СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО РЕЦИДИВИРУЮЩЕГО ГЕРПЕТИЧЕСКОГО СТОМАТИТА

Изобретение относится к медицине, а именно к вирусологии, стоматологии и экспериментальной фармакологии, и направлено на моделирование экспериментального рецидивирующего поражения слизистой оболочки полости рта лабораторных мышей в виде вирус-индуцированного стоматита. Может быть использовано для испытания эффективности новых противовирусных и иммуномодулирующих средств лечения герпетических стоматитов.

В настоящее время герпетическая инфекция остается наиболее распространенной и плохо контролируемой. Заболевания, обусловленные вирусом простого герпеса (ВПГ) как причина летального исхода занимают среди инфекционных заболеваний детей младшего возраста второе место (15,8%) после гриппа (35,8%) [1. Рабинович, И.М. Рецидивирующий герпетический стоматит / И.М. Рабинович, О.Ф. Рабинович, М.В. Разживина. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2005. - С. 64. Левончук, Е.А. Герпетическая инфекция полости рта / Е.А. Левончук // Современная стоматология. - 2005. - №1. - С. 19-22

Существующие средства и схемы терапии герпетического рецидивирующего стоматита не всегда оказываются достаточно эффективными и характеризуются большим количеством противопоказаний и побочных эффектов. Одной из возможных причин подобного состояния дел - отсутствие адекватных экспериментальных моделей рецидивирующего герпетического стоматита.

Отсутствие действенных вакцин и невозможность полного излечения в совокупности с практически 100% охватом популяции инфекцией определяют актуальность изучения герпесвирусной инфекции. Современные медико-биологические исследования заболеваний невозможно представить без применения экспериментального моделирования патологии. В качестве моделей используют как животных, так и культуры клеток - клетки различных типов, выделенных из организма и поддерживаемые в жизнеспособном состоянии в искусственных условиях.

Выбор подходящей модели для изучения инфекционного заболевания in vivo важен для адекватной экстраполяции полученных данных на процессы, протекающие в живом организме. В ряде случаев их использование не имеет альтернатив, например, при проведении доклинических исследований терапевических препаратов. Роль герпесвирусной инфекции (вируса простого герпеса 1 и 2 типов) как этиологического фактора в развитии рецидивирующего стоматита общепризнана. Однако при моделировании хронического рецидивирующего стоматита, согласно данным литературы, возникает необходимость усиливать повреждающее действие слизистой оболочки полости рта (СОПР) вирусами простого герпеса (ВПГ-1 и ВПГ-2) с помощью других иммунодепрессантов.

Существующие средства и схемы терапии рецидивирующего герпетического стоматита не всегда оказываются эффективными и характеризуются большим количеством противопоказаний и побочных эффектов. Одной из возможных причин подобного состояния дел - отсутствие адекватных экспериментальных моделей герпетических стоматитов. Наиболее близким по совокупности существенных признаков к заявляемому изобретению является способ создания модели хронической рецидивирующей герпетической инфекции у млекопитающих [Порываева А.П. Теоретические и практические аспекты моделирования хронической герпесвирусной инфекции, доктор. Дис. 03.02.02 - Вирусология 2015, 191 с.]

Недостатком данного способа моделирования является тот факт, что для оценки выраженности клинических проявлений обострений хронического герпетического стоматита необходимо наблюдение за зараженными вирусом простого герпеса (ВПГ-1) мышами не менее 320 сут. В предлагаемом нами способе время исследования можно сократить до 50-60 сут.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является [Способ получения состава для моделирования афтозного стоматита у животных Чемикосова Т.С. и соавт.; патент №2104588, G09B 23/28, опубл. 10.02.1998].

Недостатком данного способа является то, что при формировании афтозного стоматита не учитывается герпесвирусная составляющая патологического процесса.

В связи с этим задачей предлагаемого изобретения является разработка адекватной и информативной экспериментальной модели рецидивирующего герпес-индуцированного стоматита.

Техническим результатом предлагаемого нами изобретения является повышение воспроизводимости и приближение модели экспериментального рецидивирующего герпетического стоматита к клиническому течению данной патологии у человека.

