СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ПОЛИБРОМЕЛАЙНА С ПРИМЕНЕНИЕМ ГЛУТАРОВОГО АЛЬДЕГИДА

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в промышленности и исследовательских целях: при создании средств для удаления ржавчины с металлов, для смягчения кожаных изделий, для очищения сточных вод.

Бромелайн (КФ 3.4.22.32) - протеолитический растительный фермент, получаемый из ананаса. Наибольшее количество энзима находится в нижней части сердцевины стебля зрелого растения. Молодые ткани содержат незначительные количества фермента или полностью лишены протеолитической активности. Бромелайн относится к группе цистеиновых протеиназ. Активность бромелайна повышается в присутствии цистеина, меркаптоэтанола, цианида и угнетается веществами, специфически реагирующими с SH-группами. Активность фермента, обработанного ртутью, может быть полностью восстановлена при добавлении избытка цистеина. Бромелайн - гликопротеид и содержит прочно связанный углеводный компонент.Фермент из стебля содержит 1.5% углеводов и дополнительно шесть остатков глюкозамина на молекулу белка, фермент из плодов содержит около 3% углеводов. Очищенный бромелайн из стеблей гидролизует некоторые низкомолекулярные синтетические субстраты. Из всех исследованных соединений быстрее других гидролизуются производные аргинина. В этом отношении фермент напоминает папаин, однако, в отличие от него бромелайн гидролизует эфир бензоил-L-аргинина во много раз быстрее, чем соответствующий амид [Мосолов В.В. Протеолитические ферменты / В.В. Мосолов - М.: Наука, 1971. - 404 с.].

Широко известно применение бромелайна в пищевой промышленности и медицине, однако, кроме того, бромелайн можно использовать в кожевенной промышленности для смягчения кожаных изделий, при очищении сточных вод, при удалении ржавчины с металлов [Биотехнология растений: культура клеток / под ред. Р.Г. Бутенко. - М.: Агропромиздат, 1989. - 279 с., S.J. Taussiga S. Batkin Bromelain, the enzyme complex of pineapple (Ananas comosus) and its clinical application. An update // Journal of Ethnopharmacology. - 1988. - V. 22 - P. 191-203].

Под иммобилизацией ферментов понимают любое ограничение числа степеней свободы (в том числе и сополимеризацию как частный случай иммобилизации) их физического движения в пространстве. Иными словами, иммобилизация представляет собой включение молекул фермента в такую среду, в которой для них доступной является лишь ограниченная часть общего объема системы. Иммобилизация переводит фермент из разряда гомогенных растворимых катализаторов в разряд гетерогенных со всеми вытекающими отсюда технологическими преимуществами: 1) возможность отделить препарат от реакционной среды, получить продукт, не загрязненный энзимом, 2) остановить реакцию в любой момент времени, 3) использовать катализатор повторно, 4) проводить процесс непрерывно (например, в проточных реакторах), 5) регулировать скорость катализируемой реакции (или выход продукта), 6) перспектива изменять свойства фермента: его специфичность (особенно в отношении макромолекулярных субстратов), зависимость активности от рН среды, 7) стабильность к денатурирующим воздействиям и долговечность препарата, упрощение и удешевление производственных циклов. Кроме того, иммобилизация энзимов является одним из путей регулирования и стабилизации их активности. Значительны также и экологические преимущества иммобилизованных препаратов: сокращаются количество отходов, а также число «нестандартных» операций, например, когда из-за нестерильности среды большие объемы культуральной жидкости сливаются в канализацию [Холявка М.Г. Практикум по биотехнологии: иммобилизованные биологические объекты в системе лабораторных работ / М.Г. Холявка, М.А. Наквасина, В.Г. Артюхов. - Воронеж: Издательский дом ВГУ, 2017. - 161 с.].

Иммобилизация методом поперечных сшивок (сополимеризация) заключается в химическом связывании молекул ферментов между собой путем образования поперечных сшивок. Такая матрица будет содержать только молекулы целевого фермента. Метод отличается простотой реализации и позволяет производить сшивку различных по структуре ферментов, однако, часто при сшивке может происходить существенное снижение активности катализатора. Самое широкое применение в качестве сшивающего агента для сополимеризации ферментов нашел глутаровый альдегид, содержащий две альдегидные группы на обоих концах цепи. Эти группы при нейтральных значениях рН реагируют со свободными аминогруппами белка, образуя множественные сшивки между его молекулами. Глутаровый альдегид часто используют для приготовления пленок поперечно сшитого фермента с заданными размерами пор [Холявка М.Г. Иммобилизованные биологические системы: биофизические аспекты и практическое применение / М.Г. Холявка, В.Г. Артюхов. - Воронеж: Издательский дом ВГУ, 2017. - 261 с.].

В качестве ближайшего аналога служил способ гидролиза дрожжей (пат. США №4218481, опубл. 19.08.1980) под действием ферментных препаратов папаина, фицина, бромелайна, панкреатина или их смесей при концентрации ферментов в дрожжевой суспензии 0,01-1,0%. При этом процесс гидролиза проводят при температуре 40-60°С и рН 5.0-7.5 в течение 2-24 часов при непрерывном помешивании.

