Способ получения активной фармацевтической субстанции для синтеза радиофармпрепарата, тропного к клеткам карциномы Эрлиха

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и медицине и касается получения активной фармацевтической субстанции на основе ДНК-аптамеров для синтеза радиофармпрепарата, тропного к клеткам карциномы Эрлиха.

Известны радиофармпрепараты, используемые при исследовании опухолей.

Так известен способ биопсии сигнального лимфоузла у больных раком молочной железы с помощью оптической навигационной системы, включающий внутриопухолевое введение меченого коллоидного радиофармпрепарата, внутриопухолевого введения меченого коллоидного радиофармпрепарата производят динамическое сцинтиграфическое исследование подмышечных, парастернальных, над- и подключичных лимфоузлов со стороны локализации опухоли молочной железы (RU 2549488, C1 А61В 6/03, A61K 51/12, G01T 1/00, А61В 17/00, 27.04.2015 Бюл. №12).

Также известен способ дифференциальной диагностики высоко- и низкозлокачественных глиальных опухолей головного мозга путем исследования с использованием однофотонной эмиссионной компьютерной томографии после внутривенного введения радиофармпрепарата (RU 2375961, С2 А61В 6/02, 20.12.2009 Бюл. №35).

Известные радиофармпрепараты, используемые в способах, не позволяют определять локализацию карциномы Эрлиха.

Известна принципиальная возможность селекции аптамеров, проявляющих противоопухолевую активность в культурах опухолевых клеток, и идентификации их белковых мишеней с помощью масс-спектрометрического анализа. Так, полученный в ходе селекции аптамер AS-14 (Kd=3.8 нМ) был способен вызывать апоптоз (транслокацию фосфатидилсерина, определенную с помощью Annexin V AlexaFluor 488), a AS-9 (Kd=0.75 нМ) останавливал пролиферацию (установлено с помощью CellTraceTMFarRed DDAO-SE) в культуре клеток асцитной карциномы Эрлиха (Коловская О.С., Замай Т.Н., Замай А.С., Глазырин Ю.Е. Спивак Е.А., Зубкова О.А., и др. Взаимодействие ДНК-аптамер/белок как причина апоптоза и остановки пролиферации в клетках асцитной карциномы Эрлиха. Красноярский государственный медицинский университет им. В.Ф. Войно-Ясенецкого, 660022, г.Красноярск, ул. П. Железняка, Университет Оттавы, Марии Кюри 10, Оттава, K1N 6N5, Канада, ж. БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2013, том 30, №5-6, с. 398-411.

Известны также радиофармпрепараты на основе аптамеров, используемые в качестве биомаркера при позитронно-эмиссионной томографии.

Описан радиофармацевтический препарат для локализации опухоли, используемый в качестве биомаркера при позитронно-эмиссионной томографии, который содержит аптамер, специфичный к больной ткани, и связанный с ¹¹С-маркированной аминокислотой (WO 2012000861 (Al) A61K 31/7088; A61K 51/04; C12N 15/115; C12Q 1/68; G01N 33/574, 2012-01-05).

Не выявлено действие данного радиофармацевтического препарата на асцитные клетки карциномы Эрлиха.

Известен способ получения радиофармпрепарата или предшественников радиофармпрепарата, заявленный СИМЕНС АКЦИЕНГЕЗЕЛЛЬШАФТ, DE (RU 2011144567 А С07С 227/12, 10.05.2013 Бюл. №13), который или которые в качестве радиоактивного компонента содержат по меньшей мере одну α-аминокислотную группу, меченую радионуклидом 11С, содержащий ряд реакционных стадий.

Данный фармпрепарат не обладает тропностью к асцитным клеткам карциономы Эрлиха.

