Результат интеллектуальной деятельности: ИМПЛАНТАТ, СОДЕРЖАЩИЙ FGF-18

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области фармацевтических композиций. Более конкретно, оно направлено на систему доставки вещества (или имплантат), такую как каркасы и мембраны, включающие анаболическое лекарственное средство, такое как соединение фактор роста фибробластов 18 (FGF-18), на способы производства такой системы доставки, а также их применение. Имплантаты согласно изобретению предназначены для применения в лечении поражений хряща, таких как остеоартрит, повреждение хряща или костно-хрящевые дефекты.

Уровень техники

Фактор роста фибробластов 18 (FGF-18) является представителем семейства белков факторов роста фибробластов (FGF), близко родственным FGF-8 и FGF-17. Представители семейства FGF характеризуются гепаринсвязывающими доменами. Такой предполагаемый гепаринсвязывающий домен был идентифицирован для FGF-18. Предполагается, что опосредуемая рецептором передача сигналов инициируется при связывании FGF лиганда, образующего комплекс с поверхностными гепарин-сульфат протеогликанами клеток. Было показано, что FGF-18 вызывает пролиферацию хондроцитов и остеобластов (Ellsworth et al., 2002; Shimoaka et al., 2002). FGF-18 был предложен для лечения поражений хряща, таких как остеоартрит (ОА) и повреждение хряща (CI), отдельно (WO2008/023063) или в комбинации с гиалуроновой кислотой (WO2004/032849).

Фармацевтические композиции, включающие полипептид FGF, известны в уровне техники. В WO2012172072 описан лиофилизированный состав, содержащий FGF-18, где указанная композиция включает FGF-18, буфер, поверхностно-активное вещество полоксамер и сахар в качестве стабилизатора. Указанный лиофилизированный состав FGF18 демонстрирует многообещающие результаты при лечении ОА или CI. Существующая схема применения с использованием указанного лиофилизированного состава представляет собой курс лечения с одной инъекцией раз в неделю в течение 3 недель. Курс лечения может быть повторен.

Главный недостаток существующего состава FGF-18 состоит в том, что при введении внутрисуставно (в/с), присутствие FGF18 в синовиальной жидкости может вызвать нерегулируемый рост хряща также в здоровых областях. Это может вызывать, конечно, нежелательные явления, такие как уменьшение подвижности сустава. Доставка FGF18 селективно, на уровне целевого участка, может способствовать росту хряща только в поврежденной области. В частности, доставка FGF18 на уровне поврежденной области может быть крайне полезной для лечения ОА или CI, особенно в сочетании с микрофрактурированием. Микрофрактурирование является хирургической методикой восстановления суставного хряща, которая заключается в создании микропереломов в подлежащей кости. Это вызывает высвобождение плюрипотентных мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга (Ringe J. et al., 2012). Заполнение отверстия в хряще каркасом или мембраной, содержащей FGF18, будет направлять клетки в указанную матрицу, которая затем будет одновременно действовать как механическая подложка для роста клеток и депо лекарственного средства. Поэтому было бы предпочтительно, если бы FGF18 медленно высвобождался из каркаса/мембраны в окружающую ткань и/или оставался заключенным в каркасе/мембране.

Типичный подход в тканевой инженерии состоит во включении факторов роста в трехмерную матрицу, то есть в каркас или на мембране, которые могут быть имплантированы или введены, в зависимости от механических свойств, таким образом, чтобы они принимали форму акцепторного участка (Yun et al., 2010). Неотъемлемыми свойствами каркасов/мембран являются биосовместимость и резорбтивность. Кроме того, каркасы/мембраны должны быть способны обеспечивать клетки идеальной средой для роста, пролиферации и замещения поврежденной ткани. В идеальном варианте матрица должна обладать такими же механическими свойствами, что и исходная ткань, и должна иметь микропористость, способную вмещать клетки (сообщающиеся поры достаточного размера) (Tessmar and Göpferich, 2007).

Некоторые матрицы, пригодные для тканевой инженерии, уже выпускаются. Например, мембрана Chondro-Gide^TM (Geistlich Biomaterials) состоит из коллагена I и III типа, расположенных в бислойной структуре. Эта мембрана была одобрена в некоторых странах, например во Франции, в комбинации с имплантацией аутологичных хондроцитов (предпочтительно в комбинации с одобренным продуктом ChondroCelect^TM). Аналогичный продукт, Maci (Genzyme), был недавно одобрен на европейском рынке. Он состоит из аутогенных хондроцитов, размноженных ex vivo, экспрессирующих хондроцит-специфические маркерные гены, посеянных на мембране из коллагена I/III типа (Maix). Chondromimetic^TM (Orthomimetics Ltd) является каркасом, который состоит из бычьего коллагена I типа и гликозаминогликана хондроитин-6-сульфата (коллаген/GAG каркас). Это имплантат также был одобрен для европейского рынка.

Например, в WO2012113812 описан нановолокнистый каркас, функционализированный посредством покрытия полиэлектролитными мультислоями, то есть по меньшей мере одним слоем полианионов и одним слоем поликатионов. Терапевтические молекулы, такие как FGF18, могут быть включены в полиэлектролитные мультислои. В частности, терапевтическая молекула может формировать слой полианионов. Указанный каркас может необязательно также включать остеобласты в коллагеновом гидрогеле и хондроциты в альгинатном гидрогеле, причем каждый гидрогель депонирован на покрытом каркасе. Указанный каркас требуется имплантировать in situ с помощью хирургической операции.

При получении фармацевтической композиции, включающей биоактивный белок, указанная композиция должна быть изготовлена таким способом, чтобы активность белка сохранялась в течение требуемого периода времени. Потеря активности/стабильности белка может быть вызвана химической или физической неустойчивостью белка, в особенности вследствие денатурации, агрегации или окисления. Образующиеся в результате продукты могут быть, таким образом, фармацевтически неприемлемыми. Хотя использование вспомогательного вещества(в) и/или матрицы, как известно, увеличивает стабильность данного белка, стабилизирующие эффекты таких вспомогательных веществ сильно зависят от полимера в матрице, природы вспомогательных веществ, если таковые присутствуют, и от самого биоактивного белка непосредственно.