Технический результат достигается тем, что в способе моделирования экспериментального рецидивирующего стоматита, включающем дозированное введение лабораторным мышам в течение заданного времени суспензии вируса простого герпеса 1 типа, осуществляют на фоне иммунодепрессии, вызываемой введением 0,2 мл гидрокортизона, вводимого экспериментальным животным за 2 часа до инфицирования, затем герпесвирусную суспензию вводят внутрибрюшинно двукратно в течение 3-х недель в дозе 1LD₅₀, через 21 день после первичного заражения проводят повторное инфицирование мышей путем скарифицирования слизистой полости рта и внесения на поврежденную слизистую 30 мкл суспензии ВПГ-1 в дозе 1 LD₅₀

Заявляемый способ обладает новизной в сравнении с прототипами, отличаясь от них таким существенным признаком как использование в модельных исследованиях вышеперечисленных патента - прототипа афтозной смеси, которую вводят интактным животным с целью активации аутоиммунных процессов с последующим образованием афт. При этом следует отметить, что полностью исключается основой этиологический фактор герпесвирусного рецидивирующего стоматита - герпесвирусная инфекция.

Заявителю неизвестны технические решения, обладающие указанным отличительным признаком, обеспечивающим заданный результат, поэтому он считает, что заявляемый способ соответствует критерию «изобретательский уровень».

Заявляемый способ может найти широкое применение в медицине, а именно вирусологии, стоматологии и экспериментальной фармакологии, а потому соответствует критерию «промышленная применимость».

Заявляемый способ реализуют следующим образом:

Способ моделирования экспериментального рецидивирующего герпетического стоматита, включающий дозированное применение суспензии вируса простого герпеса (ВПГ-1, штамм УС). Предварительно обеспечивают иммунодепрессию, вызываемую гидрокортизоном, вводимым экспериментальным животным за 2 часа до инфицирования. Суспензию вируса вводят мышам в течение заданного времени внутрибрюшинно в дозе 1ЛД50, через 21 день после развития герпетической инфекции, не погибшим животным повторно в рану поврежденной скарификатором слизистой оболочки полости рта вносят 30 мкл суспензии ВПГ-1 в вышеназванной дозе, вызывающей развитие герпетического рецидивирующего стоматита на 6-7 сут.

Проведенные исследования иллюстрируются следующими примерами.

Пример

Для определения кратности и дозы введения суспензии вируса простого герпеса первого типа (ВПГ-1) при моделировании хронического герпетического рецидивирующего стоматита был проведен эксперимент на мелких лабораторных животных, а именно на белых беспородных мышах-самцах массой 16-18 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария на обычном пищевом рационе, со свободным доступом к воде.

Для моделирования герпетической инфекции использовали вирус герпеса простого (ВГП) 1 типа, штамм УС, исходный титр вируса 10²-10³ ЛД₅₀/мл или ВГП 2 типа, штамм ВН, исходный титр вируса 10²-10³ ЛД₅₀/мл. Исследования выполнены на белых беспородных мышах, полученных из питомника «Рапполово» РАН (Ленинградская область). Всего в исследованиях было использовано 300 белых беспородных мышей-самцов массой 16-18 г. Опыты проводили на животных, в обязательном порядке выдержавших карантин в течение 1 нед. Для внутримозгового накопления модельного вируса, а также определения инфекционной активности вируссодержащего материала использовали мышей-сосунков. Накопление ВПГ проводили посредством интрацеребрального заражения мышей-сосунков. Инфекционную активность вируссодержащих материалов определяли по методу Рида-Менча титрованием на мышах-сосунках. Величину LD₅₀ применительно к каждому возбудителю определяли на белых беспородных мышах с расчетом этого критерия по методу Кербера в модификации И.П. Ашмарина и А.А. Воробьева (1962).

Моделирование герпетической инфекции осуществляли путем внутрибрюшинного введения животным суспензии ВПГ 1 типа или ВГП 2 типа в объеме 0,5 мл. За 2 ч перед заражением животным в целях понижения естественной резистентности внутримышечно вводили 0,2 мл гидрокортизона. Численность опытных и контрольных групп составляла по 30 мышей в каждой.

Статистический анализ результатов исследования. Определение значимости различий показателей между сравниваемыми выборками проводили с использованием параметрического критерия t-Стьюдента. Различия в сравниваемых группах считались достоверными при уровне значимости 95% (р<0,05). Процент выживших животных в подопытных и контрольных группах определяли по таблицам Генеса B.C. При этом наблюдение за инфицированными животными проводили в течение 21 сут., ежедневно регистрируя число живых и павших в подопытных и контрольных группах.

Оценка результатов проведенного моделирования включала наблюдение за общим состоянием животных и изучение состояния слизистой оболочки полости рта, которое проводилось с использованием клинических и микробиологических методов. При визуальном и инструментальном исследовании оценивались такие признаки как: гиперемия, отечность, слизистой, атрофические и язвенно-некротические процессы. Индексная оценка осуществлялась с использованием пробы Шиллера-Писарева (интенсивность воспалительного процесса) и показателя кровоточивости десны. Проводилось измерение количества десневой жидкости.

