Результат интеллектуальной деятельности: ГИДРОЛИЗАТ ПОЛИСАХАРИДНОГО КОМПЛЕКСА ЦВЕТКОВ ПИЖМЫ ОБЫКНОВЕННОЙ КАК ИНГИБИТОР БЕЛКА-ТРАНСПОРТЕРА ГЛИКОПРОТЕИНА-Р

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии и клинической фармакологии и предназначено для использования гидролизата полисахарида цветков пижмы обыкновенной в качестве ингибитора белка-транспортера гликопротеина-Р (Pgp), который может применяться для повышения эффективности фармакотерапии лекарственными веществами-субстратами Pgp, прогнозирования возможной принадлежности изучаемых лекарственных препаратов к субстратам данного транспортера и в качестве положительного контроля пониженной активности PGp при поиске веществ аналогичного действия.

Гликопротеин-Р (Pgp) - мембранный белок-транспортер, играющий ключевую роль во всасывании, распределении и выведении широкого спектра лекарственных веществ, являющихся его субстратами.

Известен ряд синтетических ингибиторов Pgp, таких как верапамил [Involvement of cytochrome Р450 3А4 and P-glycoprotein in first-pass intestinal extraction of omeprazole in rabbits / H.M. Fang [et al.] // Act. Pharmacologica Sinica. - 2009. - Vol. 30. - P. 1566-1572], тариквидар [Tariquidar-induced P-glycoprotein inhibition at the rat blood-brain barrier studied with (R)-11C-verapamil and PET / J.P. Bankstahl [et al.] // J. Nucl. Med. - 2008. - Vol. 49. - P. 1328-1335], циклоспорин [Cyclosporine Nephrotoxicity / By Emmanuel [et al.] // Bennett Seminars in Nephrology. - 2003. - Vol. 23, №5. - P. 465-476], кетоконазол [Inhibitory effect of ketoconazole on the pharmacokinetics of a multireceptor tyrosine kinase inhibitor BMS-690514 in healthy participants: assessing the mechanism of the interaction with physiologically-based pharmacokinetic simulations / Z. Yang [et al.] // J. Clin Pharmacol. - 2013. - Vol. 53, №2. -P. 217-227], линестренол [Патент РФ 2553362], афобазол [Патент РФ 2649134]. Однако синтетические средства, как правило, обладают системными побочными эффектами, а многие из них (например, тариквидар) являются весьма дорогостоящими.

В настоящее время актуальным направлением развития фармакологии является поиск и исследование новых лекарственных веществ растительного происхождения. Лекарственные растительные средства реже, чем синтетические вызывают побочные эффекты, в том числе и аллергические реакции, технологии их получения являются экономически выгодными.

Техническим результатом настоящего изобретения является получение безопасного и доступного ингибитора белка-транспортера PgP.

Осуществление изобретения

Для выделения полисахаридного комплекса цветков пижмы брали воздушно-сухое сырье цветков пижмы обыкновенной, продающееся в аптечной сети. 50 г лекарственного сырья помещали в колбу на 1 литр, добавляли 250 мл 40%-ного этанола и проводили предварительную тридцатиминутную экстракцию на водяной бане 3 раза для удаления из растительного сырья экстрактивных веществ (аминокислоты, моносахариды, органические кислоты, антоцианы, цианиды), после этого шрот высушивали и помещали в колбу на 1 литр, заливали 500 мл 1%-ного раствора оксалата аммония, экстракцию проводили на кипящей водяной бане в течение 1,5 часов. Проводили фильтрацию полученного экстракта через двойной слой марли, с проложенным между слоями слоем ваты. Экстракцию повторяли 3 раза, полученные экстракты объединяли, затем осаждали полисахарид трехкратным избытком 96%-ного этанола. Полученный осадок промывали последовательно этанолом, ацетоном и эфиром, высушивали в эксикаторе над концентрированной серной кислотой [Фармакологическая оценка полисахаридного комплекса цветков пижмы обыкновенной: диссертация … кандидата биологических наук: 14.03.06 / Енгалычева Екатерина Евгеньевна. - Рязань, 2016. - 143 с.)].

Далее проводили кислотный гидролиз полученного полисахарида. Для этого 0,1 г полисахаридного комплекса цветков пижмы помещали в круглодонную колбу и добавляли 3 мл 0,1 М раствора серной кислоты. Кипятили с обратным холодильником на водяной бане в течение 3 часов. Полученный раствор остужали, фильтровали через двойной слой марли и осаждали гидролизат полисахаридного комплекса трехкратным избытком 96% этанола. Осадок отфильтровывали и высушивали в эксикаторе над безводным хлоридом кальция. Гидролизат полисахаридного комплекса цветков пижмы обыкновенной представляет собой порошок светло-бежевого цвета.