Хотя процедуры тканевой инженерии являются многообещающими, степень интеграции или качество полученного хряща необходимо повысить. Таким образом, существует потребность в улучшенной композиции, которая обеспечивает хорошую интеграцию и хорошее качество получаемого хряща (то есть главным образом гиалинового хряща); также существует потребность в альтернативной системе для обеспечения доставки терапевтического соединения на участок дефекта. Фактически образование указанного гиалинового хряща ценно как в терапевтических целях, так и в качестве компонента биологических матриц (Power et al., 2012). Указанные композиции могут применяться в рамках процедур тканевой инженерии для лечения у больного такого поражения хряща, как остеоартрит, повреждение хряща или костно-хрящевые дефекты.

Сущность изобретения

В настоящей заявке описана система доставки вещества, включающая по меньшей мере один полимерный материал, формирующий матрицу, и анаболическое лекарственное средство, где указанное анаболическое лекарственное средство включено по меньшей мере в один полимерный материал, формирующий матрицу. Указанная матрица предпочтительно является каркасом или мембраной. В конкретном варианте осуществления каркас является двухфазным каркасом, или мембрана является бислойной мембраной. Предпочтительно, по меньшей мере один полимерный материал является коллагеном. В альтернативе по меньшей мере один полимерный материал является комбинацией коллагена и гликозаминогликана (GAG). Анаболическое лекарственное средство, содержащееся в системе доставки, предпочтительно является соединением FGF-18. В конкретном варианте осуществления изобретения соединение FGF-18 выбрано из группы, состоящей из: a) полипептида, включающего или состоящего из зрелой формы человеческого FGF-18, включающей остатки 28-207 из SEQ ID NO:1, или b) полипептида, включающего или состоящего из SEQ ID NO:2.

Система доставки вещества согласно настоящему изобретению может дополнительно включать хондрогенные клетки, включающие мезенхимальные стволовые клетки. Предпочтительно такие хондрогенные клетки являются хондроцитами. В частности, хондрогенные клетки, такие как хондроциты или мезенхимальные стволовые клетки, собраны или выделены у пациента, нуждающегося в лечении, или у другого донора (предпочтительно относящегося к тому же виду).

В другом варианте осуществления изобретения предложен способ получения системы доставки вещества согласно настоящему изобретению, который включает следующие этапы: a) получение матрицы, включающей по меньшей мере один полимерный материал, и b) добавление анаболического лекарственного средства в матрицу, полученную в этапе a), где указанное анаболическое лекарственное средство включено по меньшей мере в один полимерный материал, формирующий матрицу. В альтернативе указанный способ дополнительно включает этап c) добавления хондрогенных клеток в матрицу, полученную в этапе a).

В другом варианте осуществления система доставки вещества, описанная в настоящей заявке, предназначена для применения в лечении поражения хряща. Поражение хряща предпочтительно выбрано из остеоартрита, повреждения хряща и костно-хрящевых дефектов.

Систему доставки вещества согласно изобретению предпочтительно вводят пациенту, нуждающемуся в указанном лечении, посредством процедуры трансплантации.

В другом варианте осуществления, в настоящей заявке описано изделие, включающее систему доставки вещества согласно изобретению. Предпочтительно компоненты указанного изделия объединяют непосредственно перед применением. В альтернативе компоненты указанного изделия объединяют до или после имплантации.

Определения

- Термин "анаболическое соединение" или "анаболическое лекарственное средство" следует понимать как соединение или лекарственное средство, которое оказывает анаболическое действие на хрящ, предпочтительно приводящее к репарации хряща. В рамках настоящего изобретения "анаболическое соединение" или "анаболическое лекарственное средство" предпочтительно является терапевтическим белком, обладающим анаболическим действием в отношении хряща. Из таких соединений или терапевтических белков предпочтительным соединением является соединение FGF-18 (как определено в настоящем описании).

- Термин "соединение FGF-18" или "FGF-18", при использовании в настоящем описании, относится к белку, сохраняющему по меньшей мере одну биологическую активность человеческого белка FGF-18. FGF-18 может быть нативным, находиться в своей зрелой форме, рекомбинантной форме или усеченной форме. Биологические активности человеческого белка FGF-18 включают, в частности, увеличение пролиферации хондроцитов или остеобластов (см. WO98/16644) или формирование хряща (см. WO2008/023063). Нативный, или дикого типа, человеческий FGF-18 представляет собой белок, экспрессируемый хондроцитами суставного хряща. Человеческий FGF-18 сначала был обозначен как zFGF-5 и полностью описан в WO98/16644. SEQ ID NO:1 соответствует аминокислотной последовательности нативного человеческого FGF-18 с сигнальным пептидом, который состоит из аминокислотных остатков 1 (Met) - 27 (Ala). Зрелая форма человеческого FGF-18 соответствует аминокислотной последовательности от остатка 28 (Glu) до остатка 207 (Ala) SEQ ID NO: 1 (180 аминокислот).

FGF-18, в настоящем изобретении, может быть получен рекомбинантным способом, таким как способ, описанный в заявке WO2006/063362. В зависимости от систем экспрессии и условий, FGF-18 в настоящем изобретении экспрессируется в рекомбинантной клетке-хозяине с первым остатком метионина (Met) или с сигнальной последовательностью для секреции. При экспрессии в прокариотическом хозяине, например в E. coli, FGF-18 содержит дополнительный остаток Met на N-конце своей последовательности. Например, аминокислотная последовательность человеческого FGF-18, при экспрессии в E.coli, начинается с остатка Met на N-конце (положение 1), после которого следуют остатки 28 (Glu) - 207 (Ala) в SEQ ID NO: 1.

- Термин "усеченная форма" FGF18, при использовании в настоящем описании, относится к белку, который включает или состоит из остатков 28 (Glu) - 196 (Lys) SEQ ID NO: 1. Предпочтительно, усеченная форма белка FGF-18 является полипептидом, обозначенным как "trFGF-18" (170 аминокислот; также известный как rhFGF18 или сприфермин), который начинается с остатка Met (на N-конце) после которого следуют аминокислотные остатки 28 (Glu)-196 (Lys) человеческого FGF-18 дикого типа. Аминокислотная последовательность trFGF-18 показана в SEQ ID NO:2 (аминокислотные остатки 2-170 в SEQ ID NO:2 соответствуют аминокислотным остаткам 28-196 в SEQ ID NO:1). trFGF-18 является рекомбинантной усеченной формой человеческого FGF-18, продуцированной в E.coli (см. WO2006/063362). Было показано, что trFGF-18 демонстрирует активности, аналогичные зрелому человеческому FGF-18, например, он повышает пролиферацию хондроцитов и отложение хряща, что приводит к восстановлению и реконструкции множества хрящевых тканей (см. WO2008/023063).

