ТРЕХКОМПОНЕНТНЫЙ КОМПЛЕКС ДЛЯ КЛЕТОЧНОЙ ТЕРАПИИ В ОФТАЛЬМОЛОГИИ

Изобретение относится к медицине, а точнее к офтальмологии, и может быть использовано для клеточной терапии при различной офтальмопатологии, сопровождающейся дистрофическими, атрофическими и т.п. процессами.

Одним из перспективных методов лечения различной офтальмопатологии, сопровождающейся дистрофическими, атрофическими и т.п. процессами, например, возрастной макулярной дистрофии, атрофии зрительного нерва, прогрессирующей миопии и т.д., может явиться применение мезенхимальных стволовых клеток (МСК), однако, такие методы еще недостаточно разработаны.

Стволовые клетки обладают рядом существенных достоинств: могут обеспечивать регенерацию поврежденных участков через продукцию различных факторов роста и ключевых метаболитов; способны разворачивать программы пролиферации и дифференцировки, восполняя тем самым недостаток активно работающих клеток; могут интегрироваться в патологически измененные участки сетчатки и образовывать клетки с ретинальным фенотипом. В офтальмологии терапевтический потенциал стволовых клеток изучался на животных с наследственной ретинальной патологией, близкой к пигментному ретиниту человека (Lund et al. Subretinal transplantation of genetically modified human cell lines attenuates loss of visual function in dystrophic rats // PNAS. - 2001. - V.98. - N.17. P.9942-9947; Rander et al. Light-driven retinal ganglion cell responses in blind rd mice after neuronal transplantation // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. - 2001. - V.42. - P.1057-1065; Woch et al., 2001; Sagdullaev et al. Retinal transplantation-induced recovery of retinotectal visual function in rodent model of retinitis pigmentosa // Invest. Ophthal. Vis. Sci - 2003. - V.44. - P.1686-1695).

Хотя мезенхимальные стволовые клетки взрослого организма обладают более ограниченным потенциалом дифференцировки, чем эмбриональные стволовые клетки, получаемые при культивировании клеток бластоцисты, их применение более безопасно. Кроме того, с точки зрения этики, они являются более приемлемым для клинического использования материалом.

Существенной проблемой клеточной терапии является направленная доставка стволовых клеток к патологическому очагу и удержание их в нем в течение времени, необходимого для достижения лечебного эффекта.

Задачей изобретения является создание трехкомпонентного комплекса для клеточной терапии при различной офтальмопатологии, сопровождающейся дистрофическими, атрофическими и т.п. процессами.

Техническим результатом изобретения является возможность моделирования трехкомпонентного комплекса с приданием ему любой формы, размеров и пространственной конфигурации, пригодной для экстрасклеральной имплантации к любому участку глазного яблока или зрительного нерва и фиксации его там в течение времени, необходимого для достижения требуемого лечебного эффекта.

Технический результат достигается за счет того, что:

1. Трехкомпонентный комплекс содержит МСК, меченные магнитными микрочастицами, транспонированные в биологический или синтетический мелкопористый материал, который прочно скреплен с полимерным магнитным материалом с индукцией постоянного магнитного поля 1,5 мТл, с многополюсным реверсивным намагничиванием.

2. Транслоцирование МСК, меченных магнитными микрочастицами, в биологический или синтетический мелкопористый материал в сочетании с плотным прикреплением к полимерному магнитному материалу с индукцией постоянного магнитного поля 1,5 мТл, с многополюсным реверсивным намагничиванием обеспечивает глубокое проникновение МСК в слои биологического или синтетического мелкопористого материала, удержание и равномерное распределение МСК при экстрасклеральной имплантации трехкомпонентного комплекса к любому участку глазного яблока или зрительного нерва в течение времени, необходимого для достижения лечебного эффекта, за счет взаимодействия магнитных полей микрочастиц и магнитного материала.

3. Имплантация трехкомпонентного комплекса к целевому участку глазного яблока или зрительного нерва сопровождается направленной избирательной адгезией МСК в области патологического очага, что способствует активации репаративных процессов за счет приживления трансплантированных стволовых клеток в непосредственной близости от поврежденного участка.

