Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НАЛИЧИЯ ЦИАНИДИН-3-О-ГЛЮКОЗИДА В БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОЙ ЖИДКОСТИ

Изобретение относится к производству алкогольных и безалкогольных напитков и может быть использовано в центрах контроля качества указанной продукции, а также соков, и контрольно-аналитических лабораториях при проведении анализа антоцианов в таких продуктах как красные вина, окрашенные водки, соки, а также во фруктовых напитках, содержащих в себе сок плодов черники обыкновенной, аронии черноплодной, смородины черной и т.д.

В настоящее время актуальной проблемой является выявление фальсификатов алкогольной и безалкогольной продукции, а также соков, поступающих на потребительский рынок. Контроль качества соков осуществляют в соответствии со Сводом правил для оценки качества фруктовых и овощных соков Ассоциации соковой промышленности Европейского Союза (свод правил AIJN). В этом документе приведены физико-химические показатели, количественные значения которых обоснованы природными свойствами сырья, но для окрашенных соков недостаточно знать только аминокислотный, углеводный, микро- и макроэлементный состав, содержание органических кислот.

Окрашенные плоды отличаются наличием антоцианов - соединений, обуславливающих их окраску и обладающих высокой антиоксидантной активностью. Согласно проведенным исследованиям основным антоцианом окрашивающих плодов является цианидин-3-О-глюкозид. Подробное описание природных антоцианов представлено в работе Куркиной А.В. [1], а именно: «Антоцианы представляют собой широко распространенную группу природных БАС, обладающих антиоксидантными, вазопротективными, антикоагуляционными свойствами, способностью улучшать микроциркуляцию, трофику сетчатки глаза, а также, в некоторых исследованиях in vitro, показавших противоопухолевую активность.

Антоцианы относятся к флавоноидам и по химической природе являются гликозилированной формой гидрокси- и метоксизамещенных производных 2-фенилхромена (антоцианидинов). Для антоцианов известна способность менять свою окраску в зависимости от значения рН среды. В кислой среде (рН<3) они присутствуют в растворе в виде бензопирилиевых солей красного цвета. При повышении рН 4-5 происходит присоединение гидроксильной группы во втором положении с образованием бесцветного псевдооснования. При рН 6-7 образуются феноляты синего цвета. При рН более 8,0 происходит размыкание хроменового цикла и образуется соответствующий халкон» [1].

Известен способ количественного определения антоцианов в лекарственном растительном сырье, результат достигается тем, что способ осуществляют путем извлечения антоцианов из лекарственного растительного сырья водно-спиртовыми смесями, содержащими 0,5-1,0% кислоты хлороводородной, с концентрацией спирта этилового не менее 70% и определения количественного содержания антоцианов по оптической плотности в 95% этиловом спирте, содержащем 0,5% аммиака, на фоне раствора сравнения при аналитической длине волны максимума поглощения в диапазоне 611-630 нм с использованием раствора стандартного образца цианидина-3-глюкозида или с использованием значения его удельного показателя поглощения в 95% этиловом спирте, содержащем 0,5% аммиака (Патент RU 2557953).

Приготовление экстракта натурального антоциана осуществляется следующим образом. Около 1,0 сырья (точная навеска) помещают в коническую колбу со шлифом вместимостью 100 мл, добавляют 50 мл 95% этилового спирта, содержащего 1% хлороводородной кислоты. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на аналитических весах с точностью до ±0,01 г. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 30 мин. Затем закрывают той же пробкой, охлаждают до комнатной температуры. После чего колбу снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр и содержимое перемешивают.5 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят 0,5% раствором аммиака в 95% спирте этиловом до метки. В качестве раствора сравнения используют раствор, приготовленный при тех же условиях, но доведенный до метки 95% спиртом этиловым. Оптическую плотность измеряют в течение 1 мин после приготовления раствора при аналитической длине волны 623 нм.

