СПОСОБ ОЦЕНКИ РИСКА РАЗВИТИЯ ОНКОЗАБОЛЕВАНИЙ В ПОКОЛЕНИЯХ ЖИТЕЛЕЙ РЕГИОНОВ РАДИОНУКЛИДНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ

Изобретение относится к медицине, в частности к радиационной медицине, педиатрии, терапии и цитологии, и может быть использовано для оценки риска онкозаболеваний.

Известно, что детский организм в связи с непрерывным ростом и развитием, критическими возрастными периодами, с функциональной незрелостью тканей и систем особенно чувствителен к влиянию сложного комплекса факторов окружающей среды, способствует перестройке метаболических процессов детского организма, что в последующем может приводить к формированию различных радиационно-индуцированных заболеваний, в том числе - к активации канцерогенеза.

Повышенный риск развития онкозаболеваемости остается одним из важнейших стохастических эффектов и является серьезным последствием действия радиации. Дети в 2-3 раза более радиочувствительны, чем взрослые, и относительный риск канцерогенеза у детей выше, чем у взрослых. Ионизирующее излучение низкой интенсивности модифицирует клеточно-тканевые процессы: приводит к увеличению двунитевых разрывов ДНК, усилению репарации, ускорению апоптоза и компенсаторной клеточной пролиферации. При хроническом воздействии малых доз радиации, независимом или сочетанном с другими экзо- и эндогенными факторами, риск развития таких повреждений повышается.

Наиболее тревожным является высокий уровень и рост новообразований как в 1-ом, так и, особенно, во 2-ом поколении жителей радиационно загрязненных регионов, за счет роста распространенности злокачественных новообразований, уровень которых почти в два раза выше, чем у детей в Российской Федерации в целом.

Следует отметить, что в зонах с более высоким уровнем радионуклидного загрязнения (свыше 1660 кБк/м²) распространенность злокачественных новообразований почти в 2 раза выше, чем в зонах с менее выраженным уровнем радионуклидного загрязнения. В период роста и развития ребенка быстрые и значительные физиологические сдвиги под влиянием радиационного воздействия легко трансформируются в патологические процессы. В этом случае радиационный фактор может играть как главную роль, так и изменять (усиливать) влияние других и/или их сочетание.

В механизмах онкогенеза и поддержания стабильности генома одну из ведущих ролей наглядно демонстрирует белок р53. Так известно, что примерно в половине человеческих опухолей обнаружено наличие мутантного р53. Белок р53 выполняет множество функций, направленных на регуляцию клеточной миграции, аутофагии, анаэробного и аэробного гликолизов и других аспектов метаболизма клетки. Белок р53 также является модулятором клеточной дифференцировки, а также играет основную роль в поддержании геномной стабильности (Чумаков П.М. Белок р53 и его универсальные функции в многоклеточном организме. Успехи биологической химии, т. 47, 2007, с. 3-52), в механизме которой лежит регуляция ответной реакции организма на повреждение ДНК. Изменение стабильности генома под воздействием ионизирующей радиации приводит к геномной нестабильности (которая может быть выражена в виде хромосомных перестроек, образования микроядер), что в свою очередь изменяет функциональную активность белка р53. Таким образом, роль гена р53 определяется как координаторная для функционирования генной сети, осуществляющей контроль за клеточным циклом, репарационными процессами, процессами апоптоза, т.е. осуществление возможности адаптации долгоживущих организмов, накапливающих большое количество соматических мутаций.

Ген р53 часто является ключевым и центральным при канцерогенезе. Как и любой ген, он вовлечен во взаимодействие с большим количеством других генов и их белковых продуктов, образуя с каждым из них отрицательные и положительные обратные связи в генной сети р53. Поэтому изучение только одного, хоть и самого важного гена в отрыве от его сети ограничивает понимание процесса канцерогенеза в условиях хронического воздействия малых доз ионизирующей радиации в поколениях лиц, проживающих в регионах радионуклидного загрязнения.

