Результат интеллектуальной деятельности: Способ моделирования туберкулезной инфекции in vitro

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к способам моделирования туберкулезной инфекции in vitro, и может быть использовано при изучении молекулярных и клеточных механизмов патогенеза туберкулеза, эффективности противотуберкулезных препаратов и прочих лекарственных веществ, влияющих на взаимодействие клеток иммунной системы больного человека с микобактерией туберкулеза.

Отличительной чертой туберкулезного процесса является формирование специфических гранулем, представляющих собой хорошо организованные динамичные клеточные структуры, основным составляющим компонентом которых являются клетки иммунной системы находящиеся на разной стадии дифференцировки и в разной функциональной активности. Формирование туберкулезной гранулемы начинается сразу после инфицирования человека за счет направленной миграции к очагу макрофагов, Т- и В-лимфоцитов, нейтрофилов и прочих клеток преимущественно из периферической крови. В зависимости от выраженности и направленности иммунных реакций в гранулеме, микобактерия туберкулеза может элиминироваться, приводя к полному выздоровлению, либо длительно персистировать в гранулеме (так называемая латентная туберкулезная инфекция), либо активироваться, диссеминировать и вызывать активные формы туберкулеза. (1). Микобактерии туберкулеза, находясь внутриклеточно в гранулеме также претерпевают изменения, часто переходя в дормантное состояние и приобретая антибиотикорезистентность (2). Экспериментальные модели туберкулезной инфекции, основанные на использовании экспериментальных животных, из-за значительного отличия функционирования иммунной системы, не способны полностью охватить особенности иммунопатогенеза туберкулеза у человека (3), поэтому перспективным является использование моделей туберкулезной инфекции in vitro (1; 4).

Известно несколько способов моделирования трехмерных гранулематозиых структур in vitro, используемых для изучения взаимодействий микобактерий туберкулеза и клеток макроорганизма. В способе, предложенном К.А. Birkness и соавт.(5), использовались мононуклеарные клетки периферической крови в равных соотношениях с аутологичными макрофагами, к которым добавляли микобактерий туберкулеза. Культивирование клеток проводили на пластике с низкими адгезивными свойствами. В получавшихся при этом гранулемах часть клеток все равно прилипала к дну культуральной посуды и сформированные структуры носили смешанный двух-трехмериый характер. Причем агрегаты клеток были небольшими по размеру - до 10-15 клеток, а для получения более крупных структур требовалось добавление цитокинов (IL-2, TNFα или IFNγ), что является дополнительным артифициальным фактором и искажает протекающие в физиологических условиях процессы. Обязательное использование специального культуралыюго пластика с низкими адгезивными свойствами делает этот метод довольно дорогостоящим.

Известен также способ (6), при котором предлагается использовать агарозный гель, которым предварительно покрывают лунки 96-луиочного культурального планшета. Суспензия моиоиуклеарных клеток в культуральной среде на основе питательной среды RPMI помещается поверх застывшего агарозного геля. Дальнейшее культивирование осуществляется при избегании малейших механических воздействий - условие, которое надо соблюдать и при смене культуральной среды, иначе гранулемы не формируются. Выполнить это условие довольно сложно, что делает метод малонадежным. Использование в качестве матрикса линейного полисахарида агарозы нежелательно, так как она взаимодействует с рецепторами на поверхности макрофагов, меняя реактивность этих гранулем-образующих клеток. Кроме того, агароза - довольно дорогой по стоимости субстрат.

Описан способ (7), в котором трехразмерные туберкулезные гранулемы in vitro получали из мононуклеаров периферической крови, используя микрошарики сефарозы, покрытые микобактериальными антигенами, либо инфицированные микобактериями. Недостатком способа является необходимость использования инородного материала и, таким образом, существенные отличия структуры гранулем от тех, которые формируются при реальном заболевании.

Наиболее близким к заявленному является способ формирования гранулем в коллагеновом матриксе (8), заключающийся в выделении мононуклеарных клеток периферической крови на градиенте плотности фиколла с последующим их суспендированием в растворе, состоящем из коллагена 95%, фибронектина 4% и NaOH 1%. При этом для формирования гранулемоподобных структур к 50 мкл раствора добавляется 50000 мононуклеарных клеток, микобактерий туберкулеза добавляются к клеткам в соотношении 1:10. Формирование трехмерной структуры происходит в течение 45 минут при температуре 37°С.

