Определение активности классического пути системы комплемента в тесте коагуляции фибриногена

Система комплемента представляет собой механизм раннего реагирования, служащий для инициации и усиления воспалительной реакции в ответ на микробную инфекцию и другие острые повреждения [Liszewski М.K. and.Atkinson J.P., 1993, Fundamental Immunology, Third Edition, edited by W.E.Paul, Raven Press, Ltd., NewYork]. Несмотря на то, что активация комплемента обеспечивает весьма эффективную первичную защиту от потенциальных патогенов, активность комплемента, которая вызывает защитную воспалительную реакцию, может также представлять потенциальную угрозу для организма хозяина [Kalli K.R., Hsu P., Fearon D.T. Therapeutic uses of recombinant complement protein inhibitors // Springer Semin Immunopathol. - 1994. - V. 15, № 4. - P.417-31; Morgan B.P. Clinical complementology: recent progress and future trends // Eur J Clin Invest.- 1994. - V. 24, № 4. - P. 219-228]. Например, протеолитические продукты С3 и С5 мобилизуют и активируют полиморфноядерные нейтрофилы. Эти активированные клетки являются неспецифичными при выработке разрушающих ферментов и могут привести к поражению собственных органов. Кроме того, активация комплемента может привести к накоплению цитолитического комплекса, терминальных компонентов комплемента, как на микробных клетках-мишенях, так и на соседних клетках организма хозяина, что приводит к лизису клеток организма хозяина. Система комплемента принимает участие в патогенезе многочисленных острых и хронических заболеваний, включая: инфаркт миокарда, реваскуляризация вследствие нарушения мозгового кровообращения, респираторный дистресс-синдром у взрослых, поражение вследствие реперфузии, септический шок, капиллярное кровотечение вследствие термического ожога, воспаление вследствие кардио-легочного шунтирования, отторжение трансплантата, ревматоидный артрит, рассеянный склероз, прогрессирующая миастения, и болезнь Альцгеймера. Почти во всех перечисленных случаях комплемент не является непосредственной причиной данных заболеваниях, но представляет собой один из серьезных факторов, вовлеченных в патогенез. Тем не менее, активация комплемента может быть главным патологическим механизмом и представлять собой эффективный показатель для клинического контроля при многих указанных выше заболеваниях. Растущее признание важности комплемент-опосредованных поражений тканей при множестве болезней подчеркивает необходимость создания эффективных медикаментов для ингибирования комплемента. В настоящее время не существует официально одобренных для использования человеком медикаментов, которые бы имели специфическую нацеленность и ингибировали бы активацию комплемента.

Известно, что система комплемента может быть активирована тремя различными путями: классическим, лектиновым и альтернативным. Классический путь активации системы комплемента инициируется при связывании антитела с инородной частицей (т.е., антигеном) и, таким образом, требует предварительного воздействия данного антигена для генерации специфического антитела. Поскольку активация классического пути связана с развитием иммунной реакции, классический путь активации является частью приобретенной иммунной системы. В отличие от этого, лектиновый и альтернативный пути не зависят от клонального иммунитета и являются частью врожденной иммунной системы.

Первым шагом в активации классического пути является прикрепление специфической молекулы распознавания, C1q, к антигенно-нагруженным элементам IgG и IgM. Результатом активации системы комплемента является последовательная активация зимогенов сериновой протеазы. C1q связан с проферментами сериновой протеазы C1r и C1s в комплексе, известном как компонент C1, при связывании C1q с иммунным комплексом, аутопротеолитическое расщепление участка Arg-Ile субкомпонента C1r сопровождается активацией C1s, которая необходима для расщепления компонентов С4 и С2. Расщепление С4 на два фрагмента, обозначенных соответственно С4а и C4b, позволяет фрагментам C4b сформировать ковалентные связи с примыкающим гидроксильными или амино-группами на поверхности патогена посредством нековалентного взаимодействия с фрагментом C4b компонента С2, расщепления под действием С1s и последующей генерацией конвертазы С3 (C4b2a).

С3-конвертаза (C4b2a) активирует компонент С3, который вызывает генерацию С5-конвертазы (C4b2a3b) и формирование мембрано-атакующего комплекса (C5b-9), что может спровоцировать микробный лизис. Активированные формы С3 и С4 (C3b и C4b) ковалентно связываются на чужеродных поверхностях и опсонизируют их для распознования рецепторами комплемента-1 (CR-1) на фагоцитах.

Первым шагом в активации системы комплемента по лектиновому пути также является прикрепление специфической молекулы распознавания, за которым следует активация ассоциированных сериновых протеаз. Однако более верным, чем прикрепление к иммунным комплексам при помощи C1q, является то, что молекулы распознавания в лектиновом пути активации представляют собой белки, связывающие углеводы (маннан-связывающий лектин (МСЛ), Н-фиколин, М-фиколин, и L- фиколин) [Lu J., Teh C., Kishore U., Reid K.B. Collectins and ficolins: sugar pattern recognition molecules of the mammalian innate immune system // Biochim Biophys Acta. - 2002 .- V. 1572, №(2-3).- P. 387-400: Holmskov U., Thiel S., Jensenius J.C. Collections and ficolins: humoral lectins of the innate immune defense // Annu Rev Immunol. - 2003.- V. 21.- P. 547-78; The C., Le Y., Lee S.H., Lu J.. M-ficolin is expressed on monocytes and is a lectin binding to N-acetyl-D-glucosamine and mediates monocyte adhesion and phagocytosis of Escherichia coli // Immunology. - 2000. - V. 101, №2. - P. 225-232].