- Термин "гомогенный" означает, что различные компоненты состава смешаны, перемешаны или сплавлены друг с другом, то есть они не образуют отдельные слои компонентов.

- Термин "поражение хряща" при использовании в настоящем описании охватывает нарушения, возникающие в результате повреждений, таких как травматическое повреждение, хондропатия или артрит. Примеры поражений хряща, которые можно лечить путем применения соединения FGF-18, описанного в настоящей заявке, включают, без ограничения, артрит, такой как остеоартрит, повреждение хряща и костно-хрящевые дефекты. Дегенеративные заболевания/поражения хряща или сустава, такие как хондрокальциноз, полихондрит, рецидивирующий полихондрит, анкилозирующий спондилит или реберный хондрит также охвачены данным выражением. Международное общество по восстановлению хрящевой ткани (International Cartilage Repair Society) предложило артроскопическую шкалу для оценки тяжести дефекта хряща: оценка 0: (нормальный) здоровый хрящ, оценка 1: в хряще присутствует участок размягчения или пузыри, оценка 2: в хряще видны незначительные разрывы, оценка 3: поражения имеют глубокие трещины (затрагивают более 50% толщины слоя хряща) и оценка 4: разрыв хряща обнажает основную (субхондральную) кость (см. публикацию из ICRS: http://www.cartilage.org/_files/contentmanagement/ICRS_evaluation.pdf, страница 13).

- Термин "артрит", при использовании в настоящем описании, охватывает такие нарушения как остеоартрит, ревматоидный артрит, ювенильный ревматоидный артрит, инфекционный артрит, псориатический артрит, болезнь Стилла (начало ювенильного ревматоидного артрита) или рассекающий остеохондрит. Это предпочтительно включает заболевания или нарушения, при которых хрящ поврежден.

- Термин "остеоартрит" используется для определения наиболее распространенной формы артрита. Термин "остеоартрит" рассматривают как поражение хряща, которое охватывает первичный остеоартрит и вторичный остеоартрит (см., например, The Merck Manual, 17th edition, page 449). Остеоартрит может быть вызван разрушением хряща. Фрагменты хряща могут отрываться или продукты разложения компонентов хряща (таких как коллаген II типа, аггрекан) могут выходить из сустава и вызывать боль и опухание в суставе между костями в сочленении. С течением времени хрящ может полностью изнашиваться, и кости будут тереться друг о друга. Остеоартрит может поражать любой сустав, но обычно затрагивает руки и опорные суставы, такие как бедра, колени, ступни и позвоночник. В предпочтительном примере остеоартрит может быть остеоартритом коленного сустава или остеоартритом тазобедренного сустава. Данная формулировка охватывает, в частности, формы остеоартрита, которые классифицируют по тяжести от стадии 1 до стадии 4 или от степени 1 до степени 6 согласно системе классификации OARSI. Специалист имеет полное представление о классификациях остеоартрита, которые используются в уровне техники, в особенности указанная система исследования OARSI (также называемая OOCHAS; см. например Custers et al., 2007). Остеоартрит является одним из предпочтительных поражений хряща, которые можно лечить путем применения FGF-18 согласно настоящему изобретению.

- Термин "повреждение хряща" при использовании в настоящем описании является поражением хряща или повреждением хряща, которые вызваны, в частности, травмой. Повреждения хряща могут происходить, в частности, после травматического механического разрушения, особенно после несчастного случая или хирургического вмешательства (например, микрофрактурирования). Данный термин "повреждение хряща" также включает хрящевую или костно-хрящевую трещину и повреждение мениска. Также в пределах данного определения рассматривают связанное со спортом повреждение или связанное со спортом изнашивание тканей сустава. Термин также включает микроповреждение или тупую травму, хрящевую трещину, костно-хрящевую трещину или повреждение мениска.

- Термин "костно-хрящевые дефекты" (OCD) относится к поражению хряща, при котором дефекты хряща охватывают конец кости в суставе. Такие дефекты чаще всего вызваны травмой или повреждением, но могут быть также обусловлены патологией. OCD может приводить к ОА.

- Термин "матрица" относится к 3-мерной (трехмерной) структуре, такой как мембрана или каркас. Такая матрица может использоваться в качестве "имплантата" или в качестве "системы доставки вещества", или "системы доставки", если матрица или имплантат дополнительно включают анаболическое лекарственное средство (то есть терапевтический белок, обладающий анаболическим действием в отношении хряща, в который производят доставку). Термины "имплантат", "система доставки вещества" или "система доставки" являются в настоящем описании взаимозаменяемыми.

- Термины "имплантация" или "трансплантация" являются взаимозаменяемыми. Аналогичным образом, термины "имплантировать", "трансплантировать" или "устанавливать систему" являются взаимозаменяемыми.

- Термин "медленное высвобождение" согласно настоящему изобретению означает, что малые количества данного соединения, такого как соединение FGF-18, высвобождаются в течение по меньшей мере 4 недель и больше.

Подробное описание изобретения

Хотя процедуры восстановления хряща, в которых используют матрицы или имплантаты, являются многообещающими, качество получаемого хряща требуется повысить. Таким образом, существует потребность в улучшенной системе доставки, которая обеспечивает хорошую интеграцию и хорошее качество получаемого хряща (то есть главным образом гиалинового хряща). Было неожиданно обнаружено, что при использовании FGF-18 в матрице, такой как коллагеновая мембрана или коллагеновый/гликозаминогликановый каркас, это обеспечивает получение более совершенной восстановленной ткани, чем матрица в отдельности или матрица в комбинации с другим белком.

Главной целью настоящего изобретения, таким образом, является система доставки вещества, включающая по меньшей мере один полимерный материал, формирующий матрицу, и анаболическое лекарственное средство, где указанное анаболическое лекарственное средство включено по меньшей мере в один полимерный материал, формирующий матрицу. Указанная матрица является подходящей для введения на уровне хряща. Система доставки вещества согласно настоящему изобретению может дополнительно включать хондрогенные клетки. Система доставки вещества может также дополнительно включать другие вспомогательные вещества или другие компоненты. Преимуществом применения такой системы доставки является возможность вводить имплантат, который уже содержит анаболическое соединение, непосредственно в хрящ или костно-хрящевой дефект. В альтернативе анаболическое лекарственное средство и/или хондрогенные клетки, если таковые присутствуют, могут быть введены в имплантат после его имплантации в дефект.