Недостатком прототипа была относительная нестабильность ферментных препаратов и невозможность проводить ферментативные процессы в реакторах непрерывного действия.

Технический результат заявленного изобретения заключается в увеличении скорости ферментативной реакции и повышении эффективности использования препарата на основе бромелайна при повышенных температурах (свыше 60°С) и в реакторах непрерывного действия.

В своей работе мы оптимизировали условия для иммобилизации бромелайна путем сополимеризации его молекул с использованием глутарового альдегида в качестве сшивающего агента. После сополимеризации молекулы фермента прочно связаны между собой ковалентными связями, полибромелайн более стабилен при варьировании значений рН среды и температуры, не вымывается из реактора.

Технический результат достигается тем, что в способе получения препарата полибромелайна сополимеризацию с применением глутарового альдегида в качестве сшивающего агента, осуществляют растворением бромелайна в трис-глициновом буферном растворе с рН 9.0 из расчета 1 мг бромелайна на 1 мл трис-глицинового буферного раствора, добавлением раствора глутарового альдегида с концентрацией 2% или 10% в объеме, равном объему трис-глицинового буферного раствора, инкубированием до образования пленки, промыванием 50 мМ трис-HCl буферным раствором (рН 7.5) до отсутствия в промывных водах белка.

Сополимеризация обеспечивает прочную и необратимую «сшивку» молекул бромелайна между собой с помощью глутарового альдегида, а, следовательно, возможность применения гетерогенного ферментного препарата в проточных реакторах непрерывного действия.

На фиг. 1 приведена характеристика препаратов полибромелайна.

Пример реализации способа.

В качестве объекта исследования был выбран бромелайн фирмы «Sigma-Aldrich», субстратом для гидролиза служил азоказеин фирмы «Sigma-Aldrich».

5 мг бромелайна растворяли в 5 мл трис-глицинового буферного раствора с рН 9.0, затем добавляли 5 мл 2% или 10% концентрации раствора глутарового альдегида и оставляли в чашке Петри до образования пленки. После окончания инкубирования образовавшуюся пленку промывали 50 мМ трис-HCl буферным раствором (рН 7.5) до отсутствия в промывных водах белка (контроль осуществляли на спектрофотометре СФ-2000 при Х=280 нм).

Содержание белка в иммобилизованных (сополимеризованных) препаратах бромелайна определяли методом Лоури [Lowry О.Н., Rosebrough N.J., Faar A.L., Randall R.J. Protein measurement with folin-phenol reagent // J. Biol. Chem. - 1951. - V. 193. - P. 265-275]. Определение протеолитической активности фермента проводили на субстрате азоказеине (Fluka). К 50 мг образца добавляли 200 мкл трис-HCl буферного раствора (рН 7.5), 800 мкл азоказеина (0.5% в 50 мМ трис-HCl буферного раствора, рН 7.5) и инкубировали 2 часа при 37°С. Далее добавляли 800 мкл ТХУ (5%), инкубировали 10 минут при -4°С, затем центрифугировали в течение 3 мин при 13000 об/мин для удаления негидролизованного азоказеина. К 1200 мкл супернатанта добавляли 240 мкл 3% NaOH для нейтрализации кислоты, после чего измеряли оптическую плотность опытной пробы при 410 нм в 1 см кювете.

Контрольная проба содержала 800 мкл азоказеина, 800 мкл ТХУ, 50 мг образца и 200 мкл трис-HCl буферного раствора. За единицу каталитической активности принимали количество фермента, которое в условиях эксперимента гидролизует 1 мкМ субстрата за 1 мин. Удельную протеолитическую активность бромелайна рассчитывали по формуле:

ПА=D*1000/120/200/Ср,

где ПА - протеолитическая активность, мкМ/мин на 1 мг белка,

D - оптическая плотность пробы при 410 нм,

Ср - концентрация белка в пробе, мг/мл, измеренная по методу Лоури,

120 - время инкубирования в минутах,

200 - объем пробы в мкл,

1000 - пересчет в мкМ.

Статистическую обработку полученных результатов проводили при уровне значимости 5% с использованием t-критерия Стьюдента.

Достаточно высокое количество белка в гетерогенных препаратах (в мг на г носителя) наблюдалось при сополимеризации фермента с раствором глутарового альдегида с 2% и 10% концентрацией. Значения общей активности (в ед на мл раствора) бромелайна оказались наилучшими при сополимеризации фермента с раствором глутарового альдегида 2% концентрации. Высокие значения удельной активности (в ед. на 1 мг белка в пробе) также показал препарат, иммобилизованный путем сополимеризации фермента с раствором глутарового альдегида 2% концентрации (Фиг. 1).

Метод сополимеризации бромелайна имеет свои преимущества: фермент защищен от неблагоприятных условий среды, его молекулы прочно и необратимо связаны между собой ковалентными связями, препарату можно придавать различные конфигурации, молекула энзима стабильна, также возможно создать катализатор с контролируемыми свойствами.

Мы сравнили полученные результаты по определению каталитической активности и содержания белка для препаратов полибромелайна. Оптимальное соотношение содержания белка (мг на г носителя), общей активности (в ед на мл раствора) и удельной активности (в ед. на мг белка) выявлено при сополимеризации бромелайна с раствором глутарового альдегида 2% концентрации.