Икеда и соавторы первыми продемонстрировали, что подобно молекуле C1q, МСЛ может активировать систему комплемента С4-зависимым путем, прикрепляясь к эритроцитам, покрытыми маннанами дрожжей [Ikeda K., Sannoh T., Kawasaki N., Kawasaki T., Yamashina I. Serum lectin with known structure activates complement through the classical pathway // J Biol Chem. - 1987. - V. 262, №16. - P. 7451-4]. МСЛ, член семейства коллектиновых белков, представляет собой кальций-зависимый лектин, который связывает углеводы с гидроксильными группами в 3 и 4 положении, ориентированными в экваториальной плоскости пиранозного кольца. Главными лигандами для МСЛ являются, таким образом, D-манноза и N-ацетил-D-глюкозамин, в то время как для углеводов, не соответствующих подобному стерическому требованию, афинность по отношению к МСЛ не выявлена [Weis W.I., Drickamer K., Hendrickson W.A. Structure of a C-type mannose-binding protein complexed with an oligosaccharide // Nature. - 1992. - V. 360, №6400. - P. 127-134]. Взаимодействие между МСЛ и моновалентными сахарами является чрезвычайно слабым, с типичными константами диссоциации порядка 2 ммоль. МСЛ достигает стойкого специфичного связывания с полисахаридными лигандами в процессе одновременного взаимодействия с множественными остатками моносахаридов [Lee R.T., IchikawaY., Kawasaki T., Drickamer K., Lee Y.C. Multivalent ligand binding by serum mannose-binding protein // Arch Biochem Biophys. - 1992. - V. 299, № 1. - V. 129-136]. МСЛ распознает углеводные структуры, которые обычно покрывают микроорганизмы, такие как бактерии, дрожжи, паразиты и некоторые вирусы. Однако МСЛ не распознает D-галактозу и сиаловую кислоту, которые обычно покрывают «зрелый» гликоконъюгатный комплекс гликопротеинов, присутствующих в плазме млекопитающих и находящихся на поверхности их клеток. Данная специфичность связывания может помочь в защите от самопроизвольной активации. Однако МСЛ не образует высокоаффинных связей со скоплениями высокоразветвленныхманнозных предшественников гликанов на N-связанных гликопротеинах и гликолипидах, находящихся в эндоплазмическомретикулуме и звездчатых невроцитах (Гольджи) клеток млекопитающих [Maynard Y., Baenziger J.U. Characterization of a mannose and N-acetylglucosamine-specific lectin present in rat hepatocytes // J Biol Chem. - 1982. - V. 257, № 7. - P. 3788-94]. Следовательно, поврежденные клетки являются потенциальными мишенями для лектинового пути активации посредством МСЛ-связывания.

Фиколины обладают отличным от МСЛ типом лектинового домена, известным как фибриноген-подобный домен. Фиколины связывают остатки сахара Са²⁺-независимым образом. У людей идентифицировано три типа фиколинов: L-фиколин, М-фиколин и Н-фиколин. Два сывороточных фиколина, L-фиколин и Н-фиколин имеют общность в специфичности к N-ацетил-D-глюкозамину; однако Н-фиколин также связывается с N-ацетил-D-галактозамином. Специфичность по отношению к различным сахарам у L-фиколина, Н-фиколина и МСЛ означает, что различные лектины могут быть комплементарны различным, хотя и частично перекрывающимся гликоконъюгатам. Данная концепция поддерживается недавним сообщением о том, что среди известных лектинов, принимающих участие в лектиновом пути активации, только L-фиколин специфическим образом связывается с липотейхоевой кислотой, гликоконъюгатом клеточной стенки, обнаруженным во всех Грамм-положительных бактериях [Lynch N.J., Roscher S., Hartung T., Morath S., Matsushita M., Maennel D.N., Kuraya M., Fujita T., Schwaeble W.J. L-ficolin specifically binds to lipoteichoic acid, a cell wall constituent of Gram-positive bacteria, and activates the lectin pathway of complement // J Immunol. - 2004. - V.172, №2. - P. 1198-11202]. Коллектины, то есть, МСЛ и фиколины, не имеют значительного сходства в аминокислотной последовательности. Однако эти две группы белков имеют схожие организации доменов и, подобно Clq, собираются в олигомерные структуры, которые максимально увеличивают возможность многосайтового связывания. У здоровых людей концентрация МСЛ в сыворотке сильно варьирует в популяциях, и он генетически контролируется полиморфизмом или мутациями как в промоторе, так и в кодирующей области гена МСЛ.