В другом варианте осуществления изобретения предложен способ получения системы доставки вещества или имплантата согласно настоящему изобретению, включающий следующие этапы: a) получение матрицы, включающей по меньшей мере один полимерный материал, и b) добавление анаболического лекарственного средства в матрицу, полученную в этапе a), где указанное анаболическое лекарственное средство включено по меньшей мере в один полимерный материал, формирующий матрицу. В альтернативе указанный способ дополнительно включает этап c) добавления хондрогенных клеток в матрицу, полученную в этапе a). Любой из этапов b) и c) может быть выполнен до имплантации или после имплантации (то есть in situ) в дефект.

В другом варианте осуществления, в настоящей заявке описано изделие, включающее систему доставки вещества согласно изобретению. Предпочтительно компоненты указанного изделия объединяют непосредственно перед применением. В альтернативе компоненты указанного изделия объединяют до или после имплантации. Также описан упаковочный материал, содержащий инструкции по формированию системы доставки согласно настоящему изобретению.

В рамках настоящего изобретения в целом, матрица (или имплантат) предпочтительно является каркасом или мембраной. В конкретном варианте осуществления каркас является двухфазным каркасом, или мембрана является бислойной мембраной. Предпочтительно по меньшей мере один полимерный материал является коллагеном. В альтернативе по меньшей мере один полимерный материал является комбинацией коллагена и гликозаминогликана (GAG). Матрица может быть матрицей, уже доступной на рынке, такой как мембрана Chondro-Gide^TM, каркас Chondromimetic^TM или любая другая коммерчески доступная матрица (одобренная или еще не одобренная контролирующими органами). В альтернативе матрица может быть изготовлена для внутреннего пользования компанией-разработчиком.

Анаболическое лекарственное средство (то есть терапевтический белок, обладающий анаболическим действием в отношении хряща), содержащееся в системе доставки (то есть включенное по меньшей мере в один полимерный материал, формирующий матрицу), предпочтительно является соединением FGF-18. В конкретном варианте осуществления изобретения соединение FGF-18 выбрано из группы, состоящей из: a) полипептида, включающего или состоящего из зрелой формы человеческого FGF-18, включающей остатки 28-207 из SEQ ID NO:1, или b) полипептида, включающего или состоящего из SEQ ID NO:2. В частности, это соединение выбрано из человеческого зрелого FGF-18 дикого типа или trFGF-18. Более предпочтительно соединение FGF-18 является сприфермином.

В рамках настоящего изобретения анаболическое лекарственное средство, такое как соединение FGF-18, добавлено в систему доставки в дозе, равной или приблизительно равной 0,05-200 мкг/система, предпочтительно равной или приблизительно равной 0,5-100 мкг/система, более предпочтительно равной или приблизительно равной 1, 5, 6, 10, 15, 20, 25, 30, 32, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 150 или 200 мкг/система, еще более предпочтительно равной или приблизительно равной 5, 6, 10, 20, 30, 32, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 мкг/система.

В случае, когда хондрогенные клетки добавляют в систему доставки, такие хондрогенные клетки предпочтительно являются хондроцитами. В частности, хондрогенные клетки, такие как хондроциты, собирают или выделяют у млекопитающего и размножают в среде культивирования перед имплантацией вместе с матрицей (добавление клеток до или после имплантации). В конкретном варианте осуществления среда культивирования, в которой размножают клетки, может включать анаболическое соединение, такое как соединение FGF-18. В таком случае анаболическое соединение предпочтительно периодически добавляют в среду культивирования или среду для хранения в течение приблизительно одного дня в неделю, при этом указанное однодневное добавление повторяют каждую неделю в течение по меньшей мере 2 недель культивирования, по меньшей мере 3 недель культивирования или по меньшей мере 4 недель культивирования. Предпочтительно указанное анаболическое соединение периодически добавляют в среду культивирования или среду для хранения в течение одного дня в неделю, при этом указанное однодневное добавление повторяют каждую неделю в течение 2 недель культивирования, 3 недель культивирования или 4 недель культивирования. В альтернативе анаболическое лекарственное средство могут периодически добавлять в среду культивирования или среду для хранения в течение приблизительно одного дня в месяц, при этом указанное однодневное добавление повторяют каждый месяц в течение по меньшей мере 2 месяцев культивирования, по меньшей мере 3 месяцев культивирования или по меньшей мере 4 месяцев культивирования. Предпочтительно анаболическое лекарственное средство периодически добавляют в среду культивирования или среду для хранения в течение одного дня в месяц, при этом указанное однодневное добавление повторяют каждый месяц в течение 2 месяцев культуры, 3 месяцев культивирования или 4 месяцев культивирования.

Млекопитающее предпочтительно является пациентом, нуждающимся в лечении, или другим донором (предпочтительно относящимся к тому же виду). Указанным млекопитающим более конкретно является человек. Однако это может быть также такое млекопитающее, как, и без какого-либо ограничения, лошадь, овца, собака, кошка, кролик, крыса или мышь.

Система доставки вещества, описанная в настоящей заявке, предпочтительно предназначена для применения в лечении поражения хряща. В альтернативе в настоящей заявке раскрыт способ лечения поражения хряща, который включает этап введения системы доставки вещества согласно настоящему изобретению. В альтернативе также охвачен способ лечения поражения хряща, который включает этап введения имплантата согласно настоящему изобретению, где анаболическое лекарственное средство, такое как соединение FGF-18, и/или хондрогенные клетки добавляют в указанный имплантат до или после имплантации. Поражение хряща предпочтительно выбрано из остеоартрита, повреждения хряща и костно-хрящевых дефектов.

Систему доставки вещества согласно изобретению предпочтительно вводят пациенту, нуждающемуся в указанном лечении, посредством имплантации или трансплантации, или иной установки системы в эффект или в участок, в котором необходимы восстановление, регенерация или рост суставного хряща.

Следующие примеры обеспечены для дополнительной иллюстрации изобретения. Объем изобретения не следует рассматривать как состоящий исключительно из следующих примеров.

Описание фигур:

Фигура 1a. Процент весовой нагрузки овец в контрольной группе.

Фигура 1b. Процент весовой нагрузки в группе, получавшей FGF-18 внутрисуставно.

