СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИИ ЭРИТРОЦИТОВ ГЕНЕРИРОВАТЬ ОКСИД АЗОТА

Изобретение относится к медицине, в частности к лабораторной диагностике, и позволяет определить способность эритроцитов генерировать оксид азота (окись азота, NO). Изобретение может быть использовано для оценки вклада усиленной или пониженной NO-генерирующей функции эритроцитов в патогенез гипертонической болезни и других заболеваний, связанных с состояниями гипоксии, тромбоза, нарушения регуляции сосудистого тонуса и обмена оксида азота. Кроме того, изобретение может быть использовано для оценки тяжести, прогноза и эффективности лечения этих заболеваний, а также для поиска новых фармакологических средств коррекции эритроцитарной дисфункции в экспериментальной фармакологии.

Оксид азота несет множество функций в поддержании сосудистого гомеостаза, включая контроль сосудистого тонуса, ингибирование тромбообразования, торможение агрегации эритроцитов, регуляцию экспрессии молекул эндотелиальной адгезии. Свободнорадикальная природа оксида азота, его минимальная способность к диффузии, короткое время жизни и быстрая реакция с гемоглобином позволяют этой молекуле быть местным сигнальным агентом для активации растворимой гуанилатциклазы, что приводит к синтезу цГМФ и к цГМФ-зависимой вазодилятации [1, 2]. В последние годы появились доказательства того, что кроме локального воздействия короткоживущего оксида азота существуют дистантные эффекты этой молекулы, в том числе вазодилятация, вызванная гипоксией. Дистантные эффекты NO связаны с существованием его циркулирующего резервуара в виде молекул нитрита ( , продукт одноэлектронного окисления NO), присутствующих в эритроцитах (290 нМ) и в плазме (120 нМ) [3]. В тканях с изменением pH и градиента кислорода восстанавливается разнообразными ферментами и модулирует экспрессию белков, обмен веществ, ангиогенез, цитопротекцию и пр. В кровотоке под влиянием гипоксии нитритредуктаза, взаимодействуя с , образует NO, вызывая вазодилятацию [4]. В этой реакции нитритредуктазной активностью обладает железосодержащий деоксигенированный гемоглобин [deoxyHb(Fe²⁺)], формирующий в присутствии протона оксид азота и метгемоглобин. Далее deoxyHb(Fe²⁺) под действием оксида азота может нитрозилироваться. Нитрит, содержащийся в эритроцитах, может служить источником оксида азота не только за счет нитритредуктазной активности deoxyHb(Fe²⁺), но также за счет восстановления эритроцитарной ксантиноксидоредуктазой, либо спонтанного или усиленного карбангидразой диспропорционирования [5, 6, 7]. Кроме того, эритроцитарными источниками NO в условиях гипоксии могут быть гем-нитрозил-гемоглобин [8] и S-нитрозогемоглобин [9, 10, 11]. Небольших концентраций оксида азота (EC₅₀=5-10 нМ), покидающих эритроциты, достаточно для индукции вазодилятации. Важно, что при гипоксии способность эндотелиальной NO-синтазы генерировать оксид азота весьма лимитирована [12], и в этих условиях основным источником оксида азота становятся эритроциты.

Гипоксическая вазодилятация - фундаментальный компенсаторно-приспособительный ответ, повышающий перфузию ткани при недостатке кислорода. Наряду с повышением доставки кислорода за счет вазодилятации, генерируемый в эритроцитах NO ингибирует митохондриальное дыхание, тем самым уменьшая потребление кислорода [13]. Эти механизмы, а также значение оксида азота в подавлении тромбообразования и агрегации эритроцитов позволяют утверждать, что в условиях ишемии эритроцитарная продукция NO представляет собой ключевой механизм поддержания сосудистого гомеостаза.

Несмотря на столь серьезную роль депонирования и генерации оксида азота в эритроцитах, количественных методов оценки этой функции эритроцитов не существует. В настоящее время используются лишь методы исследования in vivo, оценивающие реакцию сосудистой стенки или содержание в крови метаболитов и дериватов оксида азота.

Недостатком таких методов является, в частности, то, что получаемые при этом показатели отражают интегральный ответ, включающий не только состояние эритроцитарной NO-генерирующей функции/дисфункции, но и активность других сосудорасширяющих и NO-генерирующих механизмов. Значение собственно эритроцитарной дисфункции при этом не вычленяется.

Известен «Способ прогнозирования постгипоксической кардиопатии у новорожденных» (патент РФ №2228532, МКИ G01N 33/84), заключающийся в определении в крови беременных содержания нитритов, уровень которых при гипоксии плода существенно повышается.