Однако, данный метод характеризуется высокой трудоемкостью, особенно в процессе пробоподготовки на стадии приготовления буферных растворов. Также нами был отмечен в ходе воспроизведения данной методики ряд ограничений, в частности, для некоторых анализируемых проб, в которых красящее вещество (антоциан) подменено синтетическим красителем и не экстрагируется растворителем специфичным для цианидин-3-О-глюкозида, что приводит к искажению результатов и необходимости длительного исследования природы неизвестного красителя, замещающего цианидин-3-О-глюкозид.

Таким образом, целью изобретения является разработка нового способа идентификации красящего вещества в таких продуктах как красные вина, окрашенные водки, соки, а также во фруктовых напитках, содержащих в себе сок плодов черники обыкновенной, аронии черноплодной, смородины черной и т.д.

Техническим результатом является повышение достоверности полученных результатов, уменьшение продолжительности и стоимости способа идентификации антоцианов в красных винах, окрашенных водках, соках, а также во фруктовых напитках, содержащих в себе сок плодов черники обыкновенной, аронии черноплодной, смородины черной и т.д.

Данный технический результат достигается за счет того, что метод определения наличия антоцианов в биотехнологических средах, заключается в размещении исследуемого образца биотехнологической жидкости (вино, соки, напитки и др.) в кювете применяемого средства измерения для проведения спектрального анализа образца с последующим сравнением полученного результата со спектром натурального антоциана. Перед размещением образца в кювете проводят пробоподготовку, заключающуюся в разбавлении образца подкисленным раствором этилового спирта, объемная концентрация которого соответствует заявленному производителем значению, до оптической плотности соответствующей разрешающей способности средства измерения, оптической плотности раствора сравнения цианидина-3-О-глюкозида при 650 нм.. Спектральный анализ для получения характерных кривых проводят в широком диапазоне длин волн от 350 до 650 нм для обнаружения натурального антоциана - цианидина 3-О-глюкозида, максимальный пик которого находится в точке 520 нм.

Величина водородного показателя (рН) устанавливается в соответствии с ГОСТом, указанным на этикетке емкости с исследуемым образцом. При этом кислотность может достигаться добавлением соляной кислоты.

В диапазоне от 350-650 нм метод позволяет определять наличие натуральных антоцианов различных плодов, содержащих характерные флавоноиды. Спектры синтетических красителей значительно отличаются от спектров натуральных образцов антоцианов.

При осуществлении данного метода выполняют спектральный анализ исследуемого образца и натурального образца цианидина-3-О-глюкозида. После чего проводят сравнительный анализа характерных кривых, полученных в ходе исследования.

Для этого отбирают две одинаковые аликвоты и помещают в две мерные колбы. В одной проба из исследуемого образца, которую разбавляют до оптической плотности стандартного раствора антоциана - цианидина-3-О-глюкозида при длине волны 650 нм. Разбавление производят 8% раствором этилового спирта, подкисленным соляной кислотой до рН=3,5. Пробу помещают в кювету с толщиной рабочего слоя 10 мм. Во второй колбе - стандартный раствор сравнения. Для чего навеску цианидина-3-О-глюкозида в количестве 0,02 г помещают в мерную колбу объемом 50 мл, растворяют в этиловом спирте, содержащем 1% соляной кислоты и перемешивают.5 мл полученного раствора помещают в колбу объемом 25 мл, доводят до метки 8% этиловым спиртом подкисленным раствором соляной кислотой до рН=3,5.

Коэффициент пропускания в диапазоне от 350 до 650 нм каждого из двух образцов определяют с помощью спектрофотометра. Измерения проводят с шагом 1 нм и средней скоростью сканирования. Осуществляют сравнение полученных спектров. Совпадение экстремумов спектра исследуемого образца со стандартным образцом сравнения подтверждает наличие антоцианов в пробе.

При анализе известных решений в научной литературе, не было обнаружено результатов исследований по цианидину-3-О-глюкозиду в выбранном нами направлении и соответственно сведений о влиянии параметров экстракции, пробоподготовки на достижение технического решения.

