Способ инактивации лекарственно чувствительных и лекарственно устойчивых штаммов Mycobacterium tuberculosis в экспериментальных условиях in vitro

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии.

Заболеваемость туберкулезом с множественной и широкой лекарственной устойчивостью возбудителя (МЛУ, ШЛУ) продолжает увеличиваться [1-3]. Эффективность лечения больных с лекарственно устойчивыми формами туберкулеза не превышает 55% по данным Global tuberculosis report 2018 [4-7]. В этой связи остается актуальным поиск новых способов эффективного лечения больных туберкулезом и преодоления лекарственной устойчивости возбудителя туберкулеза.

Антимикробная фотодинамическая терапия (АФДТ) рассматривается в качестве перспективного направления в лечении очагов туберкулезной инфекции. АФДТ - это метод, основанный на локальной активации видимым светом накопившегося в бактериях фотосенсибилизатора, который в присутствии тканевого кислорода индуцирует в микроорганизмах (клетках-мишенях) летальные свободно-радикальные реакции.

Для реализации процесса фотодинамической инактивации микробной флоры необходимы три компонента: вещество - фотосенсибилизатор, источник света с длиной волны светового излучения равной или близкой пику поглощения фотосенсибилизатора и молекулярный кислород. Фотосенсибилизатор, вводимый в очаг инфекции или в культуру микробных клеток, избирательно накапливается бактериальными клетками и при последующем облучении световой энергией переходит в возбужденное состояние, а при возврате в основное состояние отдает полученную энергию фотонов на молекулярный кислород, преобразуя его в активные формы кислорода, токсичные для микроорганизмов. Вследствие фотоиндуцированных окислительных процессов реализуется механизм прямого фотоповреждения непосредственно в микробных клетках.

В ряде экспериментальных исследований был убедительно продемонстрирован антимикобактериальный фотодинамической эффект [8, 9]. Из нескольких прототипов, показавших противотуберкулезное фотодинамическое действие [10, 11], наиболее близким к предлагаемому способу является способ ФДТ, описанный в Патенте RU С1 2628624 [12]. Однако, в приводимом исследовании в качестве фотосенсибилизатора использовался иной представитель лекарственных препаратов из семейства хлоринов - Фотодитазин, а последующая световая обработка микобактериальных суспензий осуществлялась излучением полупроводникового лазера Азор-2К-02 (Россия) на длине волны 660 нм при выходной мощности излучения 25 мВт, обеспечившей единственную эффективную плотность дозы световой энергии, равную 0,76 Дж/см². Поскольку посевы туберкулезных палочек производили на жидкую питательную среду Middlebrook 7Н9 в индикаторные пробирки MGIT автоматизированной системы ВАСТЕС™ MGIT™ 960 (Becton Dickinson, Sparks, MD), оценку эффективности фотодинамической инактивации осуществляли исключительно по срокам задержки роста возбудителя туберкулеза в днях в сравнении с контролем, что не является фактом утраты жизнеспособности микобактерии. Кроме того, исследование предусматривало инактивацию только клинических штаммов микобактерий туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью возбудителя и не включало оценку инактивации лекарственночувствительных и музейных штаммов.

Предлагаемый способ инактивации лекарственночувствительньгх и лекарственноустойчивых штаммов Mycobacterium tuberculosis (МБТ) в экспериментальных условиях in vitro посредством фотодинамической инактивации отличается тем, что предварительную фотосенсибилизацию суспензии микобактерий исследуемого штамма с бактериальный числом 3×10 микробных тел/мл осуществляют фотосенсибилизирующим препаратом Фотосенс из класса фталоцианинов с последующим облучением культуры микробных клеток световой энергией лазерного генератора на длине волны, равной или близкой пику поглощения фотосенсибилизатора в диапазоне 662-675 нм при выходной мощности излучения 100 или 500 мВт, достигая энергетической плотности дозы световой энергии равной и превышающей 46,9 Дж/см². Получаемые инактивационные эффекты дозозависимы и характеризуются полным прекращением роста колоний микобактерий туберкулеза вследствие индуцированных фототоксических механизмов повреждения клеточных структур.

Способ реализуется следующим образом.

Для фотодинамической инактивации избираются лабораторный и клинические штаммы возбудителя туберкулеза с лекарственной чувствительностью и лекарственной устойчивостью.

В качестве лабораторного штамма Mycobacterium tuberculosis используется музейный штамм H₃₇RV. Данный изолят, полученный от пациента E.R. Baldwin's в 1905 году, имеет номер регистрации по каталогу АТСС® 27294™ (https://www.lgcstandarts-atcc.org/Products/AU/27294.aspx).