Недостатками метода являются его узкая направленность, то есть ограниченная применимость при другой патологии, сложность интерпретации, связанная с вероятным влиянием независимых от гипоксии факторов, и невозможность оценки эритроцитарных резервов мобилизации оксида азота.

Известен способ прижизненного динамического определения содержания оксида азота в ткани мозга с помощью специального устройства/зонда в условиях экспериментальной глобальной ишемии головного мозга, вызванной двусторонней окклюзией каротидных артерий [14]. Способ применялся на крысах для оценки роли NO-синтаз, значение которых верифицировалось введением специфических ингибиторов. Роль NO-генерирующей функции/дисфункции эритроцитов при этом не оценивалась, хотя, с определенными оговорками, ее косвенная оценка при одновременном применении ингибиторов всех типов NO-синтаз при данном способе теоретически возможна.

Недостатками способа являются необходимость приобретения специального дорогостоящего оборудования, сложности технического осуществления способа, неудобства, связанные с работой на животных в условиях in vivo и обязательность использования ингибиторов.

Известен «Способ коррекции эндотелиальной регуляции сосудистого тонуса пациента» (патент РФ №2170102, МКИ A61K 38/55, G01N 33/48, A61M 16/00, A61P 9/12), который позволяет выявить дефицит оксида азота в биологических жидкостях с использованием гипоксического теста. Данный способ заключается в определении содержания нитратов и нитритов в биологических жидкостях пациента до и после интервально-гипоксической тренировки.

Недостатком данного метода является условие его использования у лиц без тяжелой патологии, так как гипоксия может усугубить течение заболевания. Другими недостатками являются приносящее неудобства пациенту трудо- и времязатратное проведение тренировки, а также оценка интегральной сосудистой, а не эритроцитарной дисфункции.

Известен «Способ оценки способности эндотелия сосудистой стенки к продукции и секреции монооксида азота» (патент РФ №2157089, МКИ A61B 5/021, G01N 33/84). Способ заключается в определении содержания оксида азота в крови пациента и в контрольной группе до и после компрессии кровеносных сосудов конечности (создание очага кратковременной локальной ишемии) и вычислении разности полученных величин у пациента в сравнении с данными в контрольной группе, по которой судят о способности эндотелия сосудистой стенки к продукции и секреции оксида азота.

Недостатками способа являются необходимость специальной работы с пациентом, сложность и неудобство для него процедуры проведения компрессионных манипуляций и невозможность оценки эритроцитарной NO-генерирующей функции/дисфункции.

Наиболее близким к заявляемому способу является метод прямого планшетного измерения генерации оксида азота гипоксичными эритроцитами в проточном микрожидкостном устройстве [15]. Метод осуществлялся на эритроцитах кроликов, полученных путем троекратного осаждения в центрифуге и отмывания в физиологическом растворе с последующим помещением клеток в буфер, содержащий кислород-поглощающий фермент оксиразу (Oxyrase Inc. Mansfield, ОН).

Недостатками метода являются невозможность его клинико-лабораторного использования из-за необходимости применения сложного технического обеспечения в виде устройства, пока существующего в единственном экспериментальном варианте, сложной пробоподготовки эритроцитов и использования дорогостоящего гипоксичного буфера.

Задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является разработка способа определения функции эритроцитов генерировать оксид азота, позволяющее выявлять способность эритроцитов к гипо-, нормо- или гиперпродукции NO в условиях гипоксии. Тем самым заявляемый способ позволит оценивать вклад эритроцитов в поддержание сосудистого гомеостаза.

Сущность данного способа определения функции эритроцитов генерировать оксид азота заключается в том, что образец крови обследуемого забирают в пробирку с антикоагулянтом, перемешивают, одну часть образца крови помещают в условия гипоксии, получают плазму крови и определяют в ней содержание оксида азота, одновременно содержание оксида азота определяют в плазме другой, не подвергавшейся гипоксии, части образца крови, вычисляют разницу полученных величин, сравнивают с аналогичным значением, полученным в контрольной группе, и по результату сравнения судят о состоянии функции эритроцитов генерировать оксид азота.

В качестве антикоагулянта можно использовать цитрат натрия, ЭДТА или гепарин.

Условия гипоксии можно создать:

а) помещением образца крови в атмосферу с малым содержанием кислорода, например, созданную такими приемами, как открытое пламя в замкнутом пространстве, откачивание воздуха, химическое поглощение кислорода, подача инертного газа или газовой смеси газ-генерирующим пакетом или мультигазовым инкубатором;

б) введением поглотителей кислорода, например, таких как сульфиты или оксираза, непосредственно в образец крови.

Полученную плазму перед определением в ней содержания оксида азота можно хранить в замороженном виде.