Технология Nanostring (CA 2893908 (A1), INST SYSTEMS BIOLOGY, Krassen Dimitrov, Dwayne Dunaway, 16.01.2003) основана на использовании флуоресцентных молекулярных штрих-кодов, обнаруживающих транскрипты генов с помощью флуоресцентного микроскопа. Последний способен визуализировать до 800 нуклеиновых кислот в одном образце. Преимущество данного метода заключается в измерении количества иРНК без ферментативных реакций и разведений, благодаря чему существенно повышаются чувствительность и скорость метода. Сравнительные исследования показали, что технология Nanostring более чувствительна, чем технология Array, использующая ДНК-микрочипы, а также значительно проще в выполнении и производительнее, чем ПНР в реальном времени по технологиям Taqman и SYBR Green.

В связи с этим, технология Nanostring очень эффективна в исследовании больших генных сетей. Такое исследование может быть актуально при различных полигенных нарушениях, в частности, вызванных внешними мутагенными (радиационными) воздействиями. Важную роль такие исследования играют при оценке генетических дефектов и онкогенных рисков у лиц, подвергшихся длительному радиационному облучению. Исследования таких генных сетей, как сеть гена белка р53, связанных с онкогенезом, особенно актуальны.

Проблемой, на решение которой направлено изобретение, является создание надежного и чувствительного метода регистрации риска развития онкозаболевания у различных поколений жителей территорий радиоактивного загрязнения с помощью анализа экспрессии генной сети белка р53 по технологии Nanostring.

Наиболее близким к патентуемому является способ оценки риска развития онкозаболеваний в поколениях жителей регионов радионуклидного загрязнения, описанный в ж. РОССИЙСКИЙ ВЕСТНИК ПЕРИНАТОЛОГИИ И ПЕДИАТРИИ, 3, 2016, с. 87-94 - прототип. Способ предусматривает осуществление количественной оценки лимфоцитов периферической крови с фенотипическими признаками субпопуляции CD95+ с помощью проточной цитофлюориметрии для оценки готовности к апоптозу и выявление геномной нестабильности с помощью микроядерного теста с трансгенерационной передачей геномной нестабильности от матери к ребенку.

Недостатком этого способа является тот факт, что оценивается только один параметр, имеющий отношение к экспрессии белка р53 - готовность к апоптозу, тогда как предлагаемый метод позволяет оценить изменения экспрессии генов всей генной сети белка р53. Кроме того, микроядерный тест является скрининговым методом, не передающим всю полноту изменений генома под действием радиации.

Патентуемый способ оценки риска развития онкозаболеваний в поколениях жителей регионов радионуклидного загрязнения включает отбор периферической крови и последующее сопоставление выявленных маркеров у матерей и их потомства.

Отличие способа состоит в следующем.

Из крови матерей и потомства выделяют РНК, в образцах которых проводят одновременное количественное определение уровня экспрессии генов ST13, IER3, BRCA1, LRDD, MRAS генной сети белка р53, для чего образцы РНК гибридизуют с репортерным и захватывающим флуоресцентными зондами Nanostring,

и при наличии по отношению к группе пациентов, не подвергавшихся воздействию радиационного фактора, понижения или повышения уровня экспрессии указанных генов у матерей с клиническими проявлениями злокачественных новообразований и однонаправленном изменении у их потомства уровня экспрессии указанных генов оценивают у детей высокий риск развития онкозаболеваний.

Технический результат - ранняя диагностика риска онкозаболевания у пациента, проживающего в регионе радионуклидного загрязнения, имеющего одного из родителей с клинической картиной онкозаболевания.

Материалы и методы

Для оценки повышенного риска онкогенеза обследовали 36 постоянных жителей из территорий Российской Федерации, подвергшихся загрязнению радионуклидами вследствие аварии на Чернобыльской АЭС. Они составили группу наблюдения. Из 36 жителей было 13 матерей, родившихся в 1969-1987 г.г., которые были отнесены к первому поколению. Второе поколение составили дети, рожденные этими матерями - всего 23 ребенка (по 1-2-3 у этих матерей) в возрасте до 17 лет (включительно).

