01.11.2019
219.017.dd08

Штамм бактерий Bifidobacterium longum ICIS-505 - продуцент биологически активных веществ, обладающих антиперсистентной активностью в отношении условно-патогенных и патогенных бактерий и дрожжевых грибов

Вид РИД

Изобретение

Юридическая информация Свернуть Развернуть
Краткое описание РИД Свернуть Развернуть
Аннотация: Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии. Предложен штамм бактерий Bifidobacterium longum ICIS-505, который является продуцентом биологически активных веществ, обладающих антиперсистентной активностью в отношении условно-патогенных и патогенных бактерий и дрожжевых грибов. Штамм бактерий Bifidobacterium longum депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора» под коллекционным номером 1260 и может быть использован для получения пробиотических препаратов. Штамм позволяет нормализовать микрофлору кишечника при профилактике и лечении острых кишечных инфекций. 2 табл.
Реферат Свернуть Развернуть

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и может быть использовано для получения пробиотических препаратов, оказывающих антиперсистентное влияние на условно-патогенные и патогенные бактерии и дрожжевые грибы.

Аналогов изобретения в патентной и научно-технической литературе не обнаружено.

Известно, что среди ключевых механизмов защитного действия нормофлоры выделяют способность бифидобактерий потенцировать чувствительность патогенов к антибактериальным факторам хозяина, точнее подавлять их персистентные свойства [Бухарин, О.В. Ассоциативный симбиоз / О.В. Бухарин [и др.]. - Екатеринбург: УрО РАН, 2007 а. - 264 с.].

Персистентные свойства микроорганизмов определяются как основная «мишень» для отбора наиболее эффективных препаратов в борьбе с патогенной флорой, в том числе и с антибиотикорезистентными штаммами. Подавление персистентных свойств возбудителя «отменяет» его паразитирование в организме человека и тем самым повышает эффективность лекарственных воздействий. Этот принцип применим для выбора действия химических средств и отбора биологически активных препаратов [Бухарин О.В., Перунова Н.Б. Микросимбиоценоз. Екатеринбург: УрО РАН. 2014. 260 с].

Все это обусловливает использование бифидобактерий в качестве бактерийных препаратов как при лечении и профилактике острых кишечных инфекций, санации бактерионосительства и преодолении негативных последствий антибиотикотерапии, так и при производстве кисломолочных продуктов.

Технический результат, на достижение которого направлено изобретение, заключается в получении сырья, являющегося источником биологически активных веществ, подавляющих персистентные свойства условно-патогенных и патогенных бактерий и дрожжевых грибов.

Указанный технический результат достигнут получением нового штамма бактерий Bifidobacterium longum ICIS-505.

Штамм Bifidobacterium longum ICIS-505 выделен из испражнений пациента при обследовании микробиоценоза дистального отдела толстого кишечника в 2014 году в лаборатории биомониторинга и молекулярно-генетических исследований Института клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук г. Оренбурга.

Полученный штамм Bifidobacterium longum ICIS-505 депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора» под коллекционным номером 1260.

Штамм Bifidobacterium longum ICIS-505 характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Культурально-морфологические признаки:

Клетки представляют собой грамположительные, неподвижные полиморфные палочки с раздвоениями или булавовидными утолщениями на одном или двух концах длиной от 4,0 до 5,0 мкм, располагающиеся в виде отдельных клеток или скоплений.

В анаэробных условиях на поверхности Schaedler-агар и МРС-5 (38±1°С, 48 часов) образуют круглые мелкие белые колонии.

В полужидких средах (печеночная среда Блаурокка, казеиново-дрожжевой (КД-5), гидролизатно-молочный (ГМ) при 38±1°С, 48 часов бактерии вырастают в виде рыхлой массы, оставляя прозрачной верхнюю часть среды (зона аэробиоза). Отдельные колонии бифидобактерий при росте на печеночной среде Блаурокка имеют шаровидную форму белого цвета и образуют при встряхивании крошковатую массу.

Физиолого-биохимические признаки:

Строгий анаэроб.

Температурный диапазон роста 38±1°С, фаза максимального накопления микробных клеток заканчивается к 24-48 ч.

Оптимум рН 7,2-7,6.

Не ферментируют индол, уреазу, салицин, трегалозу, маннотол, рамнозу, N-ацетил-β-D-глюкозаминидазу, эскулин, целлобиозуарабинозу и сорбитол. Ферментируют мальтозу, глюкозу, фруктозу, галактозу, лактозу, мелезитозу, нитраты, сукрозу, β-глюкозидазу, маннозу, раффинозу, ксилозу и арабинозу.