Наиболее близким к заявляемому решению является синтез радиофармпрепаратов на основе аптамеров, специфически связывающихся только с опухолевыми клетками, в частности на основе ДНК-аптамеров высокоаффинных к асцитным клеткам карциномы Эрлиха.Синтез препарата осуществляли на модуле синтеза Synthra MeI-Plus-CO2 («Synthra», Германия), который позволяет получать метилйодид ¹¹CH₃I из диоксида углерода ¹¹СО₂, произведенного в циклотроне и доставляемого в модуль синтеза в потоке мишенного газа. Синтез включает в себя стадию введения радиоактивной метки, в качестве которой выбран ультракороткоживущий радионуклид с позитронным типом распада - ¹¹С (Т1\2=20,38 минут) в молекулу - ДНК-олигонуклеотида (Озерская А.В., Бадрин Е.А., Белугин К.В., Чанчикова Н.Г., Токарев Н.А., Кичкайло А.С., Семичев Е.В., Т.А. Баранкина, Б.В. Баранкин, О.Н. Якименко, ФГБУ ФСНКЦ ФМБА России г. Красноярск, Россия, Тезисы. Томск, 2018 г.).

Описанный способ получения радиофармпрепарата не позволяет получить эффективный препарат, обладающий высокой степенью связывания ДНК-олигонуклеотида с радионуклидом ¹¹С и как следствие, высокоспецифичный к клеткам асцитной карциномы Эрлиха.

Задачей настоящего изобретения является получение активной фармацевтической субстанции, для синтеза радиофармпрепарата тропного к клеткам карциномы Эрлиха, обладающей высокой степенью связывания ДНК-олигонуклеотида с радионуклидом 11С и имеющей при этом, высокую тропность к клеткам карциномы Эрлиха.

Технический результат, достигаемый при реализации заявляемого решения заключается в повышении степени связывания ДНК-олигонуклеотида с радионуклидом 11С в активной фрамацевтической субстанции для синтеза радиофармпрепарата и, как следствие, повышение ее тропности к клеткам асцитной карциномы Эрлиха.

Поставленная задача решается тем, что в способе получения активной фармацевтической субстанции для синтеза радиофармпрепарата, тропного к клеткам карциномы Эрлиха, включающем стадию введения радиоактивной метки, в качестве которой выбран ультракороткоживущий радионуклид с позитронным типом распада - 11С (Т1\2=20,38 минут) в молекулу - ДНК-олигонуклеотида, согласно изобретению радиоактивную метку вводят в молекулу праймера (5'-/5ThioMC6-D/GGC ТТС TGG ACT АСС TAT GC-3'), комплементарного 20-ти нуклеотидному участку на 3'-конце аптамера AS14, при этом, праймер предварительно активируют - подвергают обработке для разрыва дисульфидных связей, и реакции нуклеофильного замещения, далее, полученный 3'-тиомодифицированный праймер нагревают в закрытом реакционном сосуде со метилйодидом (¹¹CH₃I) в среде ДМСО и, на стадии сшивания, полученный в результате реакции метилирования праймер - 3'-11CH₃S-праймер, смешивают с предварительно нагретым аптамером AS14, с последующим охлаждением готовой смеси и получением комплекса 3'-11CH₃S-праймер с аптамером AS14, используемого в качестве активной фармацевтической субстанции для синтеза радиофармпрепарата, тропного к клеткам карциномы Эрлиха.

Для разрыва дисульфидных связей праймер может быть обрабатан (трис-2-карбоксиэтил)-фосфином.

В качестве реагентов, для осуществления нуклеофильной реакции может быть использован диполярный апротонный растворитель - диметилсульфоксид и раствор хлористоводородной кислоты.

Перед смешиванием с 3'-11CH₃S-праймером аптамер AS14 нагревают до 95°С, смешивание осуществляют в соотношении 1:1, готовую смесь охлаждают до 5°С.

Изобретение иллюстрируется рисунками (фотографиями)

На фиг. 1 показана вероятная третичная структура аптамера AS14, определенная методом малоуглового рассеяния.

На фиг. 2 приведен результат сканирования агарозного геля на совмещенном ПЭТ/КТ томографе Discovery 600 (GeneralElectrics)

Используемый в способе аптамер AS14 имеет определенную нуклеотидную последовательность нуклеотидов, что включает константные области длинной 20 нуклеотидов с 3' и 5'-концов и уникальную область 40 нуклеотидов посередине.

Вероятная третичная структура аптамера была установлена с помощью метода малоуглового рентгеновского рассеяния SAXS (Small-angle X-rayscattering) совместно с жидкостной хроматографией SEC (Size-exclusionchromatography).

Измерения проводились на станции Р12 на базе EMBL (EuropeanMolecularLaboratory) синхротрона DESY в Гамбурге, Германия (Рис. 1).