Указанный способ имеет несколько недостатков:

1. В качестве веществ для формирования трехмерного матрикса используются коммерческие препараты коллаген и фибронектин, которые обладают иммуногенными свойствами и могут оказывать влияние на взаимодействие мононуклеарных клеток крови.

2. Технические особенности способа не позволяют использовать объем трехмерной структуры более 50 мкл с 50000 мононуклеарных клеток, что создает неудобства для манипуляций и накопления необходимого материала для исследований.

3. Авторы указывают, что при других соотношениях микобактерий и мононуклеарных клеток, кроме как 1:10, гранулемы не формируются

4. Длительное время формирования матрикса приводит к тому, что большая часть клеток оседает на дно и не участвует в формировании трехмерной гранулемоподобной структуры.

Предлагаемый способ моделирования туберкулезной инфекции in vitro путем получения гранулемоподобных структур из мононуклеарных клеток венозной крови в присутствии микобактерий туберкулеза, культивируемых в трехмерном матриксе, отличающийся тем, что мононуклеарные клетки крови ресуспендируют в аутоплазме крови с добавлением в полученную взвесь микобактерий туберкулеза в соотношении возбудитель: клетка от 3:1 до 1:50, с последующим добавлением 10% CaCl₂ из расчета 150 мкл на 1 мл клеточной суспензии, что позволяет более полно отобразить особенности иммунопагенеза туберкулезной инфекции у человека за счет использования аутологичных тканей, расширить возможности использования этой модели в эксперименте, за счет использования более широкого спектра соотношений микобактерия/клетка и привлечения других, участвующих в граунклемогенезе типов клеток, а также отказаться от использования дорогостоящих коммерческих реактивов и специфической аппаратуры. Кроме того, активация факторов свертывания крови наступает сразу после добавления CaCl₂, плазматической сгусток формируется через 10-15 минут, при этом клетки не успевают осесть на дно культурального планшета и оказываются в фибриновой сети, которая, тем не менее, не мешает их направленной миграции. Использование в качестве матрикса аутологичной плазмы исключает артифициальные воздействия, связанные с использованием гетерологичных материалов. При использовании указанного способа, мы наблюдали формирование гранулем при добавлении микобактерий туберкулеза в соотношении к мононуклеарных клеткам от 3:1 до 1:50, что позволяет существенно расширить решаемые экспериментальные задачи. Еще одним преимуществом заявляемого способа является возможность его осуществления без применения дорогостоящих реактивов, что позволяет широко использовать его в практике научных исследований иммунопатологических механизмов гранулемогенеза при развитии туберкулезного процесса, изучении иммунологических механизмов, регулирующих процессы образования и эволюции гранулем при инфекционных гранулематозных воспалительных процессах, при поиске, разработке и изучении новых противотуберкулезных препаратов.

Способ осуществляется следующим образом: проводится забор периферической крови в стерильную одноразовую пробирку с хелатором двухвалентных катионов (ЭДТА или цитрат натрия). Выделение мононуклеарных клеток крови проводится центрифугированием на градиенте плотности, например, с использованием фиколла с плотностью 1,077 г/см³. После центрифугирования плазма крови собирается в отдельную пробирку и стерилизуется фильтрованием через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм. Полученные мононуклеарные клетки дважды отмываются от фиколла в культуральной среде или солевом буферном растворе, не содержащем кальция и магния. Далее мононуклеарные клетки ресуспендируются в аутоплазме в соотношении 1 млн клеток на 1 мл плазмы. К суспензии клеток добавляются микобактерий туберкулеза в соотношении микобактерия/клетка от 3:1 до 1:50 в зависимости от задач эксперимента. Суспензия мононуклеарных клеток и микобактерий туберкулеза в аутоплазме перемещается в лунки 96-луночного планшета в объеме 150 мкл. Активация образования плазматического сгустка, содержащего клетки и микобактерий, осуществляется добавлением 10% CaCl₂ в количестве 150 мкл на 1 мл суспензии. Затем планшет инкубируется в течение 30 минут при 37°С, 5% CO₂ и 96% влажности, и далее в лунки добавляется культуральная среда типа IMDM или RPMI-1640 в количестве 100 мкл. Смена среды выполняется через 24 часа и затем каждые 3-4 суток. При этом более 95% клеток сохраняют свою жизнеспособность на сроках 7 и 10 дней. Через 24 часа можно наблюдать формирование трехмерных структур, состоящих из мононуклеарных клеток периферической крови (моноциты и лимфоциты) размерами от 10 до 200 клеток - процесс, в основе которого лежит хемотаксис лимфоцитов к фагоцитировавшим микобактерий туберкулеза моноцитам. При наблюдении в более поздние сроки, клеточные структуры увеличиваются в размерах за счет привлечения новых клеток, моноциты подвергаются дифференцировке в макрофаги и, в дальнейшем, в эпителиоидные клетки – процесс, во многом напоминающий таковой при развитии туберкулезной инфекции у человека. При окраске с нитросиним тетразолием видно, что моноциты-макрофаги, расположенные в толще гранулемы, активируются с образованием активных форм кислорода, сами гранулемы состоят из моноцитов, макрофагов и лимфоцитов без примеси нейтрофилов и эритроцитов. Трехмерные гранулемоподобные структуры формируются также при добавлении к суспензии мононуклеарных клеток крови клеток иного гистогенетического происхождения (мезенхимальные стромальные клетки), лекарственных препаратов (рифамипицин), а также при использовании мононулеарных клеток лабораторного животного (спленоциты мыши).