Условия хранения лиофильно высушенной культуры: в герметичной упаковке при температуре 4±2°С в защищенном от прямых солнечных лучей месте при относительной влажности воздуха не более 70% - срок хранения не более 12 месяцев.

Условия и среды для размножения:

1. плотные среды: МРС-5, Schaedler-агар (48 часов, 38±1°С, анаэробные условия);

2. полужидкие среды: печеночная среда Блаурокка, казеиново-дрожжевая (КД-5), гидролизатно-молочная (ГМ) (48 часов, 38±1°С, анаэробные условия);

3. жидкие среды: Schaedler-бульон (24-48 часов, 38±1°С, анаэробные условия).

При проведении полногеномного секвенирования, включая 16rRNA-типирование штамм В. longum ICIS-505 идентифицирован как штамм вида Bifidobacterium longum. Анализ генома В. longum ICIS-505 не выявил генетических детерминант вирулентности и токсигенности, что позволяет говорить о том что данный штамм безвреден, не токсичен и авирулентен.

С целью изучения специфической антиперсистентной активности биологически активных веществ, продуцируемых штаммом В. longum ICIS-505, было изучено их влияние на антилизоцимную активность (АЛА) и биопленкообразование (БПО) условно-патогенных и патогенных бактерий и дрожжевых грибов.

Антилизоцимная активность и биопленкообразование являются базовыми и универсальными характеристиками патогенных и условно-патогенных микроорганизмов [Бухарин О.В., Перунова Н.Б. Микросимбиоценоз. Екатеринбург: УрО РАН. 2014. 260 с.].

Для определения антилизоцимной активности условно-патогенных и патогенных бактерий и дрожжевых грибов использовали известный способ определения антилизоцимной активности микроорганизмов [патент РФ 2126051, C12Q 1/02, 1999].

Биопленкообразование условно-патогенных и патогенных бактерий и дрожжевых грибов проводили фотометрическим методом по интенсивности поглощения красителя (кристалл-виолета) микробной биопленкой, адгезированной к поверхности лунки полистиролового планшета G.А., Kolter R. Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Mol Microbiol 1998, 30, P. 295-304; G.A., Pratt L.A., Watnick P.I., Newman D.K., Weaver V.В., Kolter R. Genetic approaches to the study of biofilms. Methods Enzymol 1999, 310, P. 91-109].

Уровень антиперсистентной активности биологически активных веществ, продуцируемых штаммом В. longum ICIS-505, выражают в процентах (%) подавления персистентных свойств условно-патогенных и патогенных бактерий и дрожжевых грибов в опыте по сравнению с контролем.

Пример осуществления изобретения.

С целью изучения антиперсистентных свойств биологически активных веществ, продуцируемых предлагаемым штаммом, проведено культивирование В. longum ICIS-505 на жидкой питательной среде следующего состава: гидролизат казеина - 5,67 г.; протеозопептон - 5,00 г.; папаиновый перевар соевой муки - 1,00 г.; дрожжевой экстракт - 5,00 г.; глюкоза - 5,83 г.; NaCl -1,67 г.; калия гидрофосфат - 0,83 г.; трис - 3,00 г.; L-цистин - 0,40 г.; гемин -0,01 г. рН=7,6±0,2. Температура 38±1°С, время инкубации 24-48 часа в анаэробных условиях.

Далее получали культуральную жидкость путем центрифугирования бульонной культуры В. longum ICIS-505 (при 3000 оборотах в минуту в течение 15 минут) и отделения ее от бактериальных клеток стеклянной стерильной пипеткой в отдельную емкость.

Данная культуральная жидкость В. longum ICIS-505 представляет собой неочищенный продукт, продуцируемый штаммом, - биологически активные вещества, оказывающие антиперсистентное влияние на условно-патогенные и патогенные бактерии и дрожжевые грибы.

Параллельно из выросших 24 часовых культур условно-патогенных и патогенных бактерий (Sh. zonnei 177б, Sh. flexneri 337, Sh. flexneri 170, E. coli 157, P. mirabilis 50/10, P. vulgaris 401, K. pneumoniae 278, S. aureus 209 и S. aureus 19) и дрожжевых грибов (С. albicans 24433 АТСС, С. albicans 14, С. albicans 38, С. albicans 85, С. albicans 102) готовили одномиллиардную взвесь по стандарту мутности (1×109 КОЕ/мл, 3 McF).