Возможность подобных процессов для эмбриональных стволовых клеток и для стволовых клеток взрослого организма показана в экспериментах на животных (Lamba D.A., Karl M.O., Ware C.B., Reh T.A. Efficient generation of retinal progenitor cells from human embryonic stem cells // PNAS, 2006, v.103, n.34, pp.12769-12774. Meyer J.S., Katz M.L., Maruniak J.A., Kirk M.D. Embrionic stem cell-derived neural progenitors incorporate into degenerating retina and enhance survival of host photoreceptora // Stem Cells, 2006, v.24, n.2, pp.274-283. Fiedlander M. Fibosis and diseases of the eye // J. Clin. Invest., 2007, v.117, n.3, pp.576-586), хотя многие из механизмов реализации терапевтического эффекта изучены не до конца.

Трехкомпонентный комплекс изготавливают следующим образом.

МСК выращивают в культуре клеток костного мозга, взятых у пациента во время диагностической пункции из грудины или подвздошной кости (объем - 0,5-1,0 мл). Выращивание культуры проводят в специальном боксе для клеточных культур с использованием следующего оборудования - центрифуга с одноразовыми стерильными центрифужными пробирками на 50 мл, термостат воздушный, ламинарный бокс, инвертированный и обычный микроскопы, автоматические пипетки, баллоны с углекислым газом и воздухом, камеры Горяева для подсчета концентрации клеток. Для культивирования клеток исходного костного мозга используют стерильные одноразовые пластиковые культуральные флаконы с площадью дна в 25 и 150 см2. При размножении МСК используют следующие среды и растворы: среда RPMI-1640, среда 199, антибиотики: пенициллин, амфотерицин, - раствор L-глютамина, эмбриональная телячья сыворотка. За 12-14 последовательных удвоений (в течение 25-30 суток) из исходного количества недифференцированных МСК, содержащихся в полученном пунктате костного мозга пациента и составляющем примерно 103 клеток, продуцируется примерно (1-2)×107 МСК, необходимых для проведения успешной трансплантации стволовых клеток.

Магнитные частицы (d=2,8 мкм) вводят в цитоплазму мезенхимальных стволовых клеток по следующей методике. По достижении 80-90% конфлюентности к культуре МСК добавляют суспензию магнитных частиц. Магнитные частицы предварительно обрабатываю поверхностно-активными веществами для создания условий проникновения в цитоплазму клетки. Клетки инкубируют с частицами 24 ч в CO2-инкубаторе. После инкубации культуральную среду меняют и клетки 5-кратно отмывают от свободных магнитных частиц раствором Хенкса. Эффективность мечения МСК магнитными частицами по данной технологии составляет порядка 90%. Жизнеспособность стволовых клеток составляет 95%.

Готовый трехкомпонентный комплекс может иметь любые формы, размеры и пространственную конфигурацию, которые выбирают и моделируют в зависимости от форм, размеров и конфигурации участка глазного яблока или зрительного нерва, к которому планируют экстрасклеральную имплантацию комплекса. Для этого выполняют заготовку необходимой формы, размеров и конфигурации из полимерного магнитного материала системы самарий-кобальт или ниодим-железо-бор с индукцией постоянного магнитного поля 1,5 мТл с многополюсным реверсивным намагничиванием. Толщина магнитного материала - 0,2 мм. Намагничивание полимерного магнитного материала может быть произведено, например, как описано в патенте РФ №2187162.

Из биологического материала, например, твердой мозговой оболочки или склеры, или коллагена, или аллопланта, или из синтетического мелкопористого материала, например, гидрогеля или дигеля, или полиэфирного полотна, или силиконовой губки и т.п. выполняют заготовку такой формы и размеров, чтобы в последующем ее можно было прикрепить к заготовке из полимерного магнитного материала.