Результаты измерения можно выражать в виде концентрации нитритов, приходящейся на эритроцитарную фракцию гематокрита, или в виде концентрации нитритов, приходящейся на количество эритроцитов в единице объема крови, например на число эритроцитов в 1 л крови.

Способ осуществляют следующим образом.

Образцы крови получают натощак из локтевой вены, используя стандартные разовые стерильные вакуумные пробирки с антикоагулянтом, например с цитратом натрия. Сразу же после забора крови пробирки несколько раз переворачивают для перемешивания с антикоагулянтом. Образец крови обследуемого в объеме 4 мл помещают в два 24-луночного планшета, заполняя в каждом планшете по 2 лунки по 1 мл на лунку. Далее один планшет с кровью помещают на 30 минут в условия искусственно созданной гипоксии, например в герметичный контейнер, содержащий поглотитель кислорода (например, дитионит натрия), второй находится в условиях атмосферного воздуха. Плазму крови отделяют центрифугированием в течение 10 мин при 3000 об × мин^-1 и определяют содержание выделенного эритроцитами оксида азота по суммарному количеству его метаболитов (нитриты и нитраты), например, с использованием реактива Грисса [16]. Для определения нитратов их восстанавливают в нитриты, используя металлический кадмий, покрытый медью [16].

Для определения метаболитов оксида азота полученную плазму крови отбирают в 8 пробирок по 150 мкл в каждой, депротеинизируют путем добавления 7,5 мкл 2М ZnSO₄, встряхивают на шейкере 2 мин, центрифугируют 10 мин при 12000g и отбирают супернатант по 100 мкл в чистые пробирки. Пока происходит депротеинизация гранулы кадмия покрывают медью, для чего их трижды промывают деионизированной водой, помещают в 5 мМ раствор CuSO₄ на 5 мин, помешивая стеклянной палочкой, затем дважды промывают глицин-NaOH-буфером (pH 9,7), подсушивают и сразу используют. Четыре пробирки используют для определения нитритов. В остальные четыре пробирки добавляют по 33 мкл 0,2М глицин-NaOH буфера и 2 гранулы (d~2 мм) кадмия, покрытого медью, встряхивают 15 мин. Затем содержимое (жидкую часть) переносят в чистую пробирку и центрифугируют 7 мин при 12000g. Супернатант используют для определения нитритов. С этой целью в лунки 96-луночного планшета вносят в дублях по 50 мкл супернатантов, смешивают их с равным объемом реактива Грисса (смесь равных объемов 1% сульфаниламида в 30%-ной уксусной кислоте и 0,1% N-[1-нафтил]-этилендиамин дигидрохлорида в 60%-ной уксусной кислоте) и через 10 мин на планшетном спектрофотометре при длине волны 540 нм относительно лунок, в которые вместо реактива Грисса добавлена вода, измеряют оптическую плотность образцов. Содержание нитритов рассчитывают по калибровочному графику, построенному с использованием в качестве стандарта NANO₂. Результаты выражают в мкмолях нитритов на 1 л плазмы.

Чтобы иметь возможность судить о нормо-, гипо- или гиперфункции эритроцитов в отношении генерации оксида азота нами были определены нормальные значения данной функции в группе условно здоровых лиц. При этом варьировали условия определения, выясняя возможность использования разных антикоагулянтов, способов получения гипоксии in vitro, замораживания образцов плазмы перед определением метаболитов NO, использования теста с физической, пищевой, или фармакологической нагрузкой. Число обследуемых в каждой группе было ≥ 6. Достоверность различий между группами оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Результаты исследования с конкретными условиями определения NO-генерирующей функции эритроцитов в группе условно здоровых лиц представлены таблице 1.

Результаты исследования (табл. 1) свидетельствуют, что все использованные в исследовании условия позволяют адекватно судить об NO-генерирующей функции эритроцитов при сравнении с соответствующим контролем. Кроме того, представленные в таблице 1 результаты свидетельствуют, что данный способ имеет высокий уровень воспроизводимости.

В аналогичном исследовании образцы крови получали у больных с гипертонической болезнью и с сахарным диабетом 2-го типа. Условия определения были такими же, как в исследовании группы условно здоровых лиц. Число больных в каждой группе ≥ 6. В качестве антикоагулянта использовали цитрат натрия. Достоверность различий между группами оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Результаты исследования у больных приведены в таблице 2.

Полученные результаты демонстрируют достоверное снижение NO-генерирующей функции эритроцитов при данной патологии и заставляют думать о патогенетической роли эритроцитарной дисфункции в развитии ряда заболеваний и их осложнений.

Сущность заявляемого способа поясняется следующими примерами.