С использованием бактериологических методов проводили оценку качественных и количественных изменений в микрофлоре слизистой полости рта.

Ежедневно оценивали общее состояние (двигательную активность и пищевую возбудимость, изменение массы тела) и клиническую картину стоматита. Оценку клинической картины герпетического стоматита проводили по наличию и выраженности таких признаков как гиперемия, отечность слизистой оболочки полости рта, атрофические и язвенно-некротические процессы.

Изучение влияния повреждающих факторов герпетического воздействия на выраженность воспалительных процессов в слизистой оболочке полости рта белых беспородных крыс проводили с использованием пробы Шиллера-Писарева, позволяющей оценить интенсивность воспалительного процесса, и показателя кровоточивости десен, а также путем измерения количества десневой (ротовой) жидкости с помощью взвешивания фильтровальной бумаги до и после сорбирования на ней исследуемой жидкости.

1. Отбор материала для биохимических исследований проводили до химиолучевого воздействия, на 15 сут после введения ВПГ-1. Для этого животных подвергали эвтаназии методом декапитации под действием анестетиков, извлекали слизистую оболочку полости рта (в районе языка и щек) с под слизистым мышечным слоем и замораживали в жидком азоте. В гомогенатах слизистой оболочки полости рта и подлежащих мягких тканей определяли продукты перекисного окисления липидов - малоновый диальдегид методом [Michara, М. Determination of malon aldehyde precursor in tissues by thio barbituric acid test / M. Michara, M. Uchiyama // Ann. Biochem. - 1978. - Vol. 86, №1. - P. 271-278] и диеновые конъюгаты с помощью метода [Гаврилов, В.Б. Измерение диеновых конъюгатов в плазме крови по УФ-поглощению гептановых и изопропанольных экстрактов / В.Б. Гаврилов, А.Р. Гаврилова, Н.Ф. Хмара // Лаб. дело. - 1998. - №2. - С. 60-64], а также изучали активность ферментов антиоксидантной системы - супероксиддисмутазы методом [Костюк, В.А. Простой и чувствительный метод определения активности супероксиддисмутазы, основанный на реакции окисления кверцитина / В.А. Костюк, А.И. Потапович, Ж.В. Ковалева // Вопр. мед. химии. - 1990. - Т. 36, вып. 2. - С. 88-91], каталазы по методу [Королюк, М.А. Метод определения активности каталазы / М.А. Королюк, Л.И. Иванова, И.Г. Майорова [и др.] // Лаб. дело. - 1988. - №1. - С. 16-58] и глутатион-пероксидазы с помощью метода [Гаврилова, А.Р. Определение активности глутатионпероксидазы эритроцитов при насыщающих концентрациях субстратов / А.Р. Гаврилова, Н.Ф. Хмара // Лаб. дело. - 1986. - №12. - С. 721-724].

Получение материала для микробиологических исследований осуществляли при помощи стерильных тампонов. Мазок делали непосредственно с поверхности слизистой оболочки полости рта (языка и десен). Далее тампон помещали в пробирку со стерильным физиологическим раствором (1 мл), из которого в последующем готовили разведения 1:10, 1:100, 1:1000. Содержимое пробирок от каждого разведения высевали на питательные среды: Эндо, Плоскирева, Сабуро, Вильсон-Блера, Клиглера, энтерококковый агар, 5% кровяной агар, кровяной анаэробный бактоагар, агар для лактобактерий, агар для бифидобактерий, мясо-пептонный агар, желточно-солевой агар, агаризованная среда Гаузе №2, среда для контроля стерильности, обогащенная 10% среды 199. Для культивирования анаэробных микроорганизмов использовали микроанаэростаты «Anaerobicplussystem» (Oxoid, Великобритания). Результаты микробиологических исследований выражали в колониеобразующих единицах (КОЕ), а именно в десятичном логарифме, взятом от количества КОЕ в сроки до введения ВПГ-1 и на 15 сут после.

Оценка результатов проведенного моделирования включала наблюдение за общим состоянием животных и изучение состояния слизистой оболочки полости рта, которое проводилось с использованием клинических и микробиологических методов. При визуальном и инструментальном исследовании оценивались такие признаки как: гиперемия, отечность, слизистой, атрофические и язвенно-некротические процессы. Индексная оценка осуществлялась с использованием пробы Шиллера-Писарева (интенсивность воспалительного процесса) и показателя кровоточивости десны. Проводилось измерение количества десневой жидкости.

С использованием бактериологических методов проводили оценку качественных и количественных изменений в микрофлоре слизистой полости рта.