МСК, меченные магнитными микрочастицами, наслаивают на поверхность заготовки из биологического синтетического мелкопористого материала. Затем под чашку Петри с наслоенными на материал МСК, меченными магнитными микрочастицами, подводят внешнее магнитное поле с напряженностью 30 мТл. При этом размер и форма внешнего магнита соответствует размеру и форме заготовки из биологического или синтетического материала. Таким образом, между внешним магнитом и МСК, содержащими магнитные частицы, находится биологический или синтетический мелкопористый материал. МСК, содержащие магнитные частицы, быстро и глубоко транслоцируются в слои биологического или синтетического мелкопористого материала под действием магнитного поля. Их закрепление и распластывание происходит в течение 1-1,5 часов после нанесения. Закрепленные клетки прочно удерживаются в слоях пористого материала даже в токе культуральной жидкости, что моделировалось в эксперименте с использованием перистальтического насоса. Клетки, содержащие магнитные микрочастицы, пролиферируют, полностью покрывая поверхность биологического или синтетического мелкопористого материала, что доказывает сохранение функциональных свойств МСК.

В завершении полученную структуру «МСК - биологический или синтетический мелкопористый материал» прочно скрепляют, например, при помощи шовной фиксации или биологического клея с заготовкой из полимерного магнитного материала.

Применение трехкомпонентного комплекса для клеточной терапии в лечении различной офтальмопатологии, сопровождающейся дистрофическими, атрофическими и т.п. процессами иллюстрируется следующими данными.

Применение трехкомпонентного комплекса для хирургического лечения прогрессирующей и осложненной миопии.

Используют трехкомпонентный комплекс в виде плоской лопатки длиной 16 мм и толщиной 0,8-1,0 мм, с полотном, имеющим структуру «МСК - биологический или синтетический мелкопористый материал», длиной 13 мм и площадью 50-65 мм², предназначенным для имплантации к заднему полюсу глаза, и ножкой, лишенной структуры «МСК - биологический или синтетический мелкопористый материал», шириной до 2 мм и длиной 3 мм, предназначенной для подшивания имплантата к склере. Полотно комплекса может иметь овальную, или прямоугольную, или форму трапеции, например, равнобедренной. Прямоугольное и трапециевидное полотно может быть выполнено со скругленными углами для удобства имплантации. Ножка может иметь, например, полуовальную или прямоугольную форму. Прямоугольная ножка может быть выполнена со скругленными углами.

Склеропластическую операцию с использованием трехкомпонентного комплекса выполняют следующим образом. В нижне- и верхненаружном квадранте, отступя от лимба на 6 мм, производят разрезы конъюнктивы и теноновой оболочки длиной 8-9 мм, с помощью шпателя формируют два тоннеля по направлению к заднему полюсу глаза с таким расчетом, чтобы в каждый из них свободно поместился трехкомпонентный комплекс. Каждый трехкомпонентный комплекс погружается под теноновой оболочкой дистальной частью к заднему полюсу глаза и фиксируется к склере в 10 мм от лимба за ножку. Операцию заканчивают наложением швов на конъюнктиву и введением под нее антибиотика.

Клинический пример. Пациентка З., 14 лет. Диагноз: прогрессирующая миопия высокой степени OU. Обратилась с жалобами на постепенное снижение зрения, начиная с 8 лет. Значительное ухудшение зрения отмечает за последний год.

Острота зрения OD 0.04 sph -7.0=0.8

OS 0.05 sph -6.5=0.8

ПЗО OD 26.2 мм

OS 26.0 мм

Акустическая плотность склеры в области заднего полюса OU=40,25 Дб.

Показатели электроретинограммы на белый свет демонстрируют снижение значений амплитуды «а» и «в» волн: волна «а»=41 мкВ; волна «в»=69 мкВ.

При осмотре периферических отделов глазного дна выявлены участки решетчатой дистрофии сетчатки OD в верхнем секторе, OS - в наружном секторе.

Проведена склеропластическая операция. В ходе операции к заднему полюсу глаза имплантировали два трехкомпопентных комплекса, содержащих МСК, меченные магнитными микрочастицами, транслоцированные в гидрогель, который был прочно скреплен при помощи шовной фиксации с полимерным магнитным материалом системы самарий-кобальт с индукцией постоянного магнитного поля 1,5 мТл, с многополюсным реверсивным намагничиванием. Комплексы имели вид плоской лопатки длиной 16 мм и толщиной 0,8 мм, с овальным полотном длиной 13 мм и площадью 65 мм² и прямоугольной ножкой шириной 2 мм и длиной 3 мм.

