Результат интеллектуальной деятельности: Способ определения антиокислительной активности лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов методом дифференциальной спектрофотометрии

Изобретение относится к аналитической химии, химико-фармацевтической промышленности, области фармакогнозии и фармацевтической химии и может быть использовано для контроля качества синтетических лекарственных препаратов, растительного сырья и фитопрепаратов (ФП) на его основе.

Известен способ первичной оценки антиоксидантной активности водных и водно-спиртовых извлечений из растительных объектов методом титриметрии, основанный на окислении веществ-антиоксидантов (АО) перманганатом калия в кислой среде (Патент РФ 2170930, МКП G01N 33/50, G01N 33/52. опубл. 20.07.2001). Недостатком данной методики является то, что данный метод позволяет определить количественное содержание суммы всех веществ, обладающих антиоксидантной активностью (АОА) в пересчете чаще всего на рутин, кверцетин, галловую и аскорбиновую кислоты, а также пирокатехин, но не дифференцировать их по группам.

Существует амперометрический способ оценки АОА различных многокомпонентных смесей без их предварительного разделения, включающий подготовку проб анализируемого и стандартного веществ, их электрохимическое окисление в ячейке амперометрического детектора, усилении электрических сигналов, их регистрацию и расчет АОА по предложенной математической зависимости в пересчете на рутин, кверцетин, галловую или аскорбиновую кислоты или синтетический краситель кармуазин (Саввин, П.Н. Исследование антиоксидантных свойств желейного мармелада. / П.Н. Саввин, В.М. Болотов // Химия растительного сырья. - №4. - 2008. - С. 177-179). Данный способ позволяет оценить суммарную АОА с высокой точностью и воспроизводимостью, однако требует применения специфического дорогостоящего оборудования - прибора «Цвет-Яуза-01-AA».

Известен способ кулонометрического определения АОА экстрактов трав, соков ягод, плодов и овощей, различных чаев, настоев и напитков на основе природного растительного сырья, водных и водно-спиртовых извлечений с использованием в качестве реагента электрогенерированного брома или хлора (Электрогенерированный бром - реагент для определения антиоксидантной способности соков и экстрактов / И.Ф. Абдулин, Е.Н. Турова, Г.К. Будников, Г.К. Зиятдинова // «Заводская лаборатория. Диагностика материалов». - №9. - 2002. - Том 62. - С. 13-15), основанный на электро-химическом окислении хлорид или бромид - ионов на платиновом электроде в кислых средах с образованием короткоживущих радикалов брома или хлора, адсорбированных на поверхности платинового электрода, с последующим взаимодействием с биологически активными веществами (БАВ) исследуемых объектов. Способ позволяет охватить широкий круг БАВ различной структуры, обладающих антиоксидантными свойствами, но дает возможность говорить лишь о некоторой эффективной величине АОА растительных настоев, поскольку выделить вклад каждого из составляющих смесь компонента представляет чрезвычайно сложную задачу.

Известны также способы определения АОА некоторых групп БАВ растений методом тонкослойной хроматографии (ТСХ), в которых зоны индивидуальных веществ, обладающих АОА, после разделения непосредственно на пластине обрабатывали подкисленным раствором калия перманганата, выступающим в данном случае в качестве проявителя (зоны индивидуальных АО обесцвечивали раствор калия перманганата на пластине, проявляясь в виде белых пятен на розовом фоне) (Чистякова, А.С. Изучение антиоксидантной активности некоторых групп БАВ методом ТСХ / А.С. Чистякова, Т.А. Брежнева, А.А. Мальцева // Сборник научных трудов: «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции». - Пятигорск. - 2012. - Вып. 67. - С. 289-290), или 2,2-дифенил-1-пикрилгидразином, детектирующим зоны, ответственные за проявление антирадикальной активности (Олейников, Д.Н. Химический состав и антирадикальная активность эфирного масла российских образцов Mentha piperita / Д.Н. Олейников, Л.В. Дударева // Химия растительного сырья. - 2011. - №4. - С. 109-114). Данные способы позволяет лишь судить о присутствии АО различной природы в лекарственном растительном сырье (ЛРС) и не дают представления об их количественном содержании. Кроме того, разделить все БАВ, присутствующие в ЛРС и проявляющие АОА, в одной хроматографической системе не представляется возможным.

Спектрофотометрические методы, несмотря на невысокую селективность, по-прежнему находят широкое применение в анализе лекарственных препаратов благодаря сравнительной доступности, дешевизне, простоте в сочетании с хорошей точностью. Большинство лекарственных веществ обладает собственным светопоглощением в УФ-области.