Для определения специфической активности биологически активных веществ, продуцируемых штаммом В. longum ICIS-505, исследовали антиперсистентную активность культуральной жидкости в отношении антилизоцимной активности и биопленкообразования условно-патогенных и патогенных бактерий и дрожжевых грибов. Исследование осуществляли путем добавления культуральной жидкости штамма (в соотношении 1:9) в питательный бульон со взвесью условно-патогенных и патогенных бактерий и дрожжевых грибов (1×109 КОЕ/мл, 3 McF). В качестве контроля на каждом этапе исследований вместо культуральной жидкости Bifidobacterium longum ICIS-505 использовали эквивалентное количество питательного бульона.

Для определения антилизоцимной активности условно-патогенных и патогенных бактерий и дрожжевых грибов использовали известный способ определения антилизоцимной активности микроорганизмов [патент РФ 2126051, C12Q 1/02, 1999]. Согласно способу для определения АЛА в качестве тест-культуры использовали суточную агаровую культуру Micrococcus lysodeikticus (штамм №2665 ГИСК им. Л.А. Тарасевича). Культуру растворяли в физиологическом растворе, доводили оптическую плотность (ОП) тест-штамма до 0,300 (0,28-0,32). На 1/15М фосфатном буфере (рН=6,2) готовили раствор лизоцима с концентрацией 20 мкг/мл.

Для определение специфической активности биологически активных веществ, продуцируемых штаммом Bifidobacterium longum ICIS-505, в отношений антилизоцимной активности условно-патогенных и патогенных бактерий и дрожжевых грибов одномоментно вносилось по 2800 мкл питательного бульона, 100 мкл суспензии суточной агаровой культуры патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (в концентрации 1×109 КОЕ/мл) и 100 мкл супернатанта В. longum ICIS-505 (опыт) или 100 мкл питательного бульона (контроль). Все пробы инкубировались 24 часов статически при 37°С.

Контрольные и опытные пробы отделяли от микробных клеток центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 минут и получали супернатант. Супернатант объемом 0,9 мл смешивали с 0,1 мл приготовленного раствора лизоцима и инкубировали 60-120 мин при 37°С. Затем смесь супернатанта с лизоцимом помещали в полистеролловый планшет и вносили суспензию микрококка. Замер оптической плотности проводили через 30 с и 150 с после внесения в лунки микрококка.

Антилизоцимную активность исследуемого штамма рассчитывали по формуле:

где

А - антилизоцимная активность в микрограммах инактивированного лизоцима/мл супернатанта * ед. оптической плотности бульонной культуры, мкг/мл*OD:

V1 - объем (0,1 мл) раствора лизоцима исходной концентрации (20 мкг/мл);

V2 - объем (0,9 мл) супернатанта бульонной культуры исследуемого штамма;

С - исходная концентрация лизоцима (20 мкг/мл);

Y - оптическая плотность бульонной культуры исследуемого штамма, ед. оптической плотности;

ΔD0 - изменение оптической плотности суспензии тест-культуры в опыте между 30 и 150 секунд [D0(30'')-D0(150'')];

ΔDk - изменение оптической плотности суспензии тест-культуры в контроле между 30 и 150 секунд [Dк(30'')-Dк(150'')].

Антилизоцимную активность опытных и контрольных проб выражали в мкг/мл*OD.

Биопленкообразование условно-патогенных и патогенных бактерий и дрожжевых грибов проводили фотометрическим методом по интенсивности поглощения красителя (кристалл-виолета) микробной биопленкой, адгезированной к поверхности лунки полистиролового планшета G.А., Kolter R. Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Mol Microbiol 1998, 30, P. 295-304; G.A., Pratt L.A., Watnick P.I., Newman D.K., Weaver V.В., Kolter R. Genetic approaches to the study of biofilms. Methods Enzymol 1999, 310, P. 91-109].