Так как белок МСЛ является белком острой фазы, то его дальнейшая экспрессия регулируется во время воспалительного процесса. L-фиколин присутствует в сыворотке в такой же концентрации, как и МСЛ. Поэтому, роль L-фиколина в лектиновом пути активации по значимости потенциально сравнима с ролью МСЛ. МСЛ и фиколины могут также выступать в роли опсонинов, которые требуют взаимодействия между данными белками и рецепторами фагоцитов [Kuhlman M., Joiner K., Ezekowitz R.A. The human mannose-binding protein functions as an opsonin // J Exp Med. - 1989. - V. 169, № 5. - P. 1733-45; Matsushita M., Endo Y., Taira S., Sato Y., Fujita T., Ichikawa N., Nakata M., Mizuochi T. A novel human serum lectin with collagen- and fibrinogen-like domains that functions as an opsonin // J Biol Chem. - 1996. - V. 271, №5 - P. 2448-54]. Однако идентичность рецептора на клетках-фагоцитах не была установлена. МСЛ человека при помощи своего коллагено-подобного домена осуществляет высокоаффинное специфичное взаимодействие с уникальными Clr/Cls-подобными сериновыми протеазами, названными МСЛ-ассоциированными сериновыми протеазами (МАСП). К настоящему времени описано три типа МАСП. Сначала одиночный фермент «МАСП» был идентифицирован и охарактеризован как фермент, отвечающий за инициацию классического пути активации комплемента (т.е., расщепление С2 и С4) [Ji Y.Н., Fujita T., Hatsuse H., Takahashi A., Matsushita M., Kawakami M. Activation of the C4 and C2 components of complement by a proteinase in serum bactericidal factor, Ra reactive factor. J. Immunol. 150:571-578, 1993]. Позже выяснилось, что МАСП на самом деле представляет собой комбинацию двух протеаз: МАСП-1 и МАСП-2 [Thiel S., Vorup-Jensen T., Stover C.M., Schwaeble W., Laursen S.B., Poulsen K., Willis A.C., Eggleton P., Hansen S., Holmskov U., Reid K.B., Jensenius J.C. A second serine protease associated with mannan-binding lectin that activates complement Nature. 1997 Apr 3; 386(6624):506-10]. Однако было продемонстрировано, что комплекс МСЛ-МАСП-2 сам по себе является достаточным для активации комплемента [Vorup-Jensen T., Petersen S.V., Hansen A.G., Poulsen K., Schwaeble W., Sim R.B, Reid K.B., Davis S.J., Thiel S., Jensenius J.C. Distinct pathways of mannan-binding lectin (MBL)- and C1-complex autoactivation revealed by reconstitution of MBL with recombinant MBL-associated serine protease-2. J Immunol. 2000 Aug 15; 165(4):2093-20100]. Кроме того, только МАСП-2 расщеплял С2 и С4 с высокой эффективностью [Ambrus G., Gál P., Kojima M., K., Balczer J., Antal J., Laich A., Moffatt B.E., Schwaeble W., Sim R.B., Natural substrates and inhibitors of mannan-binding lectin-associated serine protease-1 and -2: a study on recombinant catalytic fragments. J Immunol. 2003 Feb 1; 170(3):1374-82]. Поэтому, MASP-2 представляет собой протеазу, ответственную за активацию С4 и С2 для генерации С3-конвертазы, C4b2a. В этом заключается его значительное отличие от комплекса С1, где скоординированная активность двух специфичных сериновых протеаз (C1r и C1s) приводит к активации системы комплемента. Недавно была выделена третья новая протеаза, МАСП-3 [Dahl MR., Thiel S., Matsushita M., Fujita T., Willis A.C., Christensen T., Vorup-Jensen T., Jensenius J.C. MASP-3 and its association with distinct complexes of the mannan-binding lectin complement activation pathway. Immunity. 2001; 15(1): 127-135].

МАСП-1 и МАСП-3 представляют собой продукты одного и того же гена, полученные в результате альтернативного сплайсинга. Их биологические функции до сих пор остаются невыясненными. МАСПы имеют одинаковую доменную организацию с белками C1r и C1s, ферментными субкомпонентами комплекса С1, классического пути активации системы комплемента [Sim R.B., Laich A. Serine proteases of the complement system. Biochem Soc Trans. 2000; 28(5): 545-50]. Как в протеазах С1, активация МАСП-2 протекает при расщеплении связи Arg-Ile, примыкающей к домену сериновой протеазы, это приводит к расщеплению фермента на связанные дисульфидными связями цепочки А и В, последняя из которых состоит из домена сериновой протеазы. Генетически обусловленная неполноценность МАСП-2 была описана в недавних исследованиях [Stengaard-Pedersen K., Thiel S., Gadjeva M., Møller-Kristensen M., Sørensen R., Jensen L.T., Sjøholm A.G., Fugger L., Jensenius J.C. Inherited deficiency of mannan-binding lectin-associated serine protease 2. N Engl J Med. 2003; 349(6): 554-560].

Мутация одного нуклеотида приводит к замене Asp в домене CUB1, что в свою очередь лишает МАСП-2 способности связываться с МСЛ. МСЛ также связывается с неферментным белком, обозначаемым как МСЛ-связанный белок 19 кДА (МСБ19) [21] или малым МСЛ-связанным белком (мМСБ) [Takahashi M., Endo Y., Fujita T., Matsushita M. A truncated form of mannose-binding lectin-associated serine protease (MASP)-2 expressed by alternative polyadenylation is a component of the lectin complement pathway. Int Immunol. 1999; 11(5): 859-863]. МСБ19 формируется при альтернативном сплайсинге продукта гена МАСП-2 и содержит два первых домена МАСП-2, за которыми следует дополнительная последовательность четырех уникальных аминокислот. Гены МАСП-1 и МАСП-2 расположены на хромосомах 3 и 1, соответственно [Schwaeble W., Dahl M.R., Thiel S., Stover C., Jensenius J.C. The mannan-binding lectin-associated serine proteases (MASPs) and MAp19: four components of the lectin pathway activation complex encoded by two genes. Immunobiology. 2002; 205(4-5): 455-466].

