СПОСОБ ОЦЕНКИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ГЛИКОПРОТЕИНА-P В ГЕМАТОЭНЦЕФАЛИЧЕСКОМ БАРЬЕРЕ

Известен способ оценки функционирования Pgp в ГЭБ in vivo по анализу церебрального объема распределения R-¹¹C-верапамила (субстрата Pgp) методом протонно-эмиссионной томографии [O.L. de Klerk, A.T.M. Willemsen, M. Roosink, A.L. Bartels, N.H. Hendrikse, F.J. Bosker. // Int. J. Neuropsychopharmacol.  2009. V.12. P.895–904]. Однако в связи с медленным поступлением указанного вещества в мозг, при повышенной функциональной активности белка-транспортера может наблюдаться большой шум сигнала, что затрудняет анализ [Syvanen S., Hammarlund-Udenaes M. Curr Top Med Chem. 2010. V. 10. P. 1799–1809]. Кроме того, оборудование для протонно-эмиссионной томографии является весьма дорогостоящим, а работа с радиоактивными изотопами, которые сами по себе являются весьма токсичными и небезопасными, требует наличия соответствующей лаборатории и высокой квалификации сотрудников.

Первой группе (n=30) в хвостовую вену вводили фексофенадин в дозе 10 мг/кг [Jaisue S.,  Gerber J.P.,  Davey A.K.  // Xenobiotica. 2010. V. 40. № 11. P. 743–750].

Первоначально для оценки активности Pgp в ГЭБ предполагалось вводить фексофенадин перорально [RU2587780C1], однако его фармакокинетика оказалась вариабельной, поэтому в дальнейшем применялось внутривенное введение субстрата, при котором его биодоступность составляет 100%.

В связи с отсутствием лекарственной формы фексофенадина для парентерального введения производилась экстракция лекарственного вещества из таблеток "Аллегра", "Sanofi", Франция (180 мг) следующим образом. Одна таблетка измельчалась и суспендировалась в 20 мл ацетонитрила, после чего взбалтывалась на приборе Shaker в течение 15 мин с последующим центрифугированием 15 мин при 3500 об/мин. Надосадочный слой упаривали на роторно-вакуумном испарителе и сухой остаток растворяли в 10 мл воды для инъекций. Для исследования полученный раствор вводили в хвостовую вену крыс в объеме 2 мл/кг. Концентрацию фексофенадина в полученном растворе определяли методом ВЭЖХ.

Второй группе животных (n=30) в течение 14 дней вводили индуктор Pgp − рифампицин перорально в дозе 20 мг/кг два раза в день, а затем на 15-й день внутривенно вводили фексофенадин в дозе 10 мг/кг.

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием программы "Statsoft Statistica 7.0" (США).

Характер распределения полученных данных определяли по критерию Шапиро-Уилка. Учитывая, что распределение большинства данных было отличным от нормального, межгрупповые различия оценивали по критерию Крускала-Уоллиса, попарные сравнения выполняли по критерию Манна-Уитни с поправкой Бонферрони.

Концентрация фексофенадина в плазме крови крыс через 5 мин после его внутривенного введения в дозе 10 мг/кг массы (контроль) составила 16,6 мкг/мл, затем постепенно снижалась и достигала значения 1,0 мкг/мл к 60 мин исследования. Введение рифампицина (индуктор Pgp) существенно не влияло на фармакокинетику фексофенадина: площадь под фармакокинетической кривой концентрация-время (AUC_0-t-_плазма) статистически значимо не отличалась от показателей контрольных животных. Курсовое применение мексидола (ингибитор Pgp) вызывало повышение AUC_0-t-_плазма фексофенадина на 81,2% (p=0,07).

При внутривенном введении фексофенадина крысам вистар в дозе 10 мг/кг массы препарат проникал через ГЭБ и фиксировался в коре больших полушарий уже через 5 мин после введения, достигал максимальной концентрации через 15 мин, а затем его уровень начинал снижаться.

Применение индуктора Pgp – рифампицина перед введением фексофенадина приводило к достоверному снижению AUC_{0-t-мозг,} что свидетельствует об уменьшении концентрации фексофенадина в коре головного мозга (фиг. 1). На фиг. 1: * - показаны достоверные различия (p<0,05) по сравнению с контролем.

Применение ингибитора Pgp – мексидола перед иньекцией фексофенадина приводило к достоверному повышению AUC_0-t-мозг по сравнению с данными контрольных животных, что свидетельствует об увеличении концентрации фексофенадина в коре головного мозга (фиг. 1).

Показано, что при введении рифампицина показатель AUC_0-t-мозг / AUC_{0-t-плазма} достоверно уменьшался (фиг. 1), а при введении мексидола статистически значимо не отличался от данных контрольных животных (фиг. 1). Это обусловлено тем, что концентрация фексофенадина в плазме при приеме рифампицина существенно не изменялась, а концентрация в коре головного мозга снижалась, то есть происходило локальное увеличение активности Pgp в ГЭБ.

При приеме мексидола содержание фексофенадина повышалось как в плазме, так и в коре головного мозга. Это свидетельствует о том, что увеличение содержания фексофенадина в коре мозга связано не с локальным ингибированием Pgp в изучаемом барьере, а с системным повышением концентрации фексофенадина в организме при отсутствии изменений проницаемости ГЭБ.

Таким образом, для адекватной оценки функциональной активности Pgp в гематоэнцефалическом барьере по фармакокинетике его маркерного субстрата фексофенадина целесообразно определять не AUC_0-t-мозг, а именно отношение AUC_0-t-мозг / AUC_{0-t-плазма}, а также использовать внутривенное введение маркерного субстрата Pgp фексофенадина лабораторным животным.