Обработка данных эксперимента малоуглового рассеяния и построение трехмерной формы электронной плотности молекулы выполнялись в программном пакете ATSAS 2.8.4. Таким образом, установлены следующие параметры молекулы аптамера: Размер Dmax ~9.5-10 nm, радиус инерции Rg ~3.41 nm. Объем общей электронной плотности молекулы V ~32.1 nm3.

Способ получения активной фармацевтической субстанции для синтеза радиофармпрепарата, тропного к клеткам карциномы Эрлиха осуществляют следующим образом.

Праймер, комплементарный 20-ти нуклеотидному участку на 3'-конце аптамера AS14 хранят в замороженном виде при -18°С. Праймер размораживают при комнатной температуре 10-15 мин. 40 мкл размороженного праймера в концентрации 100 нмоль/л отбирают дозатором, добавляют 400 мкл 0,1 мМТСЕР (трис-2-карбоксиэтил)-фосфин) для разрыва дисульфидных связей. Реакционную смесь инкубируют при комнатной температуре. По истечении 120 мин инкубации, раствор смеси переносят в реакционный сосуд автоматизированного модуля синтеза SYNTHRA MEL-PLUS-CO² (Германия), добавляют 500 мкл безводный диметилсульфоксид (используют диполярный апротонный растворитель, который хорошо поддерживает нуклеофильные реакции 2-го порядка) и 10 мкл 0,1М раствора кислоты хлористоводородной.

Получение радионуклида углерод-11 осуществляют в мишенях ускорителей элементарных частиц при облучении азота протонами по реакции ^l4N(p,α)¹¹C на циклотроне «Cyclone 18/9 ST» (IBA) в газовой мишени «NirtaGas¹¹CCarbonforCyclone 18» (IBA), в качестве мишенного вещества используется особо чистый газообразный азот природного изотопного состава с добавкой от 0,5 до 1% кислорода.

Далее по магистрали полученный газ ¹¹СО² поступает в газовую ловушку автоматизированного модуля синтеза SYNTHRAMEL-PLUS-C02 (Германия), размещенном в радиационном защитном боксе.

Следующей стадией процесса является восстановление ¹¹СО² до метана ¹¹СН₄, под действием водорода в присутствии Ni-катализатора в печи при температуре 425°С.

Далее восстановленный метан ¹¹CH₄ подается в циркуляционную систему, в которой содержатся пары йода и при 750°С запускается радикальная реакция с ¹¹СН4 с образованием метилиодида (¹¹CH₃I). После чего, метилйодид ¹¹CH₃I передается в реакционный сосуд, Смесь нагревают при 65°С в течение 15 мин в закрытом реакционном сосуде.

На этой стадии 3'-тиомодифицированный праймер, восстановленный ТСЕР, взаимодействует при нагревании в заданных условиях с ¹¹CH₃I в среде ДМСО. Происходит метилирование праймера по его тиольной группе (HS-), в результате чего получается 3'-¹¹СН₃-S-праймер.

Затем 3'-¹¹СН₃-S-праймер смешивают с аптамером AS14 (предварительно нагретым до 95°С) в соотношении 1:1 (мМ:мМ). Готовую смесь охлаждают до 5°С для формирования третичной структуры и гибридизации аптамера с праймером. В результате получают комплекс 3'-¹¹СН₃-S-праймерс аптамером AS14, имеющий стабильную структуру и высокую специфичность к клеткам карциномы Эрлиха, что позволяет использовать данный комплекс в качестве активной фармацевтической субстанции для синтеза радиофармпрепарата тропного к клеткам карциномы Эрлиха.

Ниже приведены примеры доказательства стабильности структуры полученной активной фармацевтической субстанции для синтеза радиофармпрепарата тропного к клеткам карциномы Эрлиха и ее активности к клеткам карциномы Эрлиха.

Пример 1. Для доказательства стабильной структуры фармацевтической субстанции 3'-¹¹СН₃-S-праймер-аптамер AS14 был проведен горизонтальный гель -электрофорез на толстом 3% агарозном геле. Полученный раствор вносили в лунку геля по 12 мкл в двух параллелях, после чего гель помещали в систему гель-электрофорез (AdvanceMupid-One, Бельгия) на 10 минут при 100 В. Далее агарозный гель сканировали на совмещенном ПЭТ/КТ томографе Discovery 600 (GeneralElectrics), определяя полосы нахождения РФЛП на геле.