Ряд данных указывают на то, что существуют различные комплексы МСЛ-МАСП, a также на то, что значительная часть находящихся в сыворотке МАСП не связана с МСЛ [Thiel S., Petersen S.V., Vorup-Jensen T., Matsushita M., Fujita T., Stover C.M., Schwaeble W.J., Jensenius J.C. Interaction of C1q and mannan-binding lectin (MBL) with C1r, C1s, MBL-associated serine proteases 1 and 2, and the MBL-associated protein MAp19. J Immunol. 2000; 165(2): 878-887]. Н- и L-фиколин также связываются с МАСП и активируют лектиновый путь также, как МСЛ [Dahl M.R., Thiel S., Matsushita M., Fujita T., Willis A.C., Christensen T., Vorup-Jensen T., Jensenius J.C. MASP-3 and its association with distinct complexes of the mannan-binding lectin complement activation pathway. Immunity. 2001; 15(1):127-135].

Оба - лектиновый и классический, - пути активации комплемента формируют общую С3-конвертазу (C4b2a) и оба пути активации сходятся в этом пункте. Считается, что лектиновому пути активации комплемента принадлежит ведущая роль в иммунной защите организма против инфекции. Доказательства вовлеченности МСЛ в иммунную реакцию были получены в результате наблюдений за субъектами, имеющими пониженный уровень функционального МСЛ в сыворотке [Matsushita M., Kuraya M., Hamasaki N., Tsujimura M., Shiraki H., Fujita T. Activation of the lectin complement pathway by H-ficolin (Hakata antigen). J Immunol. 2002; 168(7): 3502-3506]. Такие субъекты демонстрируют восприимчивость к рецидивирующим бактериальным и грибковым инфекциям. Данные симптомы обычно проявляются в раннем возрасте, во время определенного промежутка времени, когда титр производных от материнских антител снижается, а собственные антитела еще не вырабатываются в полном объеме. Данный синдром часто является следствием мутаций некоторых сайтов в коллагеновой части МСЛ, которая препятствует непосредственному образованию олигомеров МСЛ. Однако, так как МСЛ способен функционировать в качестве независимого от комплемента опсонина, остается невыясненным, до какого предела повышенная восприимчивость к инфекции обусловлена нарушениями в активации комплемента. Несмотря на исчерпывающие доказательства участия всех путей активации классического и альтернативных - в патогенезе неинфекционных человеческих заболеваний, роль лектинового пути активации только начинают оценивать. Недавние исследования показали, что активация лектинового пути может провоцировать активацию комплемента и воспаление, связанное с реперфузионным повреждением после ишемии. Коллард и др. (2000) показали, что культивируемые эндотелиальные клетки, подвергнутые окислительному стрессу, связываются с МСЛ и демонстрируют отложение C3b в присутствии человеческой сыворотки [Collard C.D., Morrissey M.A., Agah A., Rollins S.A., Reenstra W.R., et al. Complement activation after oxidative stress: role of the lectin complement pathway. Am J Pathol. 2000; 156(5): 1549-56].

Кроме того, обработка человеческой сыворотки блокирующими анти-МСЛ моноклональными антителами ингибирует связывание МСЛ и активацию комплемента. Данные открытия были проверены опытным путем на лабораторных крысах с ишемией-реперфузией миокарда, в процессе чего у крыс, подвергшихся лечению с использованием блокирующих крысиных моноклональных антителк МСЛ, наблюдали значительно меньше случаев поражения миокарда вследствие закупорки коронарной артерии, чем у крыс, подвергнутых лечению контрольными антителами [Jordan J.E., Montalto M.C., Stahl G.L. Inhibition of mannose-binding lectin reduces postischemic myocardial reperfusion injury. Circulation. 2001; 104(12): 1413-1418].

Все три пути активации (классический, лектиновый и альтернативный) сходятся на компоненте С5, который расщепляется на С5а и C5b. С5а является самым сильным анафилатоксином, индуцирующим изменения как в гладкой мускулатуре и сосудистом тонусе, так и в проницаемости сосудов. Он также представляет собой эффективный хемотаксин и активатор как нейтрофилов, так и моноцитов. С5а-опосредованная клеточная активация может значительным образом усиливать воспалительные реакции путем индуцирования секреции дополнительных воспалительных медиаторов, включая цитокины, гидролитические ферменты, метаболиты арахидоновой кислоты и активные формы кислорода. Расщепленный C5b приводит к формированию C5b-9, также известного как мембрано-атакующий комплекс (МАК). В настоящее время имеются веские доказательства того, что сублитическое отложение МАК может играть важную роль в воспалительном процессе в дополнение к роли литического, поро-формирующего комплекса.

В дополнение к клеточным и сосудистым эффектам вышеописанного активированного компонента комплемента, который может объяснить связь между травмой и дессеминированным внутрисосудистым свертыванием (ДВС), появляющиеся новые данные подтверждают прямые молекулярные связи между системами комплемента и коагуляции. Экспериментальные данные были получены при исследованиях на мышах с дефицитом компонента С3. Поскольку С3 является общим компонентом для каждого из трех путей активации комплемента, у мышей с дефицитом компонента С3 нарушена функция комплемента. Однако мыши с С3-дефицитом могут превосходно активировать терминальные компоненты комплемента [Huber-Lang., Sarma J.V., Zetoune F.S., Rittirsch D., Neff T.A., McGuire S.R., et al. Generation of C5a in the absence of C3: a new complement activation pathway. Nat Med. 2006; 12(6): 682-687]. Детальные исследования выявили, что С3-независимая активация терминальных компонентов комплемента опосредована тромбином, ключевым ферментом коагуляционного каскада [30]. Молекулярные компоненты, опосредующие активацию тромбина после начальной активации комплемента, остались пока невыясненными. Авторы показали молекулярную основу связи между комплементом и коагуляционными каскадами и идентифицировали МАСП-2 в качестве центральной молекулы, связывающей две системы. Биохимические исследования о субстратной специфичности МАСП-2 идентифицировали протромбин в качестве возможного субстрата в дополнение к широко известным белкам комплемента С2 и С4. МАСП-2 специфически расщепляет протромбин на функционально релевантных участках, генерируя тромбин, ключевой фермент, регулирующий скорость коагуляционного каскада [Hess K., Ajjan R., Phoenix F., Schroeder V. Effects of MASP-1 of the complement system on activation of coagulation factors and plasma clot formation. PLoS One. 2012; 7(4): e35690. doi: 10.1371/journal.pone.0035690].