Подлинность полисахарида подтверждена следующими качественными реакциями:

1. После добавления к водному раствору гидролизата полисахаридного комплекса цветков пижмы спиртового раствора α-нафтола и концентрированной серной кислоты на границе двух слоев появилось темно-фиолетовое кольцо, что свидетельствует о наличии углеводов (реакция Молиша);

2. После добавления к водному раствору гидролизата полисахаридного комплекса цветков пижмы спиртового раствора нафторезорцина, концентрированной хлороводородной кислоты, кипячения смеси и добавления бензола органический слой окрасился в фиолетовый цвет, что доказывает наличие в структуре полисахарида уроновых кислот.

3. После добавления к гидролизату полисахаридного комплекса цветков пижмы раствора сульфата меди (II) появилось зеленоватое окрашивание; раствора ацетата свинца основного - оранжевое окрашивание; реактива Феллинга при нагревании - выпадал красно-коричневый осадок оксида меди (I). Данные реакции подтверждают присутствие в гидролизате моносахаридов.

Молекулярную массу полученного гидролизата определяли вискозиметрическим методом. Готовили серию растворов гидролизата, измеряли время их истечения из вискозиметра Оствальда с диаметром капилляра 0,54 см. Рассчитывали удельную вязкость каждого раствора по формуле (таблица 1):

где

η_уд - удельная вязкость раствора;

- время истечения раствора из вискозиметра;

- время истечения воды очищенной из вискозиметра.

Далее рассчитывали приведенную вязкость η_уд/C. По полученным данным строили график зависимости приведенной вязкости от концентрации раствора (Фиг. 1) и экстраполировали его к С=0, таким образом, рассчитав характеристическую вязкость [η].

Для расчета молекулярной массы использовали нелинейное уравнение Марка-Хувинка:

где К и α - константы для данной системы полимер-растворитель при температуре 20°С (К=1,1 * 10^-5 дл/г, α=1,22), a М - молекулярная масса [Определение молекулярной массы пектина, полученного кислотным экстагированием из кожуры семян люпина / Васина Т.М. [и др.] - Сибирский мед. журнал, 2012. - Т. 3. - С. 126-128].

Молекулярная масса гидролизата полисахаридного комплекса цветков пижмы обыкновенной составила 3,8 кДа.

Изучение принадлежности полученного гидролизата

полисахаридного комплекса цветков пижмы обыкновенной к ингибиторам Pgp выполнено на линии клеток Сасо-2 (клетки аденокарциномы ободочной кишки человека), гиперэкспрессирующих данный белок-транспортер.

Клетки линии Сасо-2 культивировали при 37°С и 5%-м содержании CO₂ в Дульбекко модифицированной среде Игла (DMEM) с высоким содержанием глюкозы (4500 мг/л), содержащей L-глутамин (4 ммоль/л), 15% бычьей сыворотки и по 100 ЕД/мл и 100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина соответственно. После достижения 70-90% конфлюентности клетки пересеивали на полупроницаемую мембрану лунок transwell-системы.

В лунках transwell-системы клетки культивировали в течение 21 дня в той же питательной среде до достижения трансэпителиального сопротивления выше 500 мОм*см².

Транспортные эксперименты выполнялись в лунке transwell-системы. Для этого заменяли питательную среду на раствор Хэнкса, забуференный 15 мМ Хепес при рН 7,4 с содержанием 1% диметилсульфоксида.

Активность Pgp оценивали по транспорту его маркерного субстрата - фексофенадина (концентрация 150 мкмоль/л) через полупроницаемую мембрану с клетками Сасо-2, который анализировали по суммарному коэффициенту потока для данного вещества.

Концентрации фексофенадина в транспортной среде определяли методом ВЭЖХ с УФ детектированием при длине волны 220 нм.

В качестве препарата сравнения исследовали транспорт классического ингибитора PgP - верапамила в концентрации 200 мкМ.

Влияние гидролизата полисахаридного комплекса цветков пижмы обыкновенной на активность Pgp оценивали его добавлением в транспортную среду в концентрации 10 мкМ.

В каждой серии было по три повторения.

Полученные результаты обрабатывались в программе StatsoftStaatistica 8.0. Для оценки статистической значимости различий использовали дисперсионный анализ, попарные сравнения выполняли с помощью критерия Ньюмена-Кейсла. Статистически значимыми считали различия при р < 0,05.

Суммарный коэффициент потока в контрольной серии (в transwell-системе содержался один фексофенадин) составил 4,02.

Добавление в транспортную среду верапамила (препарат сравнения, классический ингибитор Pgp) приводило к снижению суммарного коэффциента потока на 41,0% (р < 0,05) по сравнению с показателями контрольной серии, что свидетельствует об ингибировании Pgp.

Добавление в среду инкубации полисахарида в концентрации 10 мкМ приводило к снижению коэффициента потока на 55,5% (р<0,05), по сравнению со значениями контрольной серии.

При этом достоверных различий между верапамилом и гидролизатом полисахаридного комплекса цветков пижмы обыкновенной по изучаемому показателю получено не было (р > 0,05).

Таким образом, гидролизат полисахаридного комплекса цветков пижмы обыкновенной с молекулярной массой 3,8 кДа в опытах in vitro ингибирует активность Pgp, причем по выраженности эффекта он сопоставим с классическим ингибитором белка-транспортера -верапамилом.