Через 1.5 года после операции:

Острота зрения OD 0.05 sph -7.0=0.9

OS 0.05 sph -6.0=1.0

ПЗО OD 26.2 мм

OS 26.0 мм

Акустическая плотность склеры в области заднего полюса OU=45,4 Дб.

Показатели электроретинограммы на белый свет демонстрируют увеличение значений амплитуды «а» и «в» волн: волна «а»=43 мкВ; волна «в»=74 мкВ. При осмотре периферических отделов глазного дна состояние сетчатки стабильное, без увеличения дистрофических изменений.

Склеропластические операции с имплантацией к заднему полюсу глаза трехкомпонентных комплексов выполнены у 7 пациентов (10 глаз) с прогрессирующей и осложненной миопией.

Использовали трехкомпонентные комплексы, содержащие МСК, меченные магнитными микрочастицами, транслоцированные в биологический материал: твердую мозговую оболочку или склеру, или коллаген, или аллоплант, - или синтетический мелкопористый материал: гидрогель или дигель, или полиэфирное полотно, или силиконовую губку, - который был прочно скреплен при помощи шовной фиксации или биологического клея с полимерным магнитным материалом системы самарий-кобальт или ниодим-железо-бор с индукцией постоянного магнитного поля 1,5 мТл, с многополюсным реверсивным намагничиванием. Комплексы имели вид плоской лопатки длиной 16 мм и толщиной 0,8-1,0 мм, с овальным, или прямоугольным, или трапециевидным полотном длиной 13 мм и площадью от 50 до 65 мм² и полуовальной или прямоугольной ножкой шириной до 2 мм и длиной 3 мм. В каждом случае имплантировали по два трехкомпонентных комплекса.

Сроки наблюдения - до 2-х лет. Во всех случаях отмечена стабилизация зрительных функций и параметров ПЗО, увеличение акустической плотности склеры в области заднего полюса с 41,1±0,3 до операции до 45,3±0,5 через 2 года после операции, отсутствие признаков дистрофических изменений на периферии сетчатки или их прогрессирования.

Применение трехкомпонентного комплекса для лечения атрофии зрительного нерва различной этиологии.

Используют трехкомпонентный комплекс в виде двух полуцилиндров. Высота каждого полуцилиндра - 4 мм, внутренний радиус основания - 4 мм.

Трехкомпонентный комплекс имплантируют следующим образом. В нижне-внутреннем и верхне-наружном квадрантах, отступя от лимба 5 мм, выполняют два разреза конъюнктивы и тепоновой оболочки на протяжении 7-8 мм, после чего тупым путем формируют два тоннеля к заднему полюсу глазного яблока навстречу друг к другу, затем в тоннели вводят и размещают трехкомпонентный комплекс, состоящий из двух полуцилиндров, которыми охватывают зрительный нерв, задние короткие цилиарные артерии и часть ретробульбарной клетчатки, не смыкая их. Операцию заканчивают наложением шва на конъюнктиву.

Под наблюдением находились 8 пациентов (8 глаз) в возрасте от 40 до 65 лет с атрофиями зрительного нерва различной этиологии. Острота зрения до лечения у пациентов варьировала от 0,05 до 0,125.

Во всех случаях использовали трехкомпонентный комплекс в форме двух полуцилиндров, каждый высотой 4 мм, внутренний радиус основания - 4 мм, содержащий МСК, меченные магнитными микрочастицами, транслоцированные в биологический или синтетический мелкопористый материал, например, твердую мозговую оболочку или склеру, или коллаген, или аллоплант, или синтетический мелкопористый материал, например, гидрогель или дигель, или полиэфирное полотно, или силиконовую губку, который скреплен с полимерным магнитным материалом системы самарий-кобальт или ниодим-железо-бор с индукцией постоянного магнитного поля 1,5 мТл, с многополюсным реверсивным намагничиванием.

В нижне-внутреннем и верхне-наружном квадрантах, отступя от лимба 5 мм, выполняли два разреза конъюнктивы и теноновой оболочки на протяжении 7-8 мм, после чего тупым путем формировали два тоннеля к заднему полюсу глазного яблока навстречу друг к другу, затем в тоннели вводили и размещали трехкомпонентный комплекс, состоящий из двух полуцилиндров, которыми охватывали зрительный нерв, задние короткие цилиарные артерии и часть ретробульбарной клетчатки, не смыкая их. Операцию заканчивали наложением обвивного непрерывного кетгутового шва на конъюнктиву.