Тромбин, генерированный МАСП-2, способен стимулировать отложение фибрина в определенной восстановленной системе in vitro, демонстрируя функциональную релевантность расщепления МАСП-2 [Krarup, A., WallisR., PresanisJ.S., GalP., SimR.B. Simultaneous Activation of Complement and Coagulation by MBL-Associated Serine Protease 2. // PLoS. ONE. (2007) 2(7): e623. Doi:10.1371/journal.pone.0000623]. Авторы подтвердили физиологическую значимость данного открытия посредством определения активации тромбина в нормальной сыворотке грызунов после активации лектинового пути, а также продемонстрировали, что данный процесс блокируется нейтрализующими МАСП-2 моноклональными антителами. МАСП-2 может представлять центральную точку разветвления в лектиновом пути, способную стимулировать активацию систем комплемента и коагуляции. Поскольку активация лектинового пути представляет собой физиологическую реакцию на многие виды травматических повреждений, авторы полагают, что сопутствующее системное воспаление (опосредованное компонентами комплемента) и диссеминированную внутрисосудистую коагуляцию (ДВС) (опосредованную через коагуляционный путь) можно объяснить способностью MASP-2 активировать оба пути. Данные открытия четко указывают на роль МАСП-2 в генерации ДВС и терапевтическую полезность ингибирования МАСП-2 при лечении или предупреждении ДВС. МАСП-2 может обеспечить молекулярную связь между комплементом и коагуляционной системой, и активация лектинового пути, возникающая при разных травмах, может непосредственно инициировать активацию коагуляционной системы через ось «(МАСП-2)-тромбин», обеспечивая механизм связи между травмой и ДВС.

МАСП-1 похож с тромбином в том, что она расщепляет фактор XIII, фибриноген и тромбин-активируемый ингибитор фибринолиза (ТАИФ), в то время как МАСП-2 расщепляет только протромбин [Krarup A., Gulla K.C., Gál P., Hajela K., Sim R.B. The action of MBL-associated serine protease 1 (MASP1) on factor XIII and fibrinogen. Biochim Biophys Acta. 2008; 1784(9): 1294-300. doi: 10.1016/j.bbapap.2008.03.020]. Гулла и соавт. (2010) показали, что МСЛ-МАСП и L-фиколин-МАСП комплексы активируют коагуляционную систему при связывании к их соответствующими лигандами с образованием фибринового сгустка. Образовавшийся фибриновый сгусток связывает микробы и предотвращает их распространение [Gulla K.C., Gupta K., Krarup A., Gal P., Schwaeble W.J., Sim R.B., O'Connor C.D., Hajela K. Activation of mannan-binding lectin-associated serine proteases leads to generation of a fibrin clot. Immunology. 2010; 129(4):482-95. doi: 10.1111/j.1365-2567.2009.03200.x.].

Также как тромбин, МАСП-1 способна активировать протеазо-активируемый рецептор 4, который является медиатором тромбоцитарной активации и воспаления [Megyeri M., Makó V., Beinrohr L., Doleschall Z., Prohászka Z., Cervenak L., Complement protease MASP-1 activates human endothelial cells: PAR4 activation is a link between complement and endothelial function. J Immunol. 2009; 183(5): 3409-16. doi: 10.4049/jimmunol.0900879]. МАСП-3 расщепляет инсулино-подобный ростовой фактор-связывающий белок 5 (ИПРФСБ-5), который связывается к инсулино-подобному фактору роста (ИПФР) и модулирует его действие на клеточную пролиферацию, дифференциацию, выживание [Cortesio C.L., Jiang W. Mannan-binding lectin-associated serine protease 3 cleaves synthetic peptides and insulin-like growth factor-binding protein 5. Arch Biochem Biophys. 2006; 449 (1-2): 164-10] . ИПРФСБ-5 также регулирует эти клеточные события через ИПФР-независимые механизмы. Недавно было показано, что случаи с МАСП-3 дефицитом у человека обусловлены мутацией гена МАСП-1 и связаны с нарушениями эмбрионального развития, одним из синдромов которого является лицевая расщелина - «волчья пасть» [Rooryck C., Diaz-Font A., Osborn DP., Chabchoub E., Hernandez-Hernandez V., Shamseldin H., et al. Mutations in lectin complement pathway genes COLEC11 and MASP1 cause 3MC syndrome. Nat Genet. 2011;43(3):197-203. doi: 10.1038/ng.757]. Это предполагает, что МАСП-3 выполняет критическую роль в эмбриональном развитии плода.