Описано огромное количество способов определения АОА спектрофотометрическими методами различных объектов. Наиболее известными среди них являются: метод ТАС (Total Antioxidant Capacity) и его модификация метод (Хасанов, В.В. Методы исследования антиоксидантов / В.В. Хасанов, Г.Л. Рыжова, Е.В. Мальцева // Химия растительного сырья. - №3. -2004. - С. 63-75), заключающийся в том, что кроцин окисляется 2,2'-азобис-(2-амидинопропан)гидрохлоридом (ААРН) в присутствии испытуемого образца и без (контрольный опыт) при термостатировании при 37°С в течение 60-75 минут с последующим измерением оптической плотности при 450 им. Методы основанные на способности ингибировать образование ТБК-активных продуктов (TBARP) заключаются в измерении оптической плотности ТБК-активных продуктов при длине волны 532±2 нм после Fe²⁺-индуцированного перекисного окисления липидов в липосомальной системе в опытных образцах по отношению к контрольным (Изучение антиоксидантного действия гесперидина, диосмина, флавицина и кверцетина in vitro / Е.О. Сергеева, Е.Г. Доркина, Л.А. Саджая и др. // Сборник научных трудов: «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции». - Пятигорск. - 2012. - Вып. 67. - С. 372-374). Метод FRAP (ferric reducing/antioxidant power), основанный на введении избытка ионов Fe³⁺ и фотометрического реагента - трипиридилтриазина, 1,10-фенантролина, 2,2'-дипиридила и др., которые под действием АО образуются интенсивно окрашенный комплекс железа(II) с реагентом, что сопровождается появлением интенсивной окраски (Определение суммарного содержания антиоксидантов методом FRAP / Т.Г. Цюпко, И.С. Петракова, Н.С. Бриленок и др. // Аналитика и контроль. - 2011. - Т. 15.-№3.- С. 287-298). Методы, основанные на способности ингибировать ауто-окисление адреналина in vitro и тем самым предотвращать образование активных форм кислорода в щелочной среде в присутствии и без исследуемого объекта. Фотометрирование осуществляется при длине волны 347 нм (Новый подход в оценке антиоксидантной активности растительного сырья при исследовании процесса аутоокисления адреналина / Е.И. Рябинина, Е.Е. Зотова, Е.Н. Ветрова и др. // Химия растительного сырья. - 2011. - №3. - С. 117-121). Метод DPPH представляет собой колориметрический метод, основанная на реакции DPPH (2,2-дифенил-1-пикрилгидразил), растворенного в метаноле, с образцом АО, что сопровождается снижением пурпурно-синяя окраска DPPH, а реакция контролируется по изменению оптической плотности при 514 нм спектрофотометрически. Недостатком данных способов является применение, в некоторых случаях, токсичных органических растворителей (метанол), а также использование цветных реакции, в частности с Fe(III), продуктом которых являются нестабильные по окраске во времени окрашенные соединения (Федосеева, А.А. Антиоксидантная активность настоев чая / А.А. Федосеева, О.С. Лебедкова, Л.В. Каниболоцкая // Химия растительного сырья. - 2008. - №3. - С. 123-127).

Известен флуориметрический метод «Oxygen Radical Absorption Capacity»-ORAC, основанный на измерении интенсивности флуоресценции при длине волны λ_возб. 490 нм и λ_исп. 530 нм на флюориметре флуоресцеина, в присутствии ААРН в качестве источника перекисных радикалов, и ее изменении от времени протекания реакции в присутствии АО, связывающих кислородные радикалы и увеличивающих время флуоресценции вследствие защитного действия (Макарова, М.Н, Антирадикальная активность флавоноидов и их комбинаций с другими антиоксидантами / М.Н. Макарова, В.Г. Макаров, И.Г. Зенкевич // Фармация. - 2004.- №2.- С. 30-32).

Существуют хемилюминесцентные методы определения АОА, основанные на измерении подавления люминесценции люминола после взаимодействия со свободными радикалами, генерирующимися в системе постоянно в результате инициируемого теплом распада ААРН, при добавлении образца АО (Оценка уровня антиоксидантной активности перспективных дикорастущих и культивируемых лекарственных растений республики Башкортостан / А.Р. Ахметьянова, Т.В. Булгаков, Э.Х. Галиахметова и др. // Медицинский вестник Башкортостана. - 2016. - Т. 11, №4 (64). - С. 68-71).

