Результат интеллектуальной деятельности: Набор олигонуклеотидных праймеров и зонда для выявления вируса герпеса крупного рогатого скота 4-го типа (BHV-4) в пробах биоматериала

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и может быть использовано в ветеринарной практике для выявления генетического материала (ДНК) вируса герпеса крупного рогатого скота 4-го типа в пробах биоматериала от крупного рогатого скота для диагностики заболевания, а также для решения научно-исследовательских задач по изучению свойств возбудителя, изучения его роли в этиологии респираторных и гинекологических патологий телят и коров, по оценке эффективности диагностических, профилактических или лечебных препаратов против данного вируса.

Использование специфичных праймеров и зонда позволяет выявлять генетический материал вируса BHV-4 в исследуемых образцах методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени.

Вирус герпеса крупного рогатого скота 4-го типа (Bovine herpesvirus 4 (BHV-4)) относится к семейству Herpesviridae и имеет выраженные отличия от других герпесвирусов крупного рогатого скота. BHV-4 был выделен при разных клинических состояниях, а также у здоровых животных в разных странах и в основном связан с инфекциями репродуктивного тракта крупного рогатого скота, особенно в послеродовой период. Помимо крупного рогатого скота вирус был выявлен у других видов домашних и диких жвачных животных.

Изначально вирус делился на две группы, в соответствии с штаммами, выделенными от телят с респираторными заболеваниями в Венгрии в 1963 году и в США в 1971 году. Позднее был выявлен широкий спектр штаммов, которые показали вариабельность этого вируса и, следовательно, его сложность, как биологическом, так и эпидемиологическом отношении.

Изоляция вируса в культуре клеток является стандартным методом при диагностике болезней, вызванных BHV-4. Недостатком этого метода является длительность диагностики, обусловленная низкой скоростью размножения вируса в культуре до появления цитопатогенного эффекта, которая может продолжаться до 11 дней в зависимости от штамма вируса, культуры клеток и количества пассажей (Egyed L., A., Bartha A., S. Studies of in vivo distribution of bovine herpesvirus type 4 in the natural host. // J. Clin. Microbiol. - 1996. - 34. -P. 1091-1095.)

Как альтернатива изоляции вируса в культуре клеток, в последнее десятилетие для выявления вируса BHV-4, применяется метод, основанный на полимеразной цепной реакции (ПЦР). Этот метод обладает рядом преимуществ, так как повышает точность выявления, сокращает сроки выявления, дает возможность обнаруживать и типировать возбудителя в исследуемом материале без выделения в культуре клеток. Кроме того, разные модификации ПЦР дают возможность проводить анализ в мультиплексном формате для определения всех групп вируса.

Известными аналогами являются ПЦР-тест-системы для детекции вируса: Boerner, В., Weigelt, W., Buhk, H-J., Castrucci, G., Ludwig, H.A sensitive and specific PCR/Southern blot assay for detection of bovine herpesvirus 4 in calves infected experimentally // J. Virol. Meth. - 1999 - 83, 169-180; Wellemberg G., Verstraten E., S., Verschuren S., Rijsewijk F., Peshev R., van Oirschot J. Detection of bovine herpesvirus 4 glycoprotein В and thymidine kinase DNA by PCR assays in bovine milk // J. Virol. Meth. - 2001. - 97. p. 101-112.; Herlekar D.A., Shashikant C.S., Gurjar A.A., Jayarao B.M. Presence of viral and bacterial organisms in milk and their association with somatic cell counts // J Dairy Sci. - 2013. - 96(10). - 6336-6346; Campos F.S., Franco A.C., Oliveira M.T., Firpo R., Strelczuk G., Fontoura F.E., Kulmann M.I., Maidana S., Romera S.A., Spilki F.R., Silva A.D., S.O., Roehe P.M. Detection of bovine herpesvirus 2 and bovine herpesvirus 4 DNA in trigeminal ganglia of naturally infected cattle by polymerase chain reaction. // Vet. Microbiol. - 2014. - 171(1-2). - p. 182-188. Однако они имеют электрофоретический режим регистрации результата.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является ПЦР-тест-система для выявления вируса BHV-4 по гену гликопротеина L в молоке (Herlekar D.A., Shashikant C.S., Gurjar А.А., Jayarao B.M. Presence of viral and bacterial organisms in milk and their association with somatic cell counts // J Dairy Sci. - 2013. - 96(10). - 6336-6346).

Однако вышеприведенные тест-системы (аналоги и прототип) имеют электрофоретический режим регистрации результата, что значительно увеличивает время проведения анализа, т.к. требуются дополнительные манипуляции, связанные с раститровкой ДНК исследуемой пробы или полученных в ходе ПЦР ампликонов, которые усложняют постановку анализа и могут приводить к появлению ложноположительных результатов. Стадия электрофореза ведет к резкому увеличению вероятности контаминации исследуемых проб продуктами амплификации.

Технической задачей изобретения являлась разработка набора специфичных олигонуклеотидных праймеров и зонда для идентификации генетического материала BHV-4 пробах биоматериала, сперме, молоке методом ПЦР с использованием гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени.

Поставленная задача решалась путем конструирования диагностических праймеров и флуоресцентно-меченого зонда на консервативном участке гена гликопротеина L (gL) генома вируса и оптимизации концентраций компонентов реакционной смеси и условий проведения ПЦР. Были рассчитаны пара праймеров и зонд для выявления генетического материала вируса. Для контроля амплификации были получены рекомбинантные плазмиды, несущие специфические участки ДНК-матрицы.

На начальном этапе был проведен анализ нуклеотидных последовательностей гликопротеина L разных штаммов вируса из базы данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) и определены наиболее консервативные участки.