Фигура 1c. Процент весовой нагрузки в группе, получавшей 32 мкг rhFGF-18, нанесенного на мембрану Chondri-Gide на участке операции

Фигура 1d. Процент весовой нагрузки группы, получавшей 6,4 мкг rhFGF-18, нанесенного на мембрану Chondri-Gide на участке операции

Фигура 2. Влияние rhFGF18 на общий балл ICRS

Фигура 3. Влияние rhFGF18 на жесткость восстановленного хряща

Фигура 4. Влияние rhFGF-18 на оценку по модифицированной шкале O'Дрисколла

Фигура 5. Дегенеративное изменение в MFC и LTS (p=0?0381) при вскрытии

Фигура 6. Общая оценка восстановления MFC (p=0,0015) и LTS (p>0,05) Международного общества восстановления хрящевой ткани.

Фигура 7. Измерения жесткости дефектов в MFC (p>0,05) и LTS (p=0,0033), выраженные как процентные измерения контралатеральной конечности.

Фигура 8. Измерения жесткости дефектов в MFC (p>0,05) и LTS (p=0,0002), выраженные как процентные измерения хряща, расположенного вблизи пораженного участка.

Фигура 9. Оценка по модифицированной шкале O'Дрисколла для MFC (p=0,0390) и для LTS (p>0,05), демонстрирующая сравнение между группами.

Описание последовательностей:

SEQ ID NO.1: Аминокислотная последовательность нативного человеческого FGF-18.

SEQ ID NO.2: Аминокислотная последовательность рекомбинантного усеченного FGF-18 (сприфермина).

SEQ ID NO.3: Аминокислотная последовательность рекомбинантного BMP-7 (также известного как эптотермин альфа)

Примеры

Материал

Рекомбинантный усеченный FGF-18 (rhFGF-18) в настоящих примерах был получен при экспрессии в E.coli согласно методике, описанной в заявке WO2006/063362. В следующих примерах rhFGF-18, FGF-18 или сприфермин используются попеременно.

Методы

Анализ походки : Стабилометрическую платформу (Accusway, AMTI, USA) использовали для количественного определения весовой нагрузки оперированной конечности. Весовую нагрузку измеряли при ходьбе до хирургии, через 2 недели, 4 недели, 2 месяца, 3 месяца, 4 месяца и 5 месяцев после операции. В каждой точке времени каждое животное проходило в общей сложности 10 регистраций показателей, полученных при ходьбе, для вычисления среднего значения весовой нагрузки. Каждое измерение преобразовывали в силу Н/кг и вычисляли как процент от весовой нагрузки, измеренной до операции у каждого животного. Данные весовой нагрузки группировали по группам лечения для окончательного анализа.

Общая морфология : Суставы открывали, фотографировали и оценивали поверхность участков костно-хрящевых дефектов вслепую при использовании шкалы Международного общества восстановления хрящевой ткани (ICRS) (Таблица 3).

Механическое испытание : После выполнения общих морфологических наблюдений, каждый участок имплантата подвергали неразрушающему механическому испытанию с целью определения изменений поверхности хряща, окружающего имплантат или пустой дефект. Измерения жесткости проводили в двух повторениях, от центра костно-хрящевого дефекта и с интервалом 1 мм от исходного края созданного костно-хрящевого дефекта в положениях 12, 3, 6 и 9 часов, и 1 мм от края хряща, окружающего пораженный участок, при использовании ручного цифрового дюрометра (Shore S1, шкала M, Instron Ltd, UK). Число между 0-100 может быть дано со встроенной калиброванной погрешностью +/-5. Эти измерения затем повторяли на контралатеральной конечности в тех же анатомических участках.

Гистология : После измерений жесткости образцы декальцинировали в муравьиной кислоте/цитрате натрия в течение двух недель. После выполнения декальцинирования образцы дегидратировали путем ряда замен раствора этанолом с повышением концентрации, а затем заливали в парафин. Срезы толщиной 10 мкм делали через центральную часть дефекта. Срезы окрашивали толуидиновым синим и сафранином O/зеленым прочным. Гистологические срезы вслепую оценивал один исследователь, используя модифицированную шкалу O'Дрисколла (Таблица 4). Затем идентифицировали животных, которые имели наилучшие оценки и срединные общие оценки по модифицированной шкале O'Дрисколла в своей экспериментальной группе, и проводили иммуногистохимический анализ этих срезов. В дополнение к общей оценке по модифицированной шкале O'Дрисколла отдельно анализировали индивидуальные компоненты системы оценки.

Иммуногистохимия : В этом исследовании использовали следующие первичные антитела: моноклональное мышиное антитело против человеческого коллагена I типа (MP Biomedicals, US), моноклональное мышиное антитело против человеческого коллагена II типа (MP Biomedicals, US) и моноклональное мышиное антитело против кроличьего коллагена VI типа (Abcam, UK). В соответствующих случаях использовали конъюгированные с пероксидазой хрена вторичные иммуноглобулины против антител кролика и мыши, и цветную реакцию проявляли 0,1% тетрахлоридом 3′,3-диаминобензидина (DAB)/0,01% перекисью водорода. Нормальную видоспецифическую сыворотку использовали в качестве контроля во всех экспериментах.

Статистический анализ : Для анализа данных использовали пакет статистических программ GraphPad Prism 5 (Graphpad Software Inc, La Jolla, CA). Статистическую значимость между группами и в группах для каждого конечного показателя определяли в основном при использовании непараметрического критерия Краскела-Уоллиса, с апостериорным критерием множественного сравнения Данна. В одном случае использовали однофакторный дисперсионный анализ с апостериорным критерием множественного сравнения Тьюки. Уровень p<0,05 был принят как значимый во всех анализах.

Пример 1: Коллагеновый каркас, содержащий rhFGF-18

Метод

В исследование включали тридцать пять достигших скелетной зрелости уэльсских горных овец возрастом от 3 до 5 лет. Животных распределяли в 7 групп лечения, две из которых выступали в качестве контрольных групп (Таблица 1). Перед операцией всем животным делали наркоз смесью изофлурана, закиси азота и кислорода. Животных помещали в лежачее положение на спину и, после подготовки к операции, левый коленный сустав открывали путем латерального парапателлярного доступа. После подвывиха надколенника, на полную толщину хряща формировали дефект диаметром 8 мм на опорной поверхности медиального мыщелка бедренной кости при использовании трубчатого ножа и кюретки. Уделяли внимание, чтобы обеспечить удаление кальцинированного хряща с субхондральной кости, и чтобы край дефекта был перпендикулярен субхондральной кости. После формирования дефекта в дефекте делали 6 отверстий микропереломов, используя микродолото. Эти отверстия микропереломов проходили через субхондральную костную пластину. После формирования микропереломов, в тех группах, которые получали лечение, мембрану Chondro-Gide^TM, содержащую требуемое количество rhFGF-18, приклеивали на хрящевой дефект при использовании фибринового клея Tisseal и зашивали сустав стандартным способом.