Пример 1. Вакуумную пробирку BD Vacutainer® СРТ™ для выделения моноцитов и лимфоцитов, содержащую цитрат натрия и разделительную систему гель/Ficoll™, заполняют кровью из локтевой вены человека, аккуратно тщательно перемешивают, центрифугируют при 1500 g 20 мин, затем плазму, находящуюся над поверхностью полученного мононуклеарного клеточного слоя отбирают пипеткой, переносят в отдельную пробирку и стерилизуют фильтрованием через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм, мононуклеары переносят в другую пробирку и отмывают от фиколла и плазмы, для чего добавляют 10 мл раствора Хэнкса без ионов кальция и магния, центрифугируют 10 мин при 1500 g и супернатант осторожно декантируют; последнюю процедуру повторяют еще гранулемы, состоящие из 10-20 клеток в количестве 10-30 гранулем на лунку, причем в составе гранулем обнаруживаются CFSE-меченые клетки.

Пример 4. Все процедуры идентичны таковым в Примере 1, но при смене культуральной среды в лунках планшета с гранулемами добавляли антибактериальный препарат рифампицин. После окончания культивирования через 10 при конфокальной микроскопии фиксированного плазматического сгустка наблюдали уменьшение количества микобактерий в гранулемах как вне-, так и внутриклеточно. Уменьшение микобактериальной нагрузки подтвердилось последующими микробиологическими методами при посеве гомогенизированного плазматического сгустка на твердые питательные среды. Аналогично, при смене культуральной среды использовали не рифампицин, а иммуномодулирующий препарат полудан, добавление которого приводило к увеличению клеточности трехмерных гранулемоподобных структур, уменьшению микобактериальной нагрузки.

Способ опробован в экспериментальной лаборатории ФГБУ «Новосибирский научно-исследовательский институт туберкулеза» Минзрава России. Общий объем экспериментальной работы представлен в таблице:

раз. Далее подсчитывают число выделенных клеток, ресуспендируют их в плазме в соотношении 1 млн клеток на 1 мл плазмы, к суспензии мононуклеарных клеток добавляют микобактерий туберкулеза в различных пропорциях микобактерия/клетка - от 3:1 до 1:50, перемешивают и переносят в лунки 96-луночного планшета в объеме по 150 мкл. Затем в лунки раскапывают по 15 мкл 10% раствора кальция хлорида, планшет помещают в СО₂-инкубатор при 37°С, 5% CO₂ и 96% влажности, и через 30 минут инкубации в лунки добавляют культуральную питательную среду RPMI-1640 в количестве 100 мкл. Через 24 часа в составе сгустка наблюдаются гранулематозные очаги размером 10-200 клеток в количестве от 10 до 30 гранулем на лунку.

Пример 2. Все процедуры идентичны таковым в Примере 1, за исключением того, что суспензию клеток в концентрации 1 млн на 1 мл получают не из мононуклеарных клеток крови человека, а из спленоцитов лабораторной мыши и используют аутоплазму кроми. В данном примере, предназначенном для демонстрации возможности формирования гранулем не из мононуклеаров крови, а из сложной смеси мононуклеаров и других клеток лабораторных животных, взвесь спленоцитов получали стандартным методом из селезенки мыши, а кровь - из ретроорбитального синуса. После 24-часовой инкубации в сгустках наблюдали сформированные гранулемы, состоящие из 5-15 клеток в количестве 15-30 гранулем на лунку.