В лунки 96-луночных стерильных плоскодонных планшетов одномоментно вносилось по 100 мкл питательного бульона, 135 мкл суспензии суточной агаровой культуры патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (в концентрации 1×109 КОЕ/мл, 3 McF) и 15 мкл супернатанта В. longum ICIS-505 (опыт) или 15 мкл питательного бульона (контроль). Все пробы инкубировались 24 часа при 37°С. Для учета биопленкообразования после удаления планктонных (свободноплавающих) клеток микроорганизмов трехкратной промывкой лунок дистиллированной водой (200 мкл) и подсушивания планшетов на воздухе (30 мин), осуществлялось окрашивание сформированных биопленок внесением в лунки 1% раствора кристалл-виолета (45 мин при комнатной температуре). Отмывание свободного красителя выполняли трехкратной обработкой лунок дистиллированной водой, а экстракцию фиксированного в биопленках красителя проводили добавлением к пробам 200 мкл 96% этанола. Интенсивность окрашивания последнего, соответствующая значению показателя биопленкообразования условно-патогенных и патогенных бактерий и дрожжевых грибов, определяли на спектрофотометре (BioTek, США) при длине волны 630 нм. Показатель биопленкообразования опытных и контрольных проб выражали в условных единицах оптической плотности (ОП630).

Далее вычисляли уровень антиперсистентной активности биологически активных веществ, продуцируемых штаммом В. longum ICIS-505 в процентах (%) подавления АЛА И БПО условно-патогенных и патогенных бактерией дрожжевых грибов в опыте по сравнению с контролем.

Суммированные результаты на основании 3 кратного повторения опытов приведены в таблице 1, 2.

В таблице 1 приведены результаты исследований по определению уровня антиперсистентной активности биологически активных веществ, продуцируемых штаммом Bifidobacterium longum ICIS-505, в отношении условно-патогенных и патогенных бактерий.

В таблице 2 приведены результаты исследований по определению уровня антиперсистентной активности биологически активных веществ, продуцируемых штаммом Bifidobacterium longum ICIS-505, в отношении дрожжевых грибов.

Как видно из таблиц уровень антиперсистентной активности биологически активных веществ, продуцируемых штаммом Bifidobacterium longum ICIS-505 в отношении условно-патогенных и патогенных бактерий и дрожжевых грибов составляет от 60% до 100%, что свидетельствует о его способности ингибировать персистентные свойства условно-патогенных и патогенных бактерий и дрожжевых грибов в 2 и более раза.

Таким образом, заявляемый штамм бактерий Bifidobacterium longum ICIS-505 перспективен для целей получения пробиотических препаратов, оказывающих антиперсистентное влияние на условно-патогенные и патогенные бактерии и дрожжевые грибы.

Штамм бактерий Bifidobacterium longum ICIS-505 - продуцент биологически активных веществ, обладающих антиперсистентной активностью в отношении условно-патогенных и патогенных бактерий и дрожжевых грибов, депонированный в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора» под коллекционным номером 1260.
Источник поступления информации: Роспатент

Показаны записи 1-5 из 5.
19.04.2019
№219.017.2b8f

Способ оценки тяжести течения сепсиса

Изобретение относится к области медицине и представляет собой способ оценки тяжести течения сепсиса, включающий подготовку образцов крови больных сепсисом для проведения флуоресцентной in situ гибридизации с последующим обнаружением бактерий в образцах крови с использованием люминесцентной...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002684904
Дата охранного документа: 16.04.2019
09.05.2019
№219.017.4992

Способ выявления у микроорганизмов протективного действия на молекулу гемоглобина

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при выявлении протективного действия микроорганизмов на молекулу гемоглобина. Для этого исследуемую культуру микроорганизмов выращивают в жидкой питательной среде, отделяют супернатант от микробных клеток центрифугированием,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002687061
Дата охранного документа: 07.05.2019
18.03.2020
№220.018.0ce5

Способ диагностики стадии острого пиелонефрита

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для диагностики стадии острого пиелонефрита. Для этого осуществляют подготовку образцов крови пациентов с острым пиелонефритом. Затем проводят флуоресцентную in situ гибридизацию с использованием люминесцентной микроскопии. Определяют...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002716713
Дата охранного документа: 16.03.2020
11.07.2020
№220.018.31d0

Способ лечения трихомониаза у женщин

Изобретение относится к области медицины, в частности к гинекологии, и может быть использовано для лечения трихомониаза у женщин. Для этого одновременно с применением препаратов из группы 5-нитроимидазолов на поверхность слизистых оболочек нижних отделов женского репродуктивного тракта...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002726123
Дата охранного документа: 09.07.2020
18.07.2020
№220.018.3478

Штамм бактерий lactobacillus salivarius - продуцент ингибитора цитокинов интерлейкина-6 и интерлейкина-17

Изобретение относится к микробиологии. Предлагается штамм бактерий Lactobacillus salivarius, обладающий способностью продуцировать ингибитор цитокинов интерлейкина-6 и интерлейкина-17, депонированный в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н....
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002726653
Дата охранного документа: 15.07.2020
Показаны записи 1-10 из 14.
10.12.2013
№216.012.87a9