В донорской плазме in vitro после рекальцификации, даже при отсутствии активаторов, процесс свертывания начинается через 10-20 мин спонтанно в отдельных центрах. Далее спонтанные сгустки увеличиваются в размере, постепенно заполняют весь объем плазмы. Показано также, что количество спонтанных центров с уменьшением числа тромбоцитов в плазме снижается. После ультрацентрифугирования плазмы для удаления всех тромбоцитов и крупных фосфолипидных везикул спонтанные центры практически не образуются. Ингибитор контактной фазы, полученный из зерен кукурузы, значительно снижает число спонтанных сгустков, но не подавляет их образование полностью [Каротина Н.Г., Ованесов М.В., Плющ О.П., Копылов К.Г., Лопатина Е.Г., Саенко Е.Л., Бутылин А.А., Атауллаханов Ф.И. Исследование спонтанных сгустков в нормально плазме и плазме больных гемофилией // Гематол. и трансфузиол. - 2002. - Т. 47. - С. 26-30].

Известны лабораторные способы исследования свертывания крови в условиях низкоконтактной активации, основанные на принципе рекальцификации цитратной крови [Исследование системы гемостаза в клинике. Под ред. Баркагана З.С., Барнаул, 1975, с. 21, 72-73; Иванов Е.П. Диагностика нарушений гемостаза. Минск, 1983, с. 120-124; Лабораторные методы исследования системы гемостаза. Под ред. Балуды В.П. и соавт. Томск, 1980, с. 55-56]. Указанные способы считаются одними из основных в гемостазиологии. Однако накопившийся опыт и расширение знаний в области механизмов свертывания крови показали, что эти способы по своей чувствительности перестали удовлетворять все возрастающим требованиям к выявлению гиперкоагуляции [Rohrer M.J. et al. Annls of Surgery. - 1988. - V. 208, N 5. - P. 554-557].

Из уровня техники известен способ оценки гемостаза методом тромбодинамики. Тромбодинамика как метод исследования плазменного гемостаза был предложен в 1994 г. группой исследователей под руководством Атауллаханова Ф.И. [Атауллаханов Ф.И., Гурия Г.Т., Сафрошкина А.Ю. Пространственные аспекты динамики свертывания крови. II. Феноменологическая модель // Биофизика. - 1994. - Т. 39, №1. - С. 97-106]. В основу метода положена модель распространения сгустка начиная от повреждения сосудистой стенки вглубь сосуда. Имитация поврежденной сосудистой стенки достигается путем нанесения тонкого слоя тканевого фактора на поверхности вставки-активатора, которая и запускает процесс образования сгустка в плазме. В ходе исследования оцениваются параметры пространственного роста сгустка (лаг-период, Tlag), начальную скорость сгустка (Vo), стационарную скорость сгустка (Vst), размер сгустка (CS), оптическую плотность сгустка (CD). Таким образом, врач получает возможность характеризовать процессы активации свертывания с участием тканевого фактора. Также этот метод позволяет регистрировать феномен спонтанного образования сгустка.

Недостатком метода тромбодинамики является низкая производительность (2 анализа в течение 45 мин), необходимость дополнительной подготовки пробы (плазмы) путем высокоскоростного центрифугирования, необходимость специального прибора для регистрации тромбодинамики (или нескольких - для увеличения производительности анализа), набора реагентов и расходных материалов и, соответственно, высокая стоимость одного анализа для рутинных исследований. Также недостатком метода тромбодинамики является использование ингибитора контактного пути активации коагуляции, ингибитора трипсина из кукурузы, который снижает информативность теста и оценивает только активацию свертывания через тканевой фактор.

Из уровня техники известен также метод выделения и количественного определения множественно-модифицированных липопротеинов низкой плотности. Суть метода заключается в том, что выделение ммЛНП из сыворотки крови человека и определение количества ммЛНП по содержанию холестерина проводят путем обработки ее буфером, содержащим поливинилпирролидон с молекулярной массой 35000 (ПВП-35000), инкубации пробы в течение 10 мин при комнатной температуре, осаждения агрегированных ммЛНП центрифугированием, преципитаты ммЛНП отделяют декантацией и ммЛНП растворяют в буфере без ПВП-35000. При уровне содержания холестерина в ммЛНП более 6,6 мг/дл констатируют наличие субклинического атеросклероза у обследуемого индивидуума [Шойбонов Б.Б., Баронец В.Ю., Толпыго С.М., Замолодчикова Т.С., Котов А.В., Кравченко М.А., Костырева М.В., Шабалина А.А. Метод выделения и количественного определения множественно-модифицированных липопротеинов низкой плотности // Патент РФ № 2592238, опубл. 20.07.2016. Бюл. №20]

Также известен способ выделения и исследования иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротеины низкой плотности (ИК-ммЛНП), из сыворотки крови человека. Множественно модифицированные ЛНП из сыворотки крови человека предварительно агрегируют в условиях 9,1% ПВП-35000 как описано выше. Супернатант, полученный на стадии приготовления ммЛНП, дополнительно инкубируют при 4°С в течение 30 мин. Образовавшиеся агрегаты ИК-ммЛНП осаждают центрифугированием при 4°С в течение 10 мин при 3100g, декантируют, растворяют преципитат ИК-ммЛНП в буфере без ПВП-35000 и определяют содержание холестерина. Комплемент-связывающую способность ИК- ммЛНП исследуют с помощью гемолитического теста с использованием комплемента морской свинки. Способ может применяться как для ранней диагностики субклинического атеросклероза, так и для оценки характера аутоиммунной реакции организма на ммЛНП [Драпкина О.М., Шойбонов Б.Б., Елиашевич С.О. Способ выделения иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротеины. // Патент РФ № 2632118. Бюлл. № 28 от 02.10.2017 г].