Пример 3. Получают суспензию мононуклеаров в аутоплазме точно так же, как в Примере 1, но затем к суспензии мононуклеарных клеток добавляют клетки иного гистогенеза. В данном примере, предназначенном для демонстрации возможности изменения клеточной композиции гранулем, готовили суспензию, состоящую из 750 тыс.мононуклеаров крови и 250 тыс мезенхимальных стромальных клеток человека костно-мозгового происхождения, предварительно меченых флуоресцентным красителем CFSE. В результате через 24 часа инкубации в сгустке выявляются.

При использовании указанного метода трехмерные гранулемоподобные структуры получали при спектре соотношений микобактерия/клетка от 3:1 до 1:50. Аналогичный результат получали при использовании спленоцитов лабораторной мыши. При добавлении к суспензии мононуклеарных клеток крови мехенхимальных клеток костномогового происхождения отмечали включение последних в состав гранулем с изменением клеточного состава гранулем и количества в них микобактерий. В серии экспериментов с добавлением антибактериального препарата отмечали изменение клеточности гранулем и микобактериальной нагрузки.

Таким образом, указанный метод позволяет стабильно получать трехмерные туберкулезные гранулемы in vitro без использования гетерологичных коммерческих препаратов, что позволяет исключить атрифициальные воздействия на тонкие механизмы взаимодействия клеток иммунной системы in vitro. Технологические особенности формирования трехмерного матрикса из аутоплазмы позволяют формировать плазматический сгусток объемом до 200 мкл, что в совокупности с более широким спектром соотношений клетка/микобактерия позволяет расширять спектр решаемых экспериментальных задач, в частности добавлять к клеточной суспензии клетки иного генеза, изучать эффективность и механизмы действия антибактериальных и иммуномодулирующих препаратов. Сокращение времени формирования трехмерного матрикса с 40 до 10-15 минут приводит к тому, что большая часть клеток остается в суспензии и сформированные гранулемы носят характер истинных трехмерных структур. Отказ от дорогостоящих коммерческих реактивов также позволяет широко использовать его в практике научных исследований иммунопатологических механизмов гранулемогенеза при развитии туберкулезного процесса, изучении иммунологических механизмов, регулирующих процессы образования и эволюции гранулем при инфекционных гранулематозных воспалительных процессах, при поиске, разработке и изучении новых противотуберкулезных препаратов.

Список литературы

1. S. Bhavanam, G.R. Rayat, M. Keelan, D. Kunimoto, S.J. Drews. Understanding the pathophysiology of the human ТВ lung granuloma using in vitro granuloma models // Future Microbiol. (2016) 11(8), 1073-1089

2. V. Peddireddy, S. N. Doddam, N. Ahmed. Mycobacterial Dormancy Systems and Host Responses in Tuberculosis // Front Immunol. (2017) 8: 84

3. I. Kramnik, G. Beamer. Mouse models of human ТВ pathology: roles in the analysis of necrosis and the development of host-directed therapies // Semin Immunopathol. 2016 Mar;38(2):221-37.

4. D. Evangelopoulos, J. Diniz da Fonseca, S. Waddell Understanding anti-tuberculosis drug efficacy: rethinking bacterial populations and how we model them // International Journal of Infectious Diseases 32 (2015) 76-80.

5. K.A. Birkness, J. Guarner, S.B. Sable, R.A. Tripp, K.L. Kellar, J. Bartlett, F.D. Quinn. An in vitro model of the leukocyte interactions associated with granuloma formation in Mycobacterium tuberculosis infection // Immunology and Cell Biology (2007) 85, 160-168

6. U. Seitzera J. Gerdesb, Generation and Characterization of Multicellular Heterospheroids Formed by Human Peripheral Blood Mononuclear Cells // Cells Tissues Organs 2003; 174:110-116

7. Puissegur M.P., Botanch C, Duteyrat J.L., Delsol G., Caratero C, and Altare F. (2004). An in vitro dual model of mycobacterial granulomas to investigate the molecular interactions between mycobacteria and human host cells. Cell.Microbiol. 6, 423-433.

8. N. Kapoor, S. Pawar, T.D. Sirakova, C. Deb, W.L. Warren, P.E. Kolattukudy. Human Granuloma In Vitro Model, for ТВ Dormancy and Resuscitation // Plos one (2013) 8(1) e53657.