На основании полученных данных методом ПЭТ/КТ, средние значения разницы активности на старте от активности на финише связывание праймера с радионуклидом ¹¹С составили 47,7% - 59,9%.

Через 16 часов, из геля были вырезаны полосы нахождения активной фармацевтической субстанции (на основании ПЭТ/КТ-изображения) и проанализированы на наличие ДНК с помощью гель-документирующей системы (GBOX/EF2-E, SYNGENE, Великобритания) с использованием этидиум бромида в качестве ДНК-маркера. Выявлена колоколизация аптамераи праймера в анализируемом геле, что свидетельствует о том, что ¹¹С находился в структуре ДНК-праймера. ДНК выделяли из агарозного геля с использованием набора (MinEluteReactionCleanUpKit, Qiagen, Германия). Концентрацию ДНК измеряли спеткрофотометрически (Shimadzu uv-1280, Япония). Концентрация ДНК, связавшегося с радионуклидом 11С, составляла 0,46 и 0,6 mmol, что соответствует 5,52×10-12 моля в 12 мкл, нанесенных на гель, а в трех мл., соответственно, количество ДНК получается 1,38 и 1,8 nmol в разных параллелях. Следует отметить, что при вынужденном хранении геля в течение 16 часов (соблюдение норм радиационной безопасности) в жидкости, ДНК вымывается из геля в раствор и полоса размывается, и содержание ДНК в геле уменьшается. Для синтеза РФЛП брали 5 nmol ДНК-олигонуклеотида, если не учитывать возможные потери ДНК при синтезе и при хранении геля, то количество ДНК связанного с радионуклидом 11С - должно остаться 5 nmol. Следовательно, эффективность связывания ДНК с радионуклидом ПС составляет не менее 27% - 36% соответственно, однако в реальности это значение больше.

Результат проведенных исследований свидетельствует о том, заявляемый способ приводит к положительному протеканию химической реакции и позволяет получить стабильную структуру фармацевтической субстанции. Результаты полученных исследований свидетельствуют о том, что радионуклид ¹¹С находится в структуре комплекса праймер-аптамер.

Пример 2.

Оценка эффективности фармацевтической субстанции 3'-¹¹СН₃-S-праймер-аптамер AS14-co своими молекулярными мишенями проводилась на асцитных клетках карциномы Эрлиха.

Асцитные клетки карциномы Эрлиха, были выделены из асцитной жидкости мышей-опухоленосителей. После чего клетки дважды отмывали путем центрифугирования в фосфатном буфере, содержащем катионы кальция и магния. Затем 5 млн. клеток разводили в 400 мкл фосфатного буфера (подсчет клеток проводили с помощью камеры Горяева), содержащего 0,01 нг YRNA для маскировки неспецифических сайтов связывания, и инкубировали на шейкере 30 мин при комнатной температуре.

Отбирали 200 мкл приготовленных клеток и 50 мкл, 100 мкл, 150 мкл, 300 мкл соответственно полученного раствора с 3'-¹¹СН₃-S-праймер-аптамер AS14. Измерение проводили в трех параллелях. Время инкубации составляло 30 минут, после чего излишки комплекса смывались буферным раствором (PBS) и удалялись центрифугированием (2000 об./5 мин.). Радиоактивность полученных проб измерялась на дозкалибраторе Talete-HC горячей камеры Comecer (Италия).

Результаты исследований активности фармацевтической субстанции, полученной по заявляемому способу, показывают, что субстанция связалась с рецепторами внутри асцитных клеток карциномы Эрлиха и радиофармпрепараты, изготовленные на основе субстанции, могут быть использованы в качестве биомаркера для визуализации асцитных клеток карциномы Эрлиха для при позитронно-эмиссионной томографии.

Таким образом, при реализации заявленного способа получена активная фармацевтическая субстанция-3'-¹¹СН₃-S-праймер-аптамер AS14, позволяющая осуществлять визуализацию опухоли Эрлиха у мышей, и открывающий возможность создания на его основе РФП, тропного к клеткам карциномы Эрлиха, для выявления первичной опухоли и метастазов, а также проведения специфической противоопухолевой терапии.