Описан метод микрокалориметрии, основанный на регистрации теплового эффекта радикальных реакций окисления или полимеризации, позволяющий по периоду индукции рассчитать эффективное содержание ингибиторов в сложных природных смесях (Сизова, Н.В. Оценка антиокислительной активности эфирных масел методом микрокалориметрии / Н.В. Сизова, О.Ю. Веретнова, А. Ефремов // Химия растительного сырья. - №3. - 2002. - С. 57-60).

Недостатками данных методов является необходимость дорогостоящего оборудования, реактивов и материалов, длительность процедуры определения, а также невозможность раздельного определения АО в сложных многокомпонентных смесях.

Известен способ определения АОА растворов потенциометрическим методом основано на химическом взаимодействии АО с медиаторной системой, в качестве которой используется смесь K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆]. Добавление растворов, содержащих вещества, проявляющие АОА, в ячейку, приводит к изменению окислительно-восстановительного потенциала среды в результате взаимодействия АО с окисленным компонентом K₃[Fe(CN)₆] медиаторной системы (Потенциометрический метод определения антиоксидантной активности пищевых объектов и объектов фармации с использованием комплексов металлов / Е.Р. Газизуллина, Я.А. Окулова, К.Г. Попова и др. // В книге: XX Менделеевский съезд по общей и прикладной химии. Тезисы докладов в 5 томах. Уральское отделение Российской академии наук, 2016. - С. 251). Недостатком данного способа является относительно большое количества образца и времени для анализа. Кроме того, как и в любом подобном электрохимическом методе, разброс показаний прибора при идентичных измерениях является достаточно высоким. Данный способ не дает возможность раздельно определить содержание каждого АО в сложных многокомпонентных смесях, таких как извлечения из растительных объектов, что также можно отнести к недостаткам данных способов-аналогов.

Прототипом является способ (Некрасова Л.П. Определение антиоксидантной активности электрохимически активированной воды потенциометрическим и спектрофотометрическим методами / Л.П. Некрасова, Р.Н. Михайлова, И.Н. Рыжова // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. - 2016. - №5. - С. 559-563), в котором 10 мл раствора эквимолярной медиаторной системы [Fe(CN)₆]^4-/[Fe(CN)₆]^3-, концентрацией 0,001 М помещают в мерные колбы вместимостью 50 мл и доводят до метки исследуемой электрохимически активированной водой, перемешивают, выдерживают 40-60 минут и измеряют оптическую плотность при 420 нм в кюветах с толщиной поглощающего слоя 1-5 см; параллельно готовят холостую пробу на дистиллированной воде и определяют разность оптических плотностей исследуемого и холостого опытов, рассчитывают концентрацию окислителя (восстановителя), выраженную в моль-экв/л, по определенной формуле с использованием коэффициента молярного поглощения K₃[Fe(CN)₆]. Недостатком способа являются, во-первых, невозможность применения прямой спектрофотомерии для ЛРС и ФП, имеющих собственное поглощение в диапазоне 400-440 нм; во-вторых, использование в качестве стандартного образца для установления линейности методики гидрохинона - вещества нераспространенного в объектах растительного происхождения, а также расчет концентрации окислителя (восстановителя) в моль-экв/л, что трудно связать с суммарным содержанием биологически активных веществ-АО в пересчете на какую-либо определенную группу БАВ в сырье, что является одной из задач определения АОА растительных объектов, и сопоставить с результаты исследования БАВ-АО в ЛРС другими широко применяемыми методами.

В научно-фармацевтической, медицинской и патентной литературе способов, позволяющих проводить оценку антиокислительной активности ЛРС и ФП и суммарное содержание в них БАВ-АО в пересчете на кислоту аскорбиновую методом дифференцированной спектрофотометрии, не обнаружено.

Задача изобретения заключается в разработке спектрофотометрического способа оценки антиокислительной активности ЛРС и ФП и суммарного содержания в них БАВ-АО в пересчете на кислоту аскорбиновую методом дифференцированной спектрофотометрии.

Технический результат заключается в разработке спектрофотометрического способа одновременного определения антиокислительной активности и суммарного содержания БАВ-антиоксидантов в лекарственном растительном сырье и фитопрепаратах, отличающегося чувствительностью (1×10^-5 г/мл), доступностью и экспрессностью.