Пример 1. Влияние герпетической инфекции на стоматологический статус лабораторных животных

Животные первой группы (интактные) в течение всего периода наблюдения вели себя спокойно, хорошо поедали корм, имели блестящий шерстяной покров. Вес мышей до эксперимента и после был в пределах 18,0-22,0 грамм. При обследовании полости рта слизистая оболочка десны была бледно-розовая, без эрозий и изъязвлений, налет на зубах отсутствовал. Межзубные сосочки в области нижних резцов были остроконечные, плотно прилегали к зубам. Зубодесневое соединение не нарушалось, кровоточивости десен не наблюдалось, маргинальная десна плотно охватывала шейки зубов. Проба Шиллера-Писарева составляла 0,17±0,06, что свидетельствовало о практическом отсутствии воспаления. Кровоточивость отсутствовала. Количество десневой жидкости составило 0,47±0,002 мг (табл. 1).

Введение экспериментальным животным ВПГ-1 сопровождалось развитием воспалительных процессов в слизистой оболочке полости рта. При этом показатель пробы Шиллера-Писарева возрос почти на порядок (с 0,17 до 1,5 единиц). Следует отметить, что к 7 сут после инфицирования возросла кровоточивость десен (в среднем в 3 раза), появились признаки ксеростомии. Так количество десневой жидкости снизилось по сравнению с уровнем контрольных величин в среднем в 2 раза. Более выраженные нарушения выявлены в стоматологическом статусе крыс, подвергнутых комбинированному химиолучевому воздействию. Так величина показателя, характеризующего воспалительные процессы в слизистой оболочке полости рта (СОПР) (проба Шиллера-Писарева) увеличилась более, чем в 15 раз. При этом нарастала кровоточивость и ксеростомия. Следует отметить, что наиболее выраженные сдвиги в воспалительных процессах с последующим развитием герпетического стоматита были выявлены при воздействии на организм экспериментальных животных двух повреждающих факторов: иммунодепрессанта -гидрокортизона и вируса герпеса простого первого типа. Напомним, что в условиях их изолированного действия ни один из вышеперечисленных факторов не вызывал развитие эпителиита. Так величина показателя воспаления СОПР достоверно возросла по сравнению уровнем изолированного герпетического поражения. Кроме того дополнительное герпетическое поражение слизистой привело к умеренному росту ксеростомии. У животных развился сливной эпителиит и эрозивно-язвенный стоматит.

*р<0,05 - по сравнению с уровнем интактного контроля; количество животных в каждой группе n=20; ГК - гидрокортизон 0,2 мл внутримышечно за 2 ч до инфицирования; ВПГ-1 (в/бр) - инфицирование животных внутрибрюшинным введением ВПГ-1 вирус простого герпеса 1 типа 1ЛД₅₀; инфицирование животных введением 30 мкл ВГП-1 - вирус простого герпеса 1 типа 1ЛД₅₀ в слизистую оболочку полости рта (СОПР)

Пример 2. Влияние повреждающих факторов герпесвирусного воздействия на процессы перекисного окисления липидов слизистой оболочки полости рта белых беспородных мышей

Универсальный характер процессов пероксидации липидов обусловливает их повсеместное распространение во всех активно метаболизирующих системах. Лишь наличие факторов противоположного действия - антиоксидантной системы позволяет клетке находиться в прооксидантно-антиоксидантном равновесии, которое может изменяться в условиях оксидативного стресса. Данные о состоянии свободно-радикальных процессов в СОПР в условиях экспериментального герпетического стоматита в литературе практически не представлены.

В связи с этим, задачей этого этапа исследования явилась экспериментальная оценка влияния комбинированного герпесвирусного инфицирования на фоне гидрокортизоновой иммунодепрессии на интенсивность окислительно-восстановительных процессов в слизистой оболочке полости рта мелких лабораторных животных.

В результате проведенных исследований установлено, что герпевирусное воздействие способствует активации процессов ПОЛ в слизистой оболочке полости рта белых беспородных мышей (табл. 2).

Так, на 15 сут после инфицирования животных выявлено повышение содержания продуктов окислительной деградации липидов - диеновых конъюгатов (в 1,46 раза) и малонового диальдегида (в 1,57 раза) по сравнению с исходным уровнем этих показателей, зарегистрированным у животных контрольной группы (табл. 2).

Таблица 2 - Влияние повреждающих факторов герпесвирусной инфекции на выраженность процессов перекисного окисления липидов в слизистой оболочке полости рта белых беспородных мышей

Примечание: * р<0,05 - по сравнению с уровнем до воздействия (по критерию Стьюдента); количество животных в каждой группе n=20.