Таким образом, в настоящее время не существует доступных тест-систем определения активности комплемента по классическому пути в тесте коагуляции фибриногена для рутинных исследований.

Задачей настоящего изобретения является создание скриниг-теста для определения активности системы комплемента по классическому пути в тесте коагуляции фибриногена для диагностики гиперкоагуляции и угрозы тромбоза, обусловленной высокой функциональной активностью системы комплемента.

Техническим результатом предлагаемого способа является расширение арсенала лабораторных скрининг-тестов для диагностики гиперкоагуляции, обусловленной высокой функциональной активностью классического пути системы комплемента в тесте коагуляции фибриногена.

Указанный результат достигается тем, что определение функциональной активности системы комплемента в тесте коагуляции фибриногена проводят с использованием сыворотки крови в качестве источника комплемента и специально обработанной цитратной плазмы крови в качестве источника протромбинового комплекса с фактором XII и фибриногеном, а в качестве активатора системы комплемента используют иммунные комплексы, содержащие множественно-модифицированные липопротеины низкой плотности (ИК-ммЛПНП). Активацию контактного пути коагуляции вызывают рекальцификацией, а степень коагуляции фибриногена определяют как разность изменения мутности пробы при 450 нм после 20 минутной инкубации при 37°С. Пробы с декомплементезированной сывороткой служат контролем для подтверждения участия системы комплемента в коагуляции фибриногена. Расчет степени коагуляции проводят относительно пробы, содержащей человеческий тромбин вместо исследуемой сыворотки человека. Максимальную абсорбцию фибринового сгустка, полученного с тромбином, при 450 нм принимают за 100% коагуляцию фибриногена. Коагуляция на уровне до 20% считают низкой активностью комплемента в тесте коагуляции фибриногена, от 21% до 48% - средняя активность и выше 49% - как высокую активность комплемента в тесте коагуляции фибриногена.

Способ осуществляют следующим образом. Проводят забор крови, приготовление сыворотки, проведение теста коагуляции фибриногена с использованием специально обработанной цитратной плазмы, содержащей множественно-модифицированные липопротеины в качестве активатора классического пути активации комплемента, и CaCl₂ для рекальцификации плазмы. Время проведения теста составляет 20 мин, одномоментно возможно исследование 90 проб сыворотки и тест может быть адаптирован для автоматических анализаторов.

Приготовление протромбинового комплекса с фактором XII и иммунными комплексами, содержащими множественно-модифицированные липопротеины низкой плотности. К 10 мл цитратной плазмы прибавляют 8,4 мл 20% поливинилпирролидона с молекулярной массой 35000 (ПВП-35) и инкубируют 10 мин при комнатной температуре. Образовавшиеся агрегаты ммЛПНП (П-1) отделяют центрифугированием при 23°С при 8000 об/мин в течение 10 мин. Тщательно декантируют и преципитат растворяют в 5 мл 0,01М трис-HCl-буфера, содержащего 0,15 М NaCl, рН 7,4. Супернатант далее инкубируют в течение 30 мин при 4°С. Образовавшиеся агрегаты протромбинового комплекса с фактором XII и иммунными комплексами, содержащими множественно-модифицированные липопротеины низкой плотности (П-2), осаждают центрифугированием при 4°С при 8000 об/мин в течение 10 мин. Преципитат тщательно декантируют и растворяют в 5 мл (концентрирование в 2 раза исходного образца цитратной плазмы). После растворения преципитатов (П-1 и П-2) определяют определяют коагуляцию при рекальцификации полученных препаратов.

Определение оптимальной концентрации хлорида кальция для запуска коагуляции препаратов П-1 и П-2 по контактному пути. С этой целью предварительно в 96-ти луночных плоскодонных планшетах 25 мкл 10% раствора хлорида кальция был прогрессивно раститрован начиная с первой лунки по седьмую лунку (8 лунка представляет бланк П-1 или П-2 без кальция). После добавляют по 50 мкл трис-имидазолового буфера, рН 7,4 и препараты П-1 или П-2. Тщательно перемешивают и измеряют степень коагуляции по изменению мутности при 450 нм на фотометре для иммуноферментного анализа (0 мин), далее ставят на 30-минутную инкубацию при 37°С. Далее измерение поглощения проб для контроля коагуляции проводят через 20, 30, 60 мин инкубации. Полученные результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1

Влияние концентрации 10% раствора хлорида кальция на коагуляцию П-1

Как видно из данных, представленных в таблице 1, препарат П-1, приготовленный из цитратной плазмы, не обладает способностью к коагуляции при рекальцификации. Далее в аналогичных условиях был тестирован препарат П-2, приготовленный из супернатанта после отделения множественно-модифицированных липопротеинов низкой плотности из цитратной плазмы в условиях 9,1% ПВП-35. Полученные результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2

Влияние концентрации 10% раствора хлорида кальция на коагуляцию П-2

Как видно из данных, представленных в таблице 2, в препарате П-2, приготовленном из супернатанта после отделения на первом этапе ммЛПНП из цитратной плазмы, содержится полный набор факторов протромбинового комплекса с фактором XII, который запускает коагуляцию при оптимальной концентрации ионов Са²⁺. Максимальная коагуляция наблюдается при инкубации в течение 60 мин при 37°С при концентрации Са²⁺ от 0,185% до 1,56%. При инкубации 20 мин в системе не наблюдается какая-либо коагацияция П-2. Для дальнейших исследований влияния активации комплемента на коагуляцию П-2 нами выбрана 20 минутная инкубация.