Способ индивидуального подбора препаратов, содержащих пробиотические штаммы лактобактерий для эффективной интравагинальной терапии

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и может быть использовано для индивидуального подбора препаратов, содержащих пробиотические штаммы лактобактерий, для эффективной интравагинальной терапии. Для этого от пациентки выделяют вагинальные эпителиоциты, освобождают их от...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002500411
Дата охранного документа: 10.12.2013
20.02.2016
№216.014.cde4

Применение штамма бактерий bacillus cereus гиск №279 в качестве продуцента ингибитора цитокина фно - α

Изобретение относится к области микробиологии и касается применения штамма Bacillus cereus ГИСК №279 в качестве продуцента ингибитора цитокина ФНО-α. Штамм выделен из испражнений пациента с дисбактериозом кишечника и депонирован в Коллекции Государственного научно-исследовательского института...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002575799
Дата охранного документа: 20.02.2016
25.08.2017
№217.015.a3b4

Способ прогнозирования исхода реактивных и инфекционных артритов

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для прогнозирования благоприятного или неблагоприятного исхода инфекционных и реактивных артритов. Способ предусматривает забор кала у пациента для бактериологического исследования на микрофлору после завершения курса...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002607375
Дата охранного документа: 10.01.2017
25.08.2017
№217.015.c3b0

Способ обработки кальций-фосфатных покрытий на имплантатах

Изобретение относится к медицине. Описан способ, который включает внесение фосфата кальция в 5-20% раствор ортофосфорной кислоты до насыщения, затем имплантат помещают в этот раствор и проводят гальваническое нанесение кальция-фосфатного покрытия при напряжении 80-400 В, частоте импульсов...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002617252
Дата охранного документа: 24.04.2017
04.04.2018
№218.016.36fc

Средство для селективного влияния на биопленкообразование микроорганизмами

Изобретение относится к области медицины, а именно к медицинской микробиологии и инфектологии, и предназначено для профилактики и лечения бактериальных инфекций. Применяют тритерпеноид милиацин в качестве средства для селективного влияния на биопленкообразование микроорганизмами, снижающего...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002646488
Дата охранного документа: 05.03.2018
02.08.2018
№218.016.7797

Система мониторинга патогенного потенциала энтеробактерий методом полимеразной цепной реакции

Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение предназначено для выявления и идентификации в пробах ДНК, выделенных из чистых культур, клинических образцов, проб пищевых продуктов и элюатов, полученных в результате концентрирования из воды, генетических детерминант пяти факторов...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002662930
Дата охранного документа: 31.07.2018
19.10.2018
№218.016.9332

Штамм бактерий bifidobacterium bifidum icis-310 - продуцент ингибитора провоспалительного цитокина inf-γ

Изобретение относится к микробиологии. Предложен штамм бактерий Bifidobacterium bifidum ICIS-310, который является продуцентом ингибитора провоспалительного цитокина INF-γ и депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002670054
Дата охранного документа: 17.10.2018
13.01.2019
№219.016.af09

Способ определения уровня биосовместимости штаммов бифидобактерий и/или лактобактерий

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ определения уровня биосовместимости штаммов бифидобактерий и/или лактобактерий. Способ включает раздельное выращивание штаммов на жидкой среде и соинкубирование их супернатантов в отдельности с взвесью клеток тест-штамма Bifidobacterium...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002676910
Дата охранного документа: 11.01.2019
25.01.2019
№219.016.b415

Питательная среда для восстановления численности анаэробных бактерий после низкотемпературного хранения

Изобретение относится к биотехнологии. Питательная среда для восстановления численности анаэробных бактерий после низкотемпературного хранения содержит гидролизат казеина, бактопептон, дрожжевой экстракт, глюкозу, натрия хлорид, калия гидрофосфат, трис (гидроксиметиламинометан), цистеина -...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002678123
Дата охранного документа: 23.01.2019
17.04.2019
№219.017.161c

Способ лечения острых гнойно-воспалительных заболеваний мягких тканей микробной этиологии

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской микробиологии, и может найти применение в хирургии, травматологии, гинекологии и онкологии при лечении острых гнойно-воспалительных заболеваниях мягких тканей микробной этиологии. Для этого осуществляют вскрытие гнойного очага с...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002306947
Дата охранного документа: 27.09.2007

Похожие РИД в системе