Технический результат достигается тем, что кипячение навески измельченного сырья в воде из расчета 1,0±0,1 г навески на 30 мл воды осуществляют в течение 40-50 мин., проводят охлаждение, процеживание через несколько слоев марли и отделение аликвотной части, измерение оптической плотности смеси растворов аликвоты и медиаторной системы 0,0002 М раствора ферроцианида калия и 0,0002 М раствора феррицианида калия, согласно изобретению, отделенную аликвотную часть разводят водой в объемном соотношении 1:4, полученный раствор смешивают с растворами медиаторной системы в объемном соотношении 23:1:1, измерение оптической плотности проводят методом дифференциальной спектрофотометрии при длине волны 420±2 нм относительно раствора сравнения, представляющего

собой 4 мл воды очищенной, доведенные до метки в мерной колбе вместимостью 50 мл свежеприготовленным извлечением, разведенным водой в объемном соотношении 1:4, вычисление антиокислительной активности проводится в пересчете на кислоту аскорбиновую и абсолютно сухое сырье по формуле:

где А - оптическая плотность исследуемого раствора в максимуме поглощения, а суммарное содержание БАВ-АО в пересчете на кислоту аскорбиновую и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле

где АОА - вычисленная ранее по формуле 1, г/мл; а - точная навеска сырья, г; W - объем мерной колбы, взятой для разведения, мл; Р - общий объем приготовленного извлечения, мл; В - потеря в массе при высушивании исследуемого сырья, %; V_a - объем аликвоты извлечения, взятый для разведения, мл.

На фиг. 1 показан вид спектров поглощения водных растворов 1 - ферроцианида калия; 2 - феррицианида калия и 3 - их смеси в соотношении 1:1. На фиг.2 - график зависимости величины оптической плотности растворов, содержащих медиаторную пару, от концентрации кислоты аскорбиновой и его аппроксимация при у=-0.1076х+0.8145, R²=0.9816. На фиг. 3 - вид спектров поглощения 0,001% водного раствора кислоты аскорбиновой 1 и извлечения из плодов облепихи крушиновидной высушенных 2. Вид спектра поглощения водного раствора медиаторной пары 1 и дифференциального спектра водного раствора медиаторной пары в присутствии извлечения из плодов облепихи крушиновидной высушенных 2 приведен на фиг.4. Фиг. 5 демонстрирует зависимость оптической плотности водного раствора медиаторной пары с 0,001% водным раствором кислоты аскорбиновой 1 и извлечением из

плодов облепихи крушиновидной высушенных 2 от времени проведения измерений. В таблице 1 приведены экспериментальные результаты определения содержания суммы БАВ, обладающих антиокислительной активностью (в пересчете на кислоту аскорбиновую и абсолютно сухое сырье). Метрологическая оценка результатов определения содержания суммы БАВ, обладающих антиокислительной активностью (в пересчете на кислоту аскорбиновую и абсолютно сухое сырье) (на примере плодов облепихи крушиновидной сорта «Нивелена») представлена таблице 2.

Способ определения антиокислительной активности ЛРС и ФП методом дифференциальной спектрофотометрии реализуется следующим образом.

Точную навеску (около 2,0±0,1 г) измельченного сырья помещают в коническую колбу вместимостью 100 мл, заливают водой очищенной в количестве 60 мл и кипятят с обратным холодильником на водяной бане при периодическом перемешивании в течение 45 минут. Извлечение охлаждают и процеживают через несколько слоев марли в коническую колбу так, чтобы частицы сырья не попали в колбу. Извлечение разводят водой очищенной в мерной колбе в объемном соотношении 1:4 (исследуемый раствор). Измеряют оптическую плотность смеси, состоящей из 2 мл 0,0002 М раствора ферроцианида калия и 2 мл 0,0002 М раствора феррицианида калия, доведенной до метки в мерной колбе вместимостью 50 исследуемым раствором, относительно раствора сравнения (4 мл воды очищенной, доведенные до метки в мерной колбе вместимостью 50 исследуемым раствором) при длине волны 420±2 нм (фиг. 4), так как извлечения, в отличие от кислоты аскорбиновой, использованной в качестве стандартного образца, обладают собственной оптической активностью в диапазоне длин волн 400-440 нм (фиг. 3). Данные спектров поглощения ЛРС свидетельствуют о присутствии в извлечениях суммы БАВ, обладающих антиокислительной активностью (в пересчете на кислоту аскорбиновую), так как значение оптической плотности меньше холостого опыта (фиг. 4). В результате взаимодействия восстановителя с ферро-

или феррицианидом калия изменяется соотношение [Fe(CN)₆]^4-/[Fe(CN)₆]^3- и, соответственно, оптическая плотность раствора (фиг. 1), содержащего медиаторную пару. Уменьшение оптической плотности при добавлении к системе исследуемого извлечения свидетельствует о том, что анализируемый раствор обладает восстановительными свойствами.