При использовании образца сравнения может быть проведен расчет результатов количественного определения суммы антоцианов в пересчете на цианидин-3-О-глюкозид проводят по формуле 1:

где: Ах - оптическая плотность исследуемого образца;

Ast - оптическая плотность раствора стандартного образца;

mx - точная навеска исследуемого образца;

mst -точная навеска цианидин-3-О-глюкозида;

ах - аликвота исследуемого раствора;

V1 - объем мерной колбы;

V2 - объем исследуемого образца.

Метод иллюстрируется примерами, отображенными на Фигурах 1-7.

Пример 1. Специфические кривые зависимости длины волны от светопропускания, полученные при спекрофотометрировании образца антоцианов, экстрагированного из свежих плодов черники обыкновенной, Vaccinium myrtillus L., семейство Вересковые - Ericaceae, с использованием раствора стандартного образца цианидина-3-О-глюкозида (антоциана) (испытания проводятся в нескольких повторностях) в диапазоне длин волн от 350-650 нм (Фигура 1);

Пример 2. Специфические кривые, полученные при спекрофотометрировании образца антоцианов, экстрагированного из свежих плодов Vitis vinifera L, cv. Изабелла с использованием раствора стандартного образца цианидина-3-О-глюкозида (антоциана) (испытания проводятся в нескольких повторностях) в диапазоне длин волн от 350-650 нм (Фигура 2).

Пример 3. Специфические кривые, полученные при спекрофотометрировании образца антоцианов, экстрагированного из свежих плодов Vitis vinifera L, cv. Молдова с использованием раствора стандартного образца цианидина-3-О-глюкозида (антоциана) (испытания проводятся в нескольких повторностях) в диапазоне длин волн от 350-650 нм (Фигура 3).

Пример 4. Специфические кривые, полученные при спекрофотометрировании образца антоцианов, экстрагированного из плодов ежевики обыкновенной, с использованием раствора стандартного образца цианидина-3-О-глюкозида (антоциана) (испытания проводятся в нескольких повторностях) в диапазоне длин волн от 350-650 нм (Фигура 4).

Пример 5. Специфические кривые, полученные при спекрофотометрировании образца антоцианов, экстрагированного из плодов свежих обыкновенной Vaccinium myrtillus L., семейство Вересковые - Ericaceae, рябина черноплодная с использованием раствора стандартного образца цианидина-3-О-глюкозида (антоциана) (испытания проводятся в нескольких повторностях) в диапазоне длин волн от 350-650 нм (Фигура 5).

Пример 6. Специфические кривые, полученные при спекрофотометрировании образца антоцианов, экстрагированного из Гибискус сабдариффа (Hibiscus sabdariffa), относится к семейству мальвовых (каркаде), с использованием раствора стандартного образца цианидина-3-О-глюкозида (антоциана) (испытания проводятся в нескольких повторностях) в диапазоне длин волн от 350-650 нм (Фигура 6).

Пример 7. Специфические кривые, полученные при спекрофотометрировании образца антоцианов, экстрагированного из плодов сливы домашней свежих , с использованием раствора стандартного образца цианидина-3-О-глюкозида (антоциана) (испытания проводятся в нескольких повторностях) в диапазоне длин волн от 350 - 650 нм (Фигура 7).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Куркина А.В. Экспериментально-теоретическое обоснование подходов к стандартизации сырья и препаратов фармакопейных растений, содержащих флавоноиды // Диссертация на соискание ученой степени д.фарм.н., 2013.

2. Патент RU 2557953: G01N 33/15 Авторы патента: Куркина Анна Владимировна (RU), Куркин Владимир Александрович (RU), Егорова Анна Владимировна (RU), Рязанова Татьяна Константиновна (RU).

3. ГОСТ Р 53773-2010 Продукция соковая. Методы определения антоцианинов.

4. О.Ю. Шоева Антоцианы: секреты цвета «Химия и жизнь» №1, 2013.