Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РАЗВИТИЯ МЕТАСТАЗОВ У БОЛЬНЫХ РАКОМ ТЕЛА МАТКИ НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ MAGEA1, MAGEB2 И PRAME1

Изобретение относится к медицине, а именно, к молекулярной биологии, онкологии, и касается способа прогнозирования развития метастазов у больных раком тела матки на основе анализа экспрессии РТА-генов: MAGEA1, MAGEB2 и PRAME1.

Рак тела матки является самой распространенной злокачественной опухолью органов малого таза у женщин (см. World Cancer Report 2014. World Health Organization. Chapter 5.12.). Рецидивы являются одной из ведущих причин неудач в лечении рака тела матки и определяют неблагоприятный прогноз заболевания.

Частота возникновения рецидивов достигает 40% при железисто-плоскоклеточном раке и 10% при высокодифференцированной аденокарциноме эндометрия (см. Урманчеева А.Ф., Ульрих Е.А., Нейштадт Э.Л. и др. Серозно-папиллярный рак эндометрия (клинико-морфологические особенности). Вопр. онкологии 2002; 48 (6): 679-83.). Более 80% рецидивов возникает в первые 2 года после радикального лечения (см. Кузнецов В.В., Нечушкина В.М. Хирургическое лечения рака тела матки. Практ. онкология 2004; (17): 25-32.).

С увеличением промежутка времени после операции прогрессивно снижается вероятность появления местного рецидива. Причинами возникновения ранних рецидивов являются крайне агрессивное течение заболевания, имплантационный путь метастазирования, неадекватный объем хирургического вмешательства.

Причины и сроки возникновения поздних рецидивов не определены и достаточно не изучены, но, скорее всего, зависят от биологических особенностей опухоли. Биологические особенности опухоли связаны с экспрессией огромного количества генов, в том числе РТА-генов.

Раково-тестикулярные антигены (РТА, Cancer Testis Antigens (СТА)) человека, экспрессируются в опухолях