В начале при помощи уравнения градуировочной зависимости, выведенного из данных калибровочного графика (фиг. 2), построенного с применением серии стандартных растворов кислоты аскорбиновой, добавляемых к раствору медиаторной пары, на основании полученного значения оптической плотности исследуемого раствора после добавления к медиаторной паре вычисляют антиокислительную активность извлечения в пересчете на кислоту аскорбиновую в г/мл раствора по формуле 1, а затем содержание суммы БАВ, обладающих антиокислительной активностью (в пересчете на кислоту аскорбиновую и абсолютно сухое сырье) в процентах по приведенной формуле 2.

Способ позволяет проводить оценку антиокислительной активности ЛРС и ФП и суммарного содержания в них БАВ-АО в пересчете на кислоту аскорбиновую методом дифференцированной спектрофотометрии и стандартизировать ЛРС и ФП по содержанию данных БАВ и отличается достаточной чувствительностью (1×10^-5 г/мл), экономичностью, доступностью и экспрессностью.

Пример 1. Разработанный способ был апробирован на ЛРС листьев крапивы двудомной.

Получение извлечения: Около 2,0±0,1 г измельченного сырья, проходящего через сито с размером отверстий 0,5 мм, помещают в коническую колбу вместимостью 100 мл, заливают водой очищенной в количестве 60 мл и кипятят с обратным холодильником на водяной бане при периодическом перемешивании в течение 40 минут. Извлечение охлаждают и процеживают через несколько слоев марли в коническую колбу так, чтобы частицы сырья не попали в колбу. 20 мл извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят водой очищенной до метки (исследуемый раствор). Измеряют

оптическую плотность смеси, состоящей из 2 мл раствора ферроцианида калия и 2 мл раствора феррицианида калия, доведенной до метки в мерной колбе вместимостью 50 исследуемым раствором, относительно раствора сравнения (4 мл воды очищенной, доведенные до метки в мерной колбе вместимостью 50 исследуемым раствором при длине волны 420±2 нм. Полученное значение оптической плотности используют для вычисления антиокислительной активности извлечения в пересчете на кислоту аскорбиновую в г/мл раствора по формуле 1, а затем содержания суммы БАВ, обладающих антиокислительной активностью (в пересчете на кислоту аскорбиновую и абсолютно сухое сырье), в сырье в процентах по формуле 2. Результаты определения антиокислительной активности извлечения из листьев крапивы двудомной в пересчете на кислоту аскорбиновую и содержания суммы БАВ-антиоксидантов в пересчете на кислоту аскорбиновую и абсолютно сухое сырье представлены в табл. 1. Метрологическая оценка результатов определения представлена табл. 2.

Пример 2. Разработанный способ был апробирован на ЛРС плодов облепихи крушиновидной различных сортов.

Получение извлечения: Около 2,0±0,1 г высушенного измельченного сырья, помещают в коническую колбу вместимостью 100 мл, заливают водой очищенной в количестве 60 мл и кипятят с обратным холодильником на водяной бане при периодическом перемешивании в течение 50 минут. Извлечение охлаждают и процеживают через несколько слоев марли в коническую колбу так, чтобы частицы сырья не попали в колбу. 20 мл извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят водой очищенной до метки. Измеряют оптическую плотность смеси, состоящей из 2 мл раствора ферроцианида калия и 2 мл раствора феррицианида калия, доведенной до метки в мерной колбе вместимостью 50 исследуемым раствором, относительно раствора сравнения (4 мл воды очищенной, доведенные до метки в мерной колбе вместимостью 50 исследуемым раствором) при длине волны 420±2 нм (фиг. 4). Полученное значение оптической плотности используют для вычисления антиокислительной активности извлечения в пересчете на

кислоту аскорбиновую в г/мл раствора по формуле 1, а затем содержания суммы БАВ, обладающих антиокислительной активностью (в пересчете на кислоту аскорбиновую и абсолютно сухое сырье), в сырье в процентах по формуле 2. Результаты определения антиокислительной активности извлечений из плодов облепихи крушиновидной различных сортов в пересчете на кислоту аскорбиновую и содержания суммы БАВ-антиоксидантов в пересчете на кислоту аскорбиновую и абсолютно сухое сырье представлены в табл. 1. Метрологическая оценка результатов определения представлена табл. 2.