Животным, получавшим лечение в/с, 30 нг/мл rhFGF-18 вводили в медиальный бедренно-большеберцовый сустав один раз в неделю в течение 3 недель. Животным, которые получали один курс rhFGF-18, делали инъекции через 4, 5 и 6 недель после операции, животным, которые получали два курса rhFGF-18, делали инъекции через 4, 5 и 6 недель и 16, 17 и 18 недель после операции. Всех животных умерщвляли через 6 месяцев после операции.

Таблица 1-Экспериментальные группы

Результаты - Анализ походки

В контрольной группе (Фигура 1a) наблюдали заметное уменьшение весовой нагрузки после операции, а затем медленное увеличение весовой нагрузки на оперированную конечность с течением времени. Возврат весовой нагрузки на уровень до операции происходил за 2 месяца, то есть между значениями, зарегистрированными до операции и через 2, 3, 4 и 5 месяцев, статистическое различие отсутствует.

В группе B (Фигура 1b) наблюдали значимое увеличение весовой нагрузки после операции по сравнению с контролем (среднее значение в контрольной группе 46,3+/-23,63 по сравнению со средним значением в группе B 73,4+/-13,7) (t-критерий p<0,0001), и затем медленное увеличение весовой нагрузки на оперированную конечность с течением времени. Присутствовало статистически значимое (p<0,05) различие в весовой нагрузке после операции по сравнению с обнаруженным в 1 м. Какой-либо другой значимости обнаружено не было. Весовая нагрузка возвращалась обратно на уровень до операции за 2 месяца, то есть между значениями, зарегистрированными до операции и через 2, 3, 4 и 5 месяцев, статистическое различие отсутствует.

В отличие от контроля и групп с внутрисуставным введением rhFGF-18, в группе H значимые различия между весовой нагрузкой до операции и после операции (Фигура 1c) не были обнаружены, то есть было невозможно обнаружить, что животные перенесли какое-либо хирургическое вмешательство в течение данного периода времени. Это значимо отличалось от уменьшения весовой нагрузки, обнаруженной через 2н после операции во всех остальных группах, в которых проводили измерения.

В группе G весовая нагрузка после операции возвратилась на уровни, значимо не отличавшиеся от уровней до операции, через 2 месяца (Фигура 1d), хотя отмечали подобную тенденцию, наблюдаемую при более высокой дозе rhFGF-18/мембрана.

Результаты - Общая морфология

Влияние rhFGF18 на общую морфологию восстановленной ткани определяли количественно при использовании шкалы ICRS (Таблица 3). Не было никаких статистически значимых различий в общей гистологии поражений при измерении с помощью системы оценки общей морфологии ICRS. Индивидуальный анализ компонентов шкалы морфологии ICRS не позволил выявить компонент, который показал какие-либо статистически значимые результаты. Эти результаты указывают, что добавление 32 мкг rhFGF-18, наносимого на мембрану Chondri-Gide в участке операции, приводит к значительному уменьшению послеоперационной боли через 2 недели после операции, согласно оценке с использованием стабилометрической платформы. Никаких других значимых различий не обнаружили.

Результаты - Жесткость

Измерения жесткости проводили от хрящевого дефекта и соответствующего участка на другой, неоперированной конечности при использовании ручного цифрового дюрометра (Shore S1, шкала М, Instron Ltd, UK) (Фигура 3). Значимые различия между группами отсутствовали. (В этом эксперименте стремились к восстановлению механической жесткости эксплуатируемого хряща, чтобы она соответствовала жесткости контрольного хряща), поэтому отсутствие значимого различия между оперированной и неоперированной конечностью является требуемым результатом.

Результаты - гистология

Качество гистологической репарации в поражении и прилегающей ткани определяли количественно при использовании модифицированной шкалы O'Дрисколла (Фигура 4). Значимых различий при использовании критерия Краскела-Уоллиса не обнаружили. Для оценки данных другим способом однофакторный дисперсионный анализ выполняли с использованием апостериорного критерия Тьюки. Обе контрольные группы (Группы A и C) имели средние значения, которые не были статистически значимо различными, как можно было бы ожидать. Как было показано в предыдущих исследованиях, применение двух курсов в/с rhFGF-18 значительно улучшало оценку по модифицированной шкале O'Дрисколла. Кроме того, присутствовало статистически значимое повышение оценки по модифицированной шкале O'Дрисколла при нанесении 6,4 мкг и 32 мкг rhFGF-18 на мембрану Chondro-Gide^TM. Между внутрисуставным введением FGF-18 и 32 мкг rhFGF-18, нанесенного на мембрану в участке операции, различие отсутствовало.

Результаты - Субанализ по модифицированной шкале O'Дрисколла

Субанализ компонентов модифицированной шкалы O'Дрисколла проводили с целью конкретно установить, какие гистологические параметры были и не были затронуты при включении rhFGF-18. При включении всех данных статистически значимые различия не были обнаружены ни по одному из отдельных компонентов системы оценки.

Результаты - Иммуногистохимия (IHC)

Выполняли IHC на коллаген I, II и VI типа. Было продемонстрировано, что восстановленная ткань, полученная в контрольных образцах, преимущественно являлась смешанной гиалиновой/волокнистой хрящевой тканью (коллаген I и II типа IHC, с окрашиванием слабоорганизованного коллагена VI типа). Напротив, в присутствии rhFGF-18 восстановленная ткань была положительной на коллаген II типа, с чистым окрашиванием околоклеточного коллагена VI типа, что указывает на присутствие восстановленного зрелого гиалинового хряща. Эти результаты указывают, что добавление двух курсов rhFGF-18 внутрисуставно после операции или доставка 32 мкг rhFGF-18 на мембране Chondri-Gide^TM в участок операции приводит к значительному улучшению оценки по модифицированной шкале O'Дрисколла. Гистология демонстрирует, что восстановленная ткань, образовавшаяся в присутствии этих систем доставки rhFGF-18, является положительной на коллаген II и VI типа, то есть представляет собой гиалиновый хрящ, по сравнению со смешанной гиалиновой/волокнистой хрящевой тканью, полученной в контрольных группах и у животных, получавших более низкую дозу rhFGF-18, доставляемого на мембране в участок операции.