Через 12 месяцев после лечения отмечено повышение остроты зрения во всех случаях от 0,05 до 0,1. У всех пациентов выявлено расширение границ поля зрения от 10 до 30 градусов, а также улучшение по данным ЭЛ и ПЭЧ. Линейная скорость кровотока в центральной артерии сетчатки во всех случаях увеличилась и составила в среднем 6,1±0,04 см/сек по сравнению с исходной 4,6±0,02 см/сек.

Применение трехкомпонентного комплекса для лечения «сухой» формы возрастной макулярной дегенерации.

Используют трехкомпонентный комплекс в форме круга диаметром 6 мм, содержащий МСК, меченные магнитными микрочастицами, транслоцированные в биологический или синтетический мелкопористый материал, который прочно скреплен с полимерным магнитным материалом с индукцией постоянного магнитного поля 1,5 мТл, с многополюсным реверсивным намагничиванием.

Трехкомпонентный комплекс имплантируют экстрасклерально в проекции макулярной зоны. В верхненаружном квадранте в 4 мм от лимба выполняют разрез конъюнктивы длиной 6 мм концентрично лимбу и с помощью шпателя формируют туннель в субтеноновом пространстве по направлению к заднему полюсу глаза. В туннель вводят трехкомпонентный комплекс, при этом с помощью шпателя производят склерокомпрессию для локализации положения комплекса при постоянном контроле с помощью бинокулярного офтальмоскопа. По завершении имплантации конъюнктиву ушивают непрерывным швом.

Под наблюдением находилось 7 пациентов (7 глаз) с «сухой» формой ВМД в возрасте от 60 до 68 лет. Острота зрения до лечения у пациентов варьировала от 0,08 до 0,12.

Во всех случаях использовали трехкомпонентные комплексы в форме круга диаметром 6 мм, содержащие МСК, меченные магнитными микрочастицами, транслоцированные в биологический материал: твердую мозговую оболочку или склеру, или коллаген, или аллоплант, - или синтетический мелкопористый материал: гидрогель или дигель, или полиэфирное полотно, или силиконовую губку, - который был прочно скреплен при помощи шовной фиксации или биологического клея с полимерным магнитным материалом системы самарий-кобальт или ниодим-железо-бор с индукцией постоянного магнитного поля 1,5 мТл, с многополюсным реверсивным намагничиванием.

Комплексы имплантировали экстрасклерально в проекции макулярной зоны. В верхненаружном квадранте в 4 мм от лимба выполняли разрез конъюнктивы длиной 6 мм концентрично лимбу и с помощью шпателя формировали туннель в субтеноновом пространстве по направлению к заднему полюсу глаза. В туннель вводили трехкомпонентный комплекс, при этом с помощью шпателя производили склерокомпрессию для локализации его положения при постоянном контроле с помощью бинокулярного офтальмоскопа. По завершении имплантации конъюнктиву ушивали непрерывным швом.

Через 12 месяцев после проведенного лечения во всех случаях острота зрения повысилась на 0,1-0,35, отмечено повышение фовеальной светочувствительности сетчатки по данным компьютерной периметрии, а также увеличение амплитуды а-волны и б-волны по данным макулярной электроретинограммы, которое свидетельствовало о повышении функциональной активности сетчатки. При исследовании гемодинамики у всех пациентов отмечалось увеличение средней скорости кровотока в глазничной артерии, центральной артерии сетчатки и в задних коротких цилиарных артериях. Полученные результаты оставались стабильными в течение всего периода наблюдения. Сроки наблюдения составили от 12 до 36 месяцев.

Таким образом, предложенное изобретение обеспечивает возможность моделирования трехкомпонентного комплекса с приданием ему любой формы, размеров и пространственной конфигурации, пригодной для экстрасклеральной имплантации к любому участку глазного яблока или зрительного нерва и фиксации его там в течение времени, необходимого для достижения требуемого лечебного эффекта.