Определение фибриногена в препаратах П-1 и П2. В препаратах П-1 и П-2 определяли содержание фибриногена по Миллар. Суть метода заключается в термоагрегации фибриногена при 56°С в течение 3 мин. Количество термоаггрегированного фибриногена определяли турбидиметрически в иммунологических планшетах с плоским дном с использованием фотометра для иммуноферментного анализа. К 25 мкл П-1, П-2 и исходной цитратной плазмы после термоаггрегации добавляют 75 мкл 0,15 М раствора NaCl. В пробе контроли бланка использовали растворы препаратов П-1, П-2 и исходной цитратной плазмы. Пробы тщательно перемешивали и измеряли мутность при 450 нм. Полученные результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3

Содержание фибриногена в препаратах П-1, П-2 и в пулированной цитратной плазме

Как видно из данных, представленных в таблице 3, фибриноген не определялся в препарате П-1, в препарате П-2 содержание фибриногена составило 111% по сравнению с содержанием в исходной пулированной цитратной плазме. Учитавая то, что на стадии выделения П-2 проводилась концентрирование в 2 раза, выход по фириногену составил приблизительно 56%. Далее проводили эксперименты с определением фибриногена с тромбином. Для этого к 25 мкл препаратов П-1, П-2 или исходной пулированной цитратной плазме добавляли 65 мкл трис-имидазолового буфера с рН 7,4 и 10 мкл тромбина с активностью 10 NIH.

Пример 1. Определение коагуляции фибриногена при активации комплемента множественно-модифицированными липопротеинами низкой плотности в препарате П-2. В лунки 96-луночной планшеты вносили последовательно 10 мкл сыворотки крови человека, 40 мкл трис-имидазолового буфера, 75 мкл препарата П-2 и 25 мкл 10 мМоль/л CaCl₂, тщательно перемешивали и измеряли оптическую плотность проб при 450 нм (0 мин инкубации - бланк). Затем пробы инкубировали 10 и 20 мин. В качестве контроля на полную коагуляцию препарата П-2 использовали тромбин с активностью 10 NIH и бланк представлял контроль П-2 без сыворотки. Полученные результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4

Коагуляция фибриногена в препарате П-2 при активации комплемента ммЛНП в сыворотке крови человека

Как видно из данных, представленных в таблице 4, инкубация препарата П-2 с сыворотками при рекальцификации приводила к разной степени коагуляции фибриногена в зависимости от времени инкубации.

Пример 2. Влияние инактивации комплемента на коагуляцию фибриногена в П-2. Сыворотки № 1-8 были предварительно декомплементизированы (инактивированы) инкубацией в течение 30 мин при 56°С. Условия эксперимента подробно описаны выше (см. пример 1), за исключением того, что в экспериментах использованы термоинактивированные сыворотки №1-8. Данные по влиянию инактивации комплемента при прогревании на коагуляцию П-2 представлены в таблице 5.

Таблица 5

Влияние декомплементизации сыворотки на коагуляцию П-2

Как видно из данных, представленных в таблице 5, термоинактивация комплемента приводит к полной потере коагуляции П-2 при рекальцификации.

Таким образом, коагуляция препарата П-2 при рекальцификации обусловлена активацией системы комплемента.

Пример 3. Влияние маннана на коагуляцию фибриногена при активации комплемента ммЛНП в препарате П-2. Проведены исследования влияния прапарата дрожжевого маннана, активатора лектинового пути системы комплемента, на коагуляцию фибриногена при активации комплемента ммЛНП. Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии активации лектинового пути системы комплемента множественно-модифицированными липопротеинами низкой плотности в препарате П-2 при рекальцификации. Также отсутствие ионов магния исключает активацию комплемента по альтернативному пути.

Таким образом в данных условиях (при рекальцификации) наблюдается активация систем комплемента по классическому пути до стадии образования С3-конвертазы. Для формирования С3-конвертазы классического пути активации системы комплемента, а также для активации альтернативного пути требуются ионы двухвалентного магния. Следовательно в данных условиях мы наблюдаем активацию компонента С1 на иммунных комплексах, содержащих ммЛНП в препарате П-2.

Пример 4. Влияние активации системы комплемента в сыворотках крови беременных женщин на коагуляцию фибриногена в препарате П-2. Проведено исследование влияния активации системы комплемента в сыворотках крови беременных женщин препаратом П-2 на коагуляцию фибриногена. Условия эксперимента подробно описаны выше. Полученные результаты представлены в таблице 6.

Таблица 6

Влияние активации системы комплемента в сыворотках крови беременных женщин на коагуляцию фибриногена в препарате П-2

Как видно из данных, представленных в таблице 6, в 7 пробах (12%) из 60 тестированных проб сыворотки в тесте коагуляции фибриногена выявляется коагуляция до 20% (низкая активность комплемента) по сравнению с контролем полной коагуляции, которую определяли с использованием тромбина. В 32 пробах (53%) - коагуляция фибриногена колебалась от 20 до 49% (Средняя активность комплемента). В 21 пробе (35%) - выше 49% коагуляции (Высокая активность комплемента в тесте коагуляции фибриногена).

Таким образом, разработанный тест позволяет выявлять предтромботические состояния, обусловленные высокой функциональной активностью комплемента по классическому пути, для ранней профилактики инсультов и инфарктов.