В группу сравнения вошло 12 человек: из них 6 - 1-е поколение, 6 - 2-е поколение (аналогичных годов рождения), проживающих в регионах, не подвергшихся радиационному воздействию.

Для анализа экспрессии генов генной сети белка р53 использованы образцы РНК, выделенные из лимфоцитов свежей периферической крови всех 48 обследуемых индивидуумов.

Обработка данных осуществлялась с помощью статистического пакета NCSS 11. Полученные в группах данные сравнивались между собой по непараметрическому критерию Манна-Уитни.

Генная сеть гена белка р53 состоит из огромного количества генов, список которых регулярно пополняется. При создании панели для этой сети мы отобрали по данным литературы 102 гена, наиболее тесно связанных как на молекулярном, так и на функциональном уровне с геном р53. 6 генов домашнего хозяйства были выбраны в качестве контрольных.

Результаты

При изучении уровня экспрессии гена р53 между исследуемой группой наблюдения и группой сравнения достоверных различий обнаружено не было.

Однако при изучении уровня экспрессии всех изученных генов было обнаружено 24 гена со статистически значимыми различиями между группой наблюдения и группой сравнения (табл. 1).

Наиболее значимыми оказались различия для 5 генов: ST13, IER3, BRCA1, LRDD, MRAS (фиг 1, 2). ST13 ингибирует опухолевый рост при различных видах рака. Понижение экспрессии ST13 может приводить к риску развития карциномы желудка и колоректальной карциномы. Ген IER3 высоко экспрессируется во многих опухолевых тканях, повышение уровня белка может приводить к повышению риска опухолеобразования. Активно дискутируется роль экспрессии этого гена в регуляции апоптоза. Имеется тесная связь между экспрессией IER3 и мутантным Р53, Ki-67, EGFR, выражающаяся большими размерами и более продвинутой стадией опухоли. Понижение уровня экспрессии BRCA-1 может приводить к увеличению риска рака молочной железы и яичников. Снижение уровня экспрессии генов LRDD и MRAS может приводить к снижению апоптотической активности.

При сравнении данных между пациентами группы сравнения и жителями 1-го и 2-го поколения были выявлены статистически достоверные различия для всех 5 генов (фиг. 1, 2), тогда как при сравнении данных для 1-го и 2-го поколения статистически значимых различий обнаружено не было. Таким образом, как в 1-м, так и во 2-м поколениях выявлены одинаковые по знаку изменения в экспрессии генов генной сети белка р53, свидетельствующие о трансгенерационной передаче возникших в результате радиационного воздействия изменений в геноме.

Существо изобретения поясняется на графиках.

Фиг. 1 - Сравнение средних значений экспрессии 5 генов в группе сравнения и в 1-м поколении жителей радиационно загрязненных регионов.

Фиг. 2 - Сравнение средних значений экспрессии 5 генов в группе сравнения и во 2-м поколении жителей радиационно загрязненных регионов.

В результате нашей работы было показано, что экспрессия самого гена ТР53 у жителей радиационно загрязненных областей не отличается от группы сравнения. Однако анализ генной сети указанного белка демонстрирует значимые и передающиеся по наследству изменения, заключающиеся или в повышении, или в снижении экспрессии ряда функционально важных генов.

Наше исследование подтверждает, что при исследовании больших генных сетей технология Nanostring имеет очевидные достоинства в отношении как высокой чувствительности, так и производительности. Проведенное нами пилотное исследование с помощью метода Nanostring позволяет утверждать о передаче специфических последствий облучения и, соответственно, риска онкогенеза трансгенерационно. Так при исследовании уровня экспрессии 5 перечисленных выявленных генов отмечено наличие аналогичного знака и уровня изменений (превышения/понижения) у матерей (1-е поколение) с клиническими проявлениями злокачественных новообразований и у их детей (2-е поколение), однако, клинические проявления наличия онкозаболеваний (при использовании параклинических методов верификации диагноза) в настоящее время отсутствуют.

