Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВЕЛИЧИНЫ АДСОРБЦИИ ВИНПОЦЕТИНА ЛИПОСОМАМИ

Изобретение относится к области исследования и анализа веществ и может быть использовано для определения концентрации исследуемого вещества при разработке новых сложных лекарственных форм фармацевтических препаратов с использованием спектрофотометрического метода.

Известен способ, который заключается в дезинтеграции липосомальных везикул нагреванием до температуры 90-100°С [Gardner S.C. "Delipidation treatment for large-scale protein purification processing" Thesis for MS in Chem. Engineering, Virginia Polytechnic Inst., 1996].

Недостатком этого способа является относительно низкая точность, поскольку возникает обратная интеграция везикул при остывании смеси. В результате липосомальные везикулы и мицеллы формируются заново и часть препарата попадает обратно в липосомы, поэтому в водном растворе можно измерить лишь оставшуюся часть реальной концентрации препарата.

Заслуживает внимания способ осаждения липосом, нагруженных препаратом с помощью протамина сульфата, с последующим спектрофотометрическим определением неинкапсулированного вещества в полученном супернатанте [V.Torchilin and V. Weissig, "Liposomes 2nd eds., A Practical Approach" ed. Oxford Univercity Press, 2003, 384 pp].

Однако метод имеет существенные ограничения, связанные с возможностью соосаждения определяемого вещества.

Наиболее близким по своей сущности к предлагаемому является способ определения концентрации липосомально инкапсулированных фармацевтических препаратов цитостатиков гидрофильной природы, включающий разрушение липосомальных везикул и последующее измерение концентрации вышедшего в раствор цитостатика [Патент на изобретение №2337358 РФ/ Некоммерческое организация Учреждение «Прогрессивные медицинские исследования». - №2007112306; заявлено 03.04.07; опубл. 27.10.2009; Бюл. №30. - 10 с]. Данный способ отличается тем, что липосомальные везикулы разрушают добавлением к липосомальной суспензии, разбавленной 2 М раствором хлорида натрия в соотношении 1:1, 3-кратного объема хлороформа, после чего пробы нагревают до 50-60°С, центрифугируют при 5000 g в течение 5 мин, концентрацию вышедшего в водную фазу цитостатика определяют спектрофотометрически.

Недостатком способа является образование различных мицеллярных форм определяемого препарата, что приводит к серьезным погрешностям в измерениях и вызывает трудности в интерпретации получаемых результатов.

Технический результат заключается в разработке неразрушающего способа, количественного определения винпоцетина на поверхности липосом, полученных из соевого лецитина.

Технический результат достигается тем, что в способе определения величины адсорбции винпоцетина липосомами, включающем количественное определение винпоцетина методом спектрофотометрии, согласно изобретению, проводится диализ при температуре 37°С в течение 12 ч в диализаторе с 12 мл коллоидного раствора липосом с массовой долей липосом 0,1342±0,02881% из соевого лецитина или с 12 мл водного раствора кислоты хлористоводородной 0,01 М; куда помещается диализная пробирка, заполненная 3 мл водного раствора кислоты хлористоводородной 0,01 М, содержащего винпоцетин в концентрации 0,24 мг/мл, для проведения диализа используется мембрана, характеристика пропускания которой 14 кДа; после достижения равнения концентрация винпоцетина измеряется в диализной пробирке, погруженной в диализатор с раствором липосом и диализатор, заполненный раствором кислоты хлористоводородной 0,01 М; определение величины адсорбции винпоцетина липосомами осуществляется по разности концентраций винпоцетина, вышедшего в диализную среду диализатора с водным раствором кислоты хлористоводородной 0,01 М и диализатора с раствором липосом.

Для изучения характеристик адсорбции винпоцетина на поверхности липосом был использован метод равновесного диализа. Выбор данного метода обусловлен тем, что количественный анализ равновесной концентрации винпоцетина в дисперсионной среде, необходимый для определения величины адсорбции, затруднен присутствием дисперсной фазы - липосом. Полупроницаемая мембрана, с диаметром пор, достаточным для проникновения молекул винпоцетина, но не пропускающая липосомы, позволяет получить раствор винпоцетина с концентрацией, достаточно близкой к концентрации в дисперсионной среде липосом. Получаемый таким образом раствор может быть подвергнут количественному анализу с использованием спектрофотометрии.

Липосомы из соевого лецитина получали методом гидратации/регидратации.

Пример.

Приготовление образцов липосом из соевого лецитина

Для получения липосом из соевого лецитина был использован метод гидратации/регидратации. Раствор соевого лецитина (Sigma) в этиловом спирте испаряли в роторном испарителе при температуре 45°С и давлении -0,085 МПа. Затем добавляли раствор кислоты хлористоводородной 0,01 М (рН=2,0). Для получения липосом растворы были подвержены облучению на ультразвуковом дезинтеграторе в течение 15 минут. Далее липосомы были отфильтрованы через стеклянный фильтр с диаметром пор 16 мкм.

Приготовление рабочего стандартного образца (РСО) винпоцетина

Точную навеску винпоцетина 12 мг растворяли в водном растворе кислоты хлористоводородной 0,01 М в мерной колбе объемом 50,00 мл и доводили растворителем до метки.

Определение массовой доли коллоидного раствора липосом

В сушильном шкафу при температуре 80°С высушивали чашку Петри и производили ее взвешивание на аналитических весах Radwag 220/С/2 с точностью до 4-го знака после десятичной запятой в граммах. В чашку Петри помещали коллоидный раствор липосом и взвешивали. Далее чашку Петри с раствором липосом помещали в сушильный шкаф при температуре 80°С и высушивали ее содержимое до постоянной массы. Массовую долю коллоидного раствора липосом определяли по формуле:

где

m_пуст. - масса пустой чашки Петри, г;

m_жидк. - масса чашки Петри с коллоидным раствором, г;

m_сух. - масса чашки Петри с сухим остатком коллоидного раствора, г.