Пример 1. У обследуемого О. (условно здоровый) из локтевой вены в вакутейнер с цитратом натрия забрали 4 мл крови, цитратную кровь разделили на два образца. В плазме крови одного образца, не подвергавшегося гипоксии, содержание оксида азота (нитриты + нитраты) составило 5,2 мкмоль/л. Содержание выделенного эритроцитами оксида азота в другом образце, экспонированном в атмосфере с недостатком кислорода (горящая свеча в плотно закрытом эксикаторе), составило 10,3 мкмоль/л. Разница значений составила 5,1 мкмоль/л. Сравнивая данное значение с нормальным значением данной функции в контрольной группе (условно здоровые лица), можно сделать вывод, что NO-генерирующая функция эритроцитов соответствует норме.

Пример 2. У больного Ш. (гипертоническая болезнь) NO-генерирующую функцию эритроцитов определяли точно так же, как в примере 1. В плазме крови образца, не подвергавшегося гипоксии, содержание оксида азота (нитриты + нитраты) составило 3,4 мкмоль/л, а в образце, подвергнутом гипоксии - 4,9 мкмоль/л. Разница значений составила 1,5 мкмоль/л. Сравнивая данное значение с нормальным значением данной функции в контрольной группе (условно здоровые лица), можно сделать вывод о снижении NO-генерирующей функции эритроцитов.

Литература

1. Lundberg JO, Gladwin MT, Ahluwalia A, Benjamin N, Bryan NS, Butler A et al. Nitrate and nitrite in biology, nutrition and therapeutics. Nat ChemBiol 2009; 5: 865-869.

2. Lundberg JO, Weitzberg E, Gladwin MT. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. NatRevDrugDiscov 2008; 7: 156-167.

3. DejamA, Hunter CJ, Pelletier MM, Hsu LL, Machado RF, Shiva S et al. Erythrocytes are the major intravascular storage sites of nitrite in human blood. Blood 2005; 106: 734-739.

4. van Faassen EE, Bahrami S, Feelisch M, Hogg N, Kelm M, Kim-Shapiro DB et al. Nitrite as regulator of hypoxic signaling in mammalian physiology. Med Res Rev 2009; 29: 683-741.

5. Webb A, Milsom A, Rathod K, et al. Mechanisms underlying erythrocyte and endothelial nitrite reduction to nitric oxide in hypoxia: role for xanthine oxidoreductase and endothelial nitric oxide synthase. Circ Res. 2008; 103(9): 957-964.

6. Zweier JL, Wang P, Samouilov A, et al. Enzymeindependent formation of nitric oxide in biological tissues. Nat Med. 1995; 1(8): 804-809.

7. Aamand R, Dalsgaard T, Jensen FB, et al. Generation of nitric oxide from nitrite by carbonic anhydrase: a possible link between metabolic activity and vasodilation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2009; 297(6): H2068-H2074.

8. Herold S. The outer-sphere oxidation of nitrosyliron(II)hemoglobin by peroxynitrite leads to the release of nitrogen monoxide. Inorg Chem. 2004; 43(13): 3783-3785.

9. Jia L, Bonaventura C, Bonaventura J, et al. Snitrosohaemoglobin: a dynamic activity of blood involved in vascular control. Nature. 1996; 380: 221-226.

10. Gladwin MT, Lancaster Jr JR, Freeman В A, et al. Nitric oxide′s reactions with hemoglobin: a view through the SNO-storm. Nat Med. 2003; 9: 496-500.

11. Rassaf T, Bryan NS, Maloney RE, et al. NO adducts in mammalian red blood cells: too much or too little? Nat Med. 2003; 9: 481-482.

12. Dweik RA, Laskowski D, Abu-Soud HM, Kaneko F, Hutte R, Stuehr DJ et al. Nitric oxide synthesis in the lung. Regulation by oxygen through a kinetic mechanism. J Clin Invest 1998; 101: 660-666.

13. Shiva S., Rassaf Т., Patel R.P., and Gladwin M.T The detection of the nitrite reductase and NO-generating properties of haemoglobin by mitochondrial inhibition. Cardiovascular Research, 2011, 89: 566-573.

14. Liu K., Yan M., Zheng X., Yang Y. The dynamic detection of NO during the ischemic postconditioning. Nitric Oxide, 2014. - v. 38. - 17-25.

15. Halpin S.T. and Spence D.M. Direct plate-reader measurement of nitric oxide released from hypoxic erythrocytes flowing through a microfluidic device. Anal. Chem., 2010, - v. 82, - 7492-7497.

16. Navarro-Gonzálvez J.A., García-Benayas C., and Arenas J. Semiautomated measurement of nitrate in biological fluids. Clin. Chem., 1998; 44: 679-681.