Клинические штаммы получены при посевах мокроты больных туберкулезом легких, находившихся на лечениии в ФГБУ «Новосибирский научно-исследовательский институт туберкулеза» Минздрава России. Штаммы выращивали на плотной яичной среде Левенштейна-Иенсена. Кислотоустойчивые свойства возбудителей подтверждены микроскопией культур с окраской по Ziehl-Neelsen. Иммунохромотомографические тесты (МРТ64) положительны. Тесты лекарственной чувствительности методами микропропорций (Sensititre MYCOTB) и пропорций в жидкой среде Bactec MGIT показали, что клинический изолят Mycobacterium tuberculosis №1043 является чувствительным к противотуберкулезным препаратам, а клинический изолят Mycobacterium tuberculosis №727 устойчивым к изониазиду, рифампицину и стрептомицмну. Кроме того, устойчивость к рифампицину клинического изолята М. tuberculosis №727 подтверждена молекулярно-генетическим исследованием по методике GeneXpert МТВ RIF, по результатам которой выявлена мутация в гене гроВ.

Из лабораторного и клинических штаммов изготавливали суспензии М. tuberculosis с бактериальным числом 3×10⁷ микробных тел/мл с помощью стандартного метода нефелометрии (Sensititre Nephelometer «TREK Diagnostic Systems», Великобритания). Из приготовленных суспензий отбирали контрольные образцы объемом по 0,2 мл для оценки интенсивности спонтанного роста колоний без фотосенсибилизации. Затем суспензии Mycobacterium tuberculosis подвергаются фотосенсибилизации препаратом «Фотосенс» путем 20-минутной инкубации при комнатной температуре таким образом, чтобы конечная концентрация фотосенсибилизатора в суспензии М. tuberculosis составляла 5 мкг/мл.

Далее суспензии М. tuberculosis разделялись на образцы объемом по 0,2 мл. По одному триплету из каждой суспензии использовали для оценки влияния фотосенсибилизации на рост М. tuberculosis, остальные триплеты подвергались фотодинамической инактивации с помощью непрерывного дистантного монопозиционного лазерного освечивания длиной волны 662 нм в четырех режимах дозирования световой энергии: 1) 0,1 Вт, t=5 мин (46,9 Дж/см²); 2) 0,1 Вт, t=15 мин (140,6 Дж/см²); 3) 0,5 Вт, t=5 мин (234,5 Дж/см²); 4) 0,5 Вт, t=15 мин (703,5 Дж/см²). В качестве источника света использован лазерный полупроводниковый генератор Лахта Милон.

Для данного способа является обязательной инокуляция всех образцов суспензий на плотные питательные среды Левенштейна-Йенсена, которые инкубировали вне доступа света при температуре 37°С в течение 90 дней, на протяжении которых осуществлялся регулярный визуальный контроль бактериального роста.

Таблица 1.

Влияние световой энергией лазерного излучения λ=662 нм и ФДИ фотосенсом на интенсивность роста различных штаммов М. tuberculosis.

Из данных таблицы 1 следует, что рост микобактерий туберкулеза, фотосенсибилизированных препаратом «Фотосенс» без лазерного облучения не отличается от результатов роста колоний в спонтанных условиях. Следовательно, фотосенсибилизатор в отсутствии света не влияет на рост МБТ.

Лазерное световое воздействие с длиной волны 662 нм подавляет рост нефотосенсибилизированных М. tuberculosis H₃₇Rv. Эффект подавления роста усиливается по мере увеличения плотности дозы световой энергии от 46,9 до 703,5 Дж/см² и достигает предельных значений при 140,6 Дж/см² и выше (табл. 1). Однако такое же воздействие на нефотосенсибилизированные М. tuberculosis №1043 и М. tuberculosis №727 никак не повлияло на интенсивность их роста (табл. 1)

Лазерное воздействие на предварительно фототсенсибилизированные суспензии М. tuberculosis оказало выраженное ингибирование роста колоний вплоть до 100%. Причем, для лабораторного штамма М. tuberculosis H₃₇Rv этот эффект был достигнут при дозах световой энергии, равных и превышающих 234,5 Дж/см², а для клинических штаммов с лекарственной чувствительностью и лекарственной устойчивостью подавление роста успешно состоялось при наименьшей плотности дозы световой энергии, равной 46,9 Дж/см².

Таким образом, применение в качестве фотосенсибилизатора для М. tuberculosis препарата Фотосенс из класса фталоцианинов в дозе 5 мкг/мл с последующим освещением энергией лазера с длиной волны 662 нм оказывает выраженный фотодинамический эффект подавления роста в эксперименте in vitro вне зависимости от лекарственной чувствительности и лекарственной устойчивости исследуемых штаммов.

Обнаруженная зависимость эффективной фотодинамической инактивации Mycobacterium tuberculosis лекарственным препаратом Фотосенс от активирующей его дозы световой энергии позволит в перспективе применять этот препарат в исследованиях на экспериментальных животных для разработки вариантов клинического применения в качестве локальной противотуберкулезной фотодинамической терапии, обеспечивающей торможение и полное необратимое прекращение роста колоний микобактерий туберкулеза вследствие индуцированных фототоксических механизмов повреждения их клеточных структур. Способ недорог, прост, надежен и эффективен.