Для проведения равновесного диализа использовались диализные пробирки Easy Dial-L с полупроницаемой мембраной с характеристикой пропускания 14 кДа. Для определения величины адсорбции винпоцетина липосомами проводился основной опыт (диализатор А), в котором наблюдалась адсорбция в процессе диализа, опыт сравнения (диализатор Б), в котором происходил диализ, но отсутствовали липосомы и опыт для измерения содержания свободного лецитина в дисперсионной среде (диализатор В). В диализатор А помещали 12 мл раствора липосом и диализную пробирку. В диализную пробирку помещали 3 мл раствора винпоцетина с концентрацией С₀. В диализатор Б помещали 12 мл 0,01 М раствора кислоты хлористоводородной 0,01 М и диализную пробирку. В диализную пробирку помещали 3 мл раствора винпоцетина с концентрацией С₀. В диализатор В помещали 12 мл раствора липосом и диализную пробирку. В диализную пробирку помещали 3 мл раствора кислоты хлористоводородной 0,01 М. Диализ проводили в термостате при температуре 37°С в течение 12 ч. После этого измеряли оптическую плотность при длине волны 313 нм растворов из диализных пробирок в диализаторах А, Б и В (D_А, D_Б и D_В соответственно). Для определения концентрации винпоцетина в диализной пробирке А использовалась разница оптических плотностей D=D_А-D_В.

Расчет молярной концентрации винпоцетина по результатам спектрофотометрии производился по формуле:

где

- коэффициент молярного поглощения винпоцетина, М^-1 см^-1;

D - оптическая плотность;

1 - толщина кюветы, см.

С использованием приведенной формулы определялась концентрация винпоцетина в диализной пробирке А (основной опыт) и Б (опыт сравнения). Для данных концентраций были введены обозначения С_А и С_Б соответственно.

Величина адсорбции винпоцетина определялась по формуле:

где

А - величина адсорбции винпоцетина липосомами, моль/кг;

С_А и С_Б - равновесные концентрации винпоцетина в диализных пробирках для основного опыта и опыта сравнения, моль/л;

V - суммарный объем жидкости в диализаторе, мл;

m - масса липосом в диализаторе, кг.

Массу липосом в диализаторе определяли с учетом их массовой доли в коллоидном растворе и объема данного раствора по формуле:

где

ω_% - массовая доля коллоидного раствора липосом, %

V_лип. - объем раствора липосом, помещенный в диализатор, мл;

m - масса липосом, кг.

Для определения характеристик адсорбции винпоцетина на липосомах была приготовлена серия растворов винпоцетина с различными концентрациями и проводился диализ по приведенной выше методике.

На фиг. 1 приведены равновесные концентраций винпоцетина в диализаторах А и Б, которые рассчитывались с использованием коэффициента молярного поглощения.

На фиг. 2 приведены результаты расчета величины адсорбции винпоцетина на липосомах.

На фиг. 3, 4 - изображена зависимость величины адсорбции винпоцетина на липосомах от равновесной концентрации.

На фиг 5. приведены результаты определения характеристик адсорбции винпоцетина на липосомах.

При повышении концентрации винпоцетина величина адсорбции возрастает и достигает максимума в районе 0,030-0,035 моль/кг.

По величинам адсорбции винпоцетина на липосомах были определены константы уравнений Фрейндлиха и Ленгмюра:

где

А - величина адсорбции, моль/кг,

С - концентрация адсорбтива, моль/л,

k - константа уравнения Фрейндлиха, моль/кг,

1/n - константа уравнения Фрейндлиха,

A_∞ - предельная адсорбция, моль/кг,

b - концентрация адсорбтива, при которой достигается половина предельной адсорбции, моль/л.

Для определения констант уравнения Фрейндлиха был построен график зависимости величины адсорбции от равновесной концентрации винпоцетина в логарифмических координатах и определены коэффициенты уравнения линейной зависимости методом наименьших квадратов, показанные на фиг. 4.

Для полученной зависимости были определены коэффициенты линейной регрессии

log А=(0,505919±0,108038364)* log С+(0,558169262±0,551738074).

Коэффициент 1/n=0,505919±0,108038364.

Коэффициент k=10^{(0,558169262±0,551738074)}.

Для оценки погрешности коэффициента k воспользуемся формулой связывающей погрешность функции с погрешностью ее аргумента

Для расчета коэффициента k используется показательная функция, таким образом, расчет погрешности данной константы можно выполнить по формуле

Таким образом, получаем коэффициент k=3,615507457±1.163161619 моль/кг.

Для определения констант уравнения Ленгмюра методом наименьших квадратов был найден свободный член уравнения линейной регрессии равный 1/А_∞=81,30940761±36,26474441.

Для оценки погрешности коэффициента А_∞ воспользуемся формулой связывающей погрешность функции с погрешностью ее аргумента

тогда погрешность

Предельная адсорбция А_∞=(1/81,30940761)±0,005485=0,0122987±0,005485 моль/кг.

Для определения константы b уравнения Ленгмюра величина 1/А_∞ удваивалась

2/А_∞=162,6188152±72,52948882.

Константа b уравнения Ленгмюра (концентрация, при которой достигается половина предельной адсорбции) подтверждает достаточно эффективную адсорбцию винпоцетина липосомами при низкой концентрации.