*р<0,05 - по сравнению с уровнем интактного контроля; количество животных в каждой группе n=20; ГК - гидрокортизон 0,2 мл внутримышечно за 2 ч до инфицирования; ВПГ-1 (в/бр) - инфицирование животных внутрибрюшинным введением ВПГ-1 вирус простого герпеса 1 типа 1ЛД₅₀; инфицирование животных введением 30 мкл ВГП-1 - вирус простого герпеса 1 типа 1ЛД₅₀ в слизистую оболочку полости рта (СОПР)

Выявленные сдвиги, по-видимому, были обусловлены нарушениями в системе антиоксидантной защиты: в этот же период наблюдалось умеренное (на 25-30%) угнетение активности каталазы, тенденция к снижению активности глутатионпероксидазы, а активность супероксиддисмутазы практически не изменялась.

На 15 сут наблюдения, на фоне сформировавшегося герпетического стоматита содержание продуктов перекисного окисления липидов - диеновых конъюгатов и малонового диальдегида повышалось (в среднем на 65-70% по сравнению с уровнем интактных животных). При этом активность супероксиддисмутазы практически не изменялась, активность каталазы была снижена на 40%, а активность глутатионпероксидазы, напротив, была выше уровня интактных животных более чем на 30% (табл. 2).

Таким образом, избыточная пероксидация липидов в слизистой оболочке полости рта лабораторных животных явилась одной из возможных причин формирования воспалительных процессов. Подтверждением тому является рост индекса пробы Шиллера-Писарева, кровоточивость десен и развитие ксеростомии (табл. 1).

Пример 3. Влияние повреждающих факторов герпесвирусного воздействия на состояние микробиоценоза слизистой оболочки полости рта белых беспородных мышей

2. В настоящее время общепризнанным фактом является значимая роль микрофлоры в развитии инфекционно-воспалительных заболеваний слизистой оболочки полости рта [Левицкий, А.П. Физиологическая микробная система полости рта / А.П. Левицкий // Вестн. стоматологии. - 2007. - №1. - С. 6-11. Рабинович, О.Ф. Изменение микробной флоры при патологии слизистой оболочки рта / О.Ф. Рабинович, И.М. Рабинович, Е.С. Абрамова // Стоматология. - 2011. - №6. - С. 71-76.] Однако остается спорным вопрос о роли нарушений микробиоценоза СОПР в патогенезе герпетического рецидивирующего стоматита.

В связи с этим, задачей данного этапа исследований, результаты которых представлены в настоящем разделе, явилось изучение состояние микробиоценоза слизистой оболочки полости рта мелких лабораторных животных, подвергшихся воздействию вируса простого герпеса 1 типа.

Отбор материала для микробиологических исследований проводили до герпесвирусного воздействия и на 15 сутки после. Результаты исследований выражали в колониеобразующих единицах (КОЕ), а именно в десятичном логарифме, взятом от количества КОЕ (табл. 3).

Проведенные исследования показали, что развитие герпетического стоматита сопровождалось значительным повышением уровня микробной обсемененности слизистой оболочки полости рта (табл. 3).

Установлено, что у интактных животных в отобранных пробах со слизистой оболочки полости рта высевались β-гемолитический стрептококк (2,4±0,25), негемолитический стрептококк (1,9±0,1), стафилококки (2,0±0,1), а так же энтеробактерии и анаэробы (до 60-80 клеток в мазке).

На 15 сут после инфицирования мышей герпесвирусом 1 типа количество колоний β-гемолитического стрептококка, негемолитического стрептококка и стафилококка возросло в среднем в 2-2,5 раза по сравнению с животными, не подвергавшимися инфицированию. Еще более выраженные изменения выявлены в уровне микробной обсемененности энтеробактериями (в 3,5 раза), анаэробами (в 3,4 раза) и кандидами (в среднем в 3 раза).

Примечание: * р<0,05 - по сравнению с уровнем до воздействия (по критерию Стьюдента); ^# р<0,05 - по сравнению с интактными (по критерию Стьюдента); количество животных в каждой группе n=30.

ГК - гидрокортизон 0,2 мл внутримышечно за 2 ч до инфицирования; ВПГ-1 (в/бр) - инфицирование животных внутрибрюшинным введением 0,5 мл ВПГ-1 вирус простого герпеса 1 типа 1ЛД₅₀; инфицирование животных введением 30 мкл ВГП-1 - вирус простого герпеса 1 типа 1ЛД₅₀ в слизистую оболочку полости рта (СОПР)

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о возможном свободно-радикальном генезе нарушения микробиоценоза СОПР с преобладанием колонизации дрожжевыми грибами С. albicans и С. Glabrata.