Анализ свойств олигонуклеотидных праймеров и зондов проводился с использованием программы Vector NTI 9.0.0 (InforMax).

Для идентификации генетического материала вируса BHV-4 методом ПЦР в реальном времени были подобраны праймеры и зонд, представленные в таблице 1.

Пример 1. Проверка аналитической чувствительности набора праймеров и зонда.

Методом молекулярной трансформации компетентных бактериальных клеток Escherichia coli плазмидами pCR2.1, содержащими специфические ДНК вставки вируса BHV-4 для контроля амплификации были получены положительные контрольные образцы (ПКО).

Для проведения ПЦР в режиме реального времени в качестве анализируемых образцов использовали рекомбинантную плазмидную ДНК, включающую вставку ДНК, соответствующую детектируемому участку гена gL вируса BHV-4.

Для подтверждения специфичности полученного фрагмената ДНК определяли его нуклеотидную последовательность, для чего использовали набор реагентов BigDye^® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kits (Applied Biosystems, США). Продукты секвенирующей реакции анализировали методом капиллярного электрофореза в автоматическом секвенаторе ABI PRISM^® 3130×1 (Applied Biosystems/Hitachi, Япония). Полученную нуклеотидную последовательность сравнивали с последовательностями базы данных NCBI BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Данный фрагмент ДНК, использованный для получения ПКО, являлся целевым и соответствовал участку гена gL вируса BHV-4.

Условия проведения амплификации оптимизировались по следующим параметрам: концентрация ионов магния в реакционной смеси; концентрация праймеров и зондов в реакционной смеси; температура отжига праймеров.

Оптимизированный состав реакционной смеси включал следующие компоненты: 10×Taq буфер без Mg²⁺ (ООО «Лаборатория Медиген», Россия) - конечная концентрация 1×; 100 mM раствор MgCl2 - конечная концентрация 3,3 mM; 5 mM раствор dNTP - конечная концентрация каждого 0,2 mM; смесь праймеров - конечная концентрация каждого 0,15 μМ; зонд - конечная концентрация 0,2 μМ; SmartTaq ДНК-полимераза - конечная концентрация 1,5 е.а; вода для ПЦР. Общий объем реакционной смеси составлял 30 мкл.

Аналитическую чувствительность метода определяли постановкой ПЦР «в реальном времени», где в качестве исследуемых образцов использовались 10-кратные разведения положительного контрольного образца с концентрацией 2,4 мкг/мл, что соответствует 5,3×10¹¹ копий ДНК на 1 мл.

Результаты определения аналитической чувствительности приведены на рисунке 1.

За аналитическую чувствительность принимали последнее разведение ПКО, с которым результат ПЦР-анализа интерпретировался как положительный. Положительными считались образцы со значением Ct не превышающим 40.

По результатам исследований аналитическая чувствительность реакции составила 5,3×10 геномных эквивалентов на реакцию.

Пример 2. Определение специфичности ПЦР по заявленному способу.

Процедуру выделения ДНК из исследуемого материала проводили с использованием набора реагентов «Комплект для выделения ДНК/РНК из сыворотки или плазмы крови» (ООО «НПФ Литех», Россия) в соответствии с инструкцией по применению.

ПЦР в режиме реального времени проводили в реакционной смеси следующего состава (на 1 исследование):

ПЦР в режиме реального времени проводили в приборе Rotor Gene 6000 (Corbett Research, Австралия) по следующей программе (таблица 2).

Измерение флуоресценции осуществляли при температуре 57°С.

Результаты опытов по определению специфичности реакции по заявленному способу представлены в таблице 3.

Таким образом заявленный способ обладает высокой специфичностью при выявлении ДНК вируса BHV-4.

Пример 3. Выявление ДНК вируса герпеса КРС 4-го типа в пробах биологического материала, полученного от больных и инфицированных животных.

Исследованию на вирус BHV-4 подвергают пробы лимфатических узлов, легких, трахеи от КРС с респираторными болезнями, внутренние органы аборт-плодов, амниотическую жидкость, плаценту, выделения из матки и влагалища при гинекологических болезнях, сперму быков-производителей и пробы молока при маститах.

Из органов и тканей вырезают кусочки размером 1×1×1 см, пробы молока, спермы и выделений берут в объеме не менее 1 мл.

Образцы молока, истечений, спермы используют для выделения ДНК без предварительной подготовки. Пробы органов и тканей перед исследованием растирают в отдельных фарфоровых ступках со стерильным песком пестиком, добавляют 5-10 мл стерильногофизиологического раствора и тщательно перемешивают. Смесь переносят в пластиковые пробирки емкостью 1,5 мл, центрифугируют при 10×10³ об/мин в течение 5 минут. Для выделения ДНК используют 100 мкл осветленной надосадочной жидкости.

Дальнейшая процедура согласно примеру 2.

Всего предлагаемым способом было исследовано 18 образцов спермы быков-производителей, 46 проб молока, 112 проб внутренних органов КРС, 26 проб внутренних органов аборт-плодов и плаценты, 25 истечений из матки от абортировавших коров.

Результаты опытов по определению эффективности реакции при исследовании проб биоматериала от крупного рогатого скота по заявленному способу представлены в таблице 4.

По заявленному способу количество положительных проб составило 45,8%.

Для подтверждения специфичности полученных фрагментов ДНК определяли их нуклеотидную последовательность как описано в примере 1. Результаты секвенирования показали, что все полученые ампликоны соответствуют исследованному участку гена гликопротеина L вируса BHV4.

Таким образом, предлагаемый способ обладает высокой чувствительностью (7,2×10 геномных эквивалентов на реакцию), специфичностью и эффективностью при выявлении ДНК вируса герпеса КРС 4-го типа атипичного в образцах биологического материала от крупного рогатого скота.