Таким образом, чрезвычайно актуальным является расширение спектра методов исследования, способных выявлять и повышать возможности регистрации риска развития онкозаболеваний в поколениях жителей радиационно-загрязненных регионов с целью раннего выявления патологии и проведения профилактических мероприятий для снижения инвалидизации и смерти молодого трудоспособного населения.

Способ осуществляют следующим образом.

Для одновременного количественного определения уровня экспрессии 108 генов генной сети белка р53 производится взятие РНК из образцов свежей периферической крови. Это осуществляется с помощью промышленного набора Invitrogen RNAeasy Kit, который состоит из лизирующего буфера, двух отмывочных буферов, а также дополнительно используют 70% этиловый спирт для преципитации РНК и дистиллированную воду для элюции РНК. Далее образцы РНК гибридизуют с репортерным и захватывающим флуоресцентными зондами Nanostring, для чего в реакцию вносят 5 мкл образца РНК, 5 мкл репортерного зонда, 5 мкл захватывающего зонда и 15 мкл реакционного буфера. После этого полученную смесь помещают в термоциклер, где происходит гибридизация в течение 12-36 часов при температуре 65 градусов C. Далее полученные гибридные образцы переносят в станцию пробоподготовки, где они автоматически прикрепляются к специальному картриджу в течение 3 часов. После этого картридж с образцами переносят в цифровой анализатор nCounter, где в течение 5 часов флуоресцентный микроскоп делает 555 снимков картриджа и далее автоматически высчитывает на их основе уровень экспрессии каждого гена в каждом образце.

Для доказательств возможности реализации заявленного назначения и достижения указанного технического результата приводим следующие данные.

Клинический пример 1

Семья №1 (мать и ребенок) проживает в регионе радионуклидного загрязнения с уровнем загрязнения почвы по цезию-137=562 кБк/кв.м. У матери ребенка верифицирован диагноз: Лимфогранулематоз. У ребенка - клинических данных по наличию новообразования по данным параклинических обследований не выявлено. Матери и ребенку проведено исследование экспрессии генов генной сети белка р53, которые сведены в таблицу 2.

Полученные результаты указывают на то, что у матери имеет место снижение экспрессии всех 5 исследуемых генов, которое ассоциировано с клиническими проявлениями онкозаболевания.

У ребенка также имеет место однонаправленность изменений практически всех исследуемых показателей: снижение экспрессии 4-х (80%) из 5-ти исследуемых генов. При этом значения сниженных показателей выражены в меньшей степени, чем у матери.

Таким образом, можно сделать заключение, что в данной семье риск развития онкозаболевания у ребенка (2-е поколение) не является повышенным.

Клинический пример 2

Семья №2 (мать и ребенок) проживает в регионе радионуклидного загрязнения с уровнем загрязнения почвы по цезию-137=557 кБк/кв.м. У матери ребенка верифицирован диагноз: Папиллярный рак щитовидной железы; проведена тиреоэктомия, в настоящее время проводится заместительная гормональная терапия. У ребенка - имеются данные по наличию новообразования (по данным параклинических обследований) - Ангиомиолипома поджелудочной железы. Матери и ребенку проведено исследование экспрессии генов генной сети белка р53, которые сведены в таблицу 3.

Полученные результаты указывают на то, что у матери имеет место повышение экспрессии 2 из 5 исследуемых генов и снижение 1 (из 5 генов), которое ассоциировано с клиническими проявлениями онкозаболевания.

У ребенка имеет место изменение экспрессии генов в 100% случаев: повышение экспрессии 4-х (из 5-ти исследуемых генов) и снижение экспрессии 1 гена (аналогично материнским). При этом значения 3-х из повышенных/пониженных показателей (в 75% случаев) выражены в большей степени, чем у матери.

Таким образом, можно сделать заключение, что в данной семье риск развития онкозаболевания у ребенка (2-е поколение) является повышенным, что и отражается в клинике в настоящее время в наличии новообразования поджелудочной железы, которое имеет тенденцию трансформироваться в злокачественное. В настоящее время у ребенка имеется высокий риск формирования онкопатологии, причем следует отметить наличие приоритетности формирования онкопатологии в отношении железистой ткани.