Выводы :

В этом исследовании продемонстрировали, что включение 32 мкг rhFGF-18, доставляемого на мембране Chondro-Gide^TM в участок операции, значительно уменьшало послеоперационную боль через 2 недели после операции (по сравнению с контрольными группами, более низкими дозами rhFGF-18, наносимого на мембрану, и rhFGF-18 внутрисуставно), и значительно повышало оценку по модифицированной шкале O'Дрисколла по сравнению с контрольными группами и более низкими дозами rhFGF-18, наносимого на мембрану, и обеспечивало эквивалентную оценку по модифицированной шкале O'Дрисколла по сравнению с внутрисуставным введением rhFGF-18. Эти результаты, хотя и полученные с небольшим количеством животных, указывают, что применение rhFGF-18 на мембране Chondro-Gide^TM является эффективным лечением хрящевых дефектов, которые лечат с помощью микрофрактурирования.

Пример 2: Коллагеновый/GAG каркас, включающий rhFGF-18

Метод :

Костно-хрящевые дефекты (5,8×6 мм) формировали в медиальном мыщелке бедренной кости (MFC) и латеральной трохлеарной борозде (LTS) правого коленного сустава у 24 достигших скелетной зрелости уэльских горных овец. Дефекты либо оставляли незаполненными (Контроль; группа А), либо заполняли коллагеновым/GAG каркасом 6×6 мм (каркас ChondroMimetic), отдельно (только каркас; контроль; группа В) или в комбинации с rhFGF-18 (30 мкг, группа С) или BMP-7 (100 мкг; группа D) (n=6 для каждой группы) (см. Таблицу 2). Через 6 месяцев овец гуманно усыпляли, при этом восстановленную ткань подвергали неразрушающему механическому испытанию, общей оценке по шкале восстановления ICRS, а также оценивали на наличие дегенеративного изменения. После этого проводили гистологический и иммуногистохимический анализ с исследованием хрящевых маркеров - протеогликана (сафранин O/зеленый прочный) и коллагенов I, II и VI типа. Срезы оценивали при использовании полуколичественной модифицированной шкалы O'Дрисколла. Статистический анализ включал однофакторный дисперсионный анализ и апостериорный критерий с поправкой Бонферрони при значении p<0,05, установленном в качестве уровня значимости.

ChondroMimetic (Orthomimetics Ltd) представляет собой каркас, состоящий из бычьего коллагена I типа и гликозаминогликана хондроитин-6-сульфата (коллагеновый/GAG каркас).

Таблица 2-Экспериментальные группы

Результаты - Общая морфология :

Ни одно из животных не показало симптомов инфекции после операции. Дегенеративное изменение отмечали у многих животных в LTS, особенно в контрольных группах (Фигура 5). Это могло быть вызвано латеральным парапателлярным доступом с возникшим в результате изменением пателлофеморальной биомеханики. Непараметрический анализ показал статистически значимое различие между дегенерацией в группе BMP-7 по сравнению с одним каркасом (p=0,0381).

Результаты - Оценка восстановления хряща :

Всех животных оценивал один наблюдатель, заслепленный по группе лечения. На Фигуре 6 показано распределение баллов между группами. FGF-18 и BMP-7 значительно повышали оценки восстановления по шкале ICRS в MFC по сравнению с незаполненными дефектами (p<0,05). Тенденцию к улучшению восстановления наблюдали с обоими факторами роста по сравнению с каркасом в отдельности, однако между группами не было статистически значимого различия (p>0,05). Между контрольными группами в MFC отмечали намного более высокую изменчивость, чем с факторами роста; однако в LTS имело место обратное.

Результаты - Механическое испытание :

Повторные измерения проводил один наблюдатель с использованием цифрового дюрометра Shore S1 (Instron). В MFC (Фигура 78) между группами лечения отсутствовало различие в средней процентной жесткости как в контралатеральной конечности (p=0,31), так и в хряще, окружающем участок поражения (p=0,573). В LTS (Фигура 8) BMP-7 обеспечивал значительно более низкую жесткость, чем rhFGF-18, и чем незаполненный дефект при сравнении с хрящом в контралатеральной конечности (p=0,0033), и меньшую жесткость, чем один каркас и rhFGF-18 при сравнении с его хрящом, расположенным вокруг участка поражения (p=0,0002) (p<0,05 для всех апостериорных анализов).

Результаты - Гистология и иммуногистохимия :

Контрольная группа A=Незаполненные дефекты (изображения не показаны): Хорошую ткань, заполняющую пустые дефекты, обычно наблюдали у всех животных. В большинстве дефектов наблюдали продвижение отметки уровня с тонким слоем хряща. Положительное окрашивание сафранином O наблюдали во всех дефектах MFC с относительно слабым окрашиванием в LTS. Все дефекты показали положительное окрашивание на коллаген I типа, с наличием некоторого положительного окрашивания на коллаген II типа. Отсутствовали дефекты, положительно окрашенные на околоклеточный коллаген VI типа. Эти наблюдения указывают, что в дефекте присутствовало замещение волокнистохрящевой тканью, причем во многих случаях наблюдалось замещение волокнистой тканью.

Контрольная группа B=Только каркас (изображения не показаны): Хорошую латеральную интеграцию отмечали во всех дефектах. Попытки регенерации суставного хряща были особенно заметны в MFC, при этом хондроциты в лакунах были расположены в колоннах в глубокой зоне, с более уплощенными хондроцитами в поверхностной зоне. Это наблюдали главным образом на боковых краях, при этом неорганизованная ткань часто располагалась в центре. Повторялась тенденция с присутствием углубления или трещины, расположенной центрально в хрящевом слое в четырех из шести дефектов MFC, и остаточного каркаса в глубокой части всех дефектов. Однако этот остаточный каркас действительно показал новую соединительную ткань внутри пористой структуры, при этом новый материал был сформирован на элементах каркаса. Срезы показали умеренное окрашивание сафранином O со смешанной картиной окрашивания коллагена I и II типа. Наблюдали некоторую степень околоклеточного окрашивания VI типа, опять же на боковых краях, в основном с окрашиванием межклеточного матрикса по центру. Эти результаты дают основание предположить замещение волокнистым хрящом с наличием некоторых областей со свойствами, подобными гиалиновому хрящу, особенно по боковым краям.

Получавшая FGF-18 группа C (изображения не показаны): Все дефекты показали хорошую регенерацию субхондральной кости, причем во многих случаях наблюдали оставшийся каркас in situ. Ни в одном дефекте не присутствовали кистозные образования. Обычно в центре дефекта наблюдали углубление, уходящее вниз к середине дефекта, часто сообщающееся с каркасом. Толщина слоя хряща была восстановлена в пяти из шести дефектов MFC и в двух из шести дефектов LTS, особенно латерально, где присутствовала превосходная интеграция с хрящом реципиента, при этом ткань главным образом напоминала архитектуру гиалинового хряща. Репарацию с преобладанием фиброзно-хрящевой ткани часто наблюдали в центральной области. В целом превосходное окрашивание сафранином O присутствовало во всех дефектах, что указывает на хорошую продукцию протеогликанов. В лучших случаях наблюдали отрицательное окрашивание на коллаген I типа с положительным окрашиванием на II тип и околоклеточный коллаген VI типа, что указывает на то, что восстановленная ткань сильно напоминала гиалиновый хрящ. В большинстве случаев наблюдали восстановленную ткань с областями, сильно напоминающими гиалиновый хрящ, смешанный с волокнистым хрящом хорошего качества.

Получавшая BMP-7 группа D (изображения не показаны): Недостаточное заполнение дефектов наблюдали в четырех из шести дефектов LTS с очень слабым окрашиванием сафранином O в других двух дефектах. Латеральная интеграция была умеренной в лучшем случае, с недостаточной целостностью фибрознохрящевой ткани и в прилегающей нативной ткани. В MFC отложение протеогликана было улучшено, что наблюдали по увеличенному окрашиванию сафранином O; однако толщина слоя хряща в основном была уменьшена по сравнению с нативным хрящом. Два из шести дефектов MFC были связаны с крупными подхрящевыми кистами. Как было обнаружено, это были не имеющие стенок кисты, по-видимому, не соединяющиеся с поверхностью сустава, выстланные клетками хронического воспаления. Только небольшое количество каркаса было связано с кистами. В лучшем случае волокнистый хрящ наблюдали с положительным окрашиванием на коллагены как I, так и II типа. Ни один срез не показал нормального окрашивания околоклеточного коллагена VI типа. Остаточный каркас наблюдали в большинстве дефектов в MFC в отличие от LTS. В группе BMP-7 в MFC было обнаружено больше кист, чем в любой другой группе лечения, обе из которых были большими.

Результаты - Полуколичественный анализ гистологических срезов :

Все срезы, окрашенные сафранином O/зеленым прочным, оценивал с использованием модифицированной гистологической шкалы O'Дрисколла один заслепленный наблюдатель, который являлся экспертом в области анализа репарации суставного хряща. Значительное улучшение наблюдали в группе rhFGF-18 в MFC по сравнению с незаполненным дефектом (p=0,0390) (Фигура 9). Подобную тенденцию наблюдали в LTS, однако статистическая значимость не была достигнута. Примечательно, что группа BMP-7 показала худшие результаты во всех LTS с широкой изменчивостью.

Выводы :

На основании результатов данного исследования можно сделать вывод, что rhFGF18 в комбинации с каркасом Chondromimetic в модели костно-хрящевого дефекта на овцах обеспечивает образование превосходной восстановленной ткани, чем каркас в отдельности или BMP-7 в комбинации с каркасом Chondromimetic.

Изобретение охватывает следующее:

1) Система доставки вещества, включающая по меньшей мере один полимерный материал, формирующий матрицу, и анаболическое лекарственное средство.

2) Система доставки вещества согласно 1), где матрица является каркасом или мембраной.

3) Система доставки вещества согласно 2), где каркас является двухфазным каркасом, или где мембрана является бислойной мембраной.

4) Система доставки вещества согласно любому из 1) - 3), где по меньшей мере один полимерный материал является коллагеном.

5) Система доставки вещества согласно любому из 1) - 3), где по меньшей мере один полимерный материал является комбинацией коллагена и гликозаминогликана (GAG).

6) Система доставки вещества согласно любому из 1) - 5), которая дополнительно включает хондрогенные клетки.

7) Система доставки вещества согласно любому из 1) - 6), где анаболическое лекарственное средство является соединением FGF-18.

8) Система доставки вещества согласно 7), где соединение FGF-18 выбрано из группы, состоящей из: a) полипептида, включающего или состоящего из зрелой формы человеческого FGF-18, включающей остатки 28-207 из SEQ ID NO:1, или b) полипептида, включающего или состоящего из SEQ ID NO:2.

9) Способ получения системы доставки вещества согласно любому из 1) - 8), который включает следующие этапы: a) получение матрицы, включающей по меньшей мере один полимерный материал, и b) добавление анаболического лекарственного средства в матрицу, полученную в этапе a).

10) Способ согласно 9), который дополнительно включает этап c) добавления хондрогенных клеток в матрицу, полученную в этапе a).

11) Система доставки вещества согласно любому из 1) - 8) для применения в лечении поражения хряща.

12) Система доставки вещества для применения согласно 11), где поражение хряща выбрано из остеоартрита, повреждения хряща и костно-хрящевых дефектов.

13) Система доставки вещества для применения согласно 11) или 12), где систему доставки вещества вводят пациенту, нуждающемуся в указанном лечении, посредством процедуры трансплантации.

14) Изделие, включающее систему доставки вещества согласно любому из 1) - 8).

15) Изделие согласно 14), где каждый из компонентов объединяют до имплантации или после имплантации.

Таблицы

Таблица 3. Критерии оценки с использованием шкалы ICRS для оценки репарации хрящевого дефекта.

Таблица 4. Модифицированная шкала гистологии O'Дрисколла

Список использованных источников

1. Ellsworth et al., 2002, Osteoarthritis and Cartilage, 10: 308-320

2. Shimoaka et al., 2002, JBC 277(9):7493-7500

3. WO2008023063

4. WO2004032849

5. WO2012172072

6. Ringe J. Et al., 2012, Nature Reviews Rheumatology 8(8): 493-498

7. J.K. Tessmar, A.M. Göpferich, 2007, Adv. Drug Delivery Rev. 59:274-291

8. Power J. et al., 2014, Journal of Orthopaedic Research, epublication on January 16, 2014

9. Yun Y-R et al., 2010, J. Tissue Eng. 1:1-18

10. WO98/16644

11. WO2006/063362

12. Custers et al., 2007, Osteoarthritis and Cartilage, 15:1241-1248