаления остатков азотной кислоты и высушивают на воздухе. Полученный низкомолекулярный хитозан перерастворяют в 100 мл дистиллированной воды, фильтруют на пористом стеклянном фильтре и лиофильно высушивают.

Получают 6,2 г хитозана с ММ 27 кДа, ИП 1.8 и СД 95%.

Выпавший в охлажденном маточном растворе осадок отфильтровывают на пористом стеклянном фильтре, промывают 50 мл изопропилового спирта, охлажденного до минус 18°С, и высушивают на воздухе. Затем осадок перерастворяют в 40 мл дист. воды и лиофильно высушивают. Получают 1.2 г олигомеров хитозана с ММ 0.7 кДа, ИП 1.36 и СД 99%.

Пример 2. Аналогично примеру 1, но в реакцию берут хитозан с ММ 700 кДа, СД 75% и добавляют 200 мл разбавленной 12,5% азотной кислоты. Получают 5,9 г низкомолекулярного хитозана с ММ 14 кДа, ИП 1.75 и СД 96%, а также 1.3 г олигомеров хитозана с ММ 0.6 кДа, ИП 1.22 и СД 99%.

Пример 3. Аналогично примеру 1, но в реакцию берут хитозан с ММ 700 кДа, СД 75% и добавляют 200 мл 2,5% разбавленной азотной кислоты. Получают 6.6 г низкомолекулярного хитозана с ММ 70 кДа, ИП 2.3 и СД 92%, а также 0.9 г олигомеров хитозана с ММ 1.0 кДа, ИП 1.40 и СД 98%.

Пример 4. Аналогично примеру 1, но в реакцию берут хитозан с ММ 300 кДа, СД 95% и добавляют 200 мл 12,5% разбавленной азотной кислоты. Получают 5.1 г низкомолекулярного хитозана с ММ 10 кДа, ИП 1.7 и СД 98%, а также 1.4 г олигомеров хитозана с ММ 0.5 кДа, ИП 1.20 и СД 99%.

Пример 5. Аналогично примеру 1, но в реакцию берут хитозан с ММ 500 кДа, СД 80% и добавляют 200 мл 10% разбавленной азотной кислоты. Получают 6.3 г низкомолекулярного хитозана с ММ 46 кДа, ИП 1.9 и СД 94%, а также 1.1 г олигомеров хитозана с ММ 0.7 кДа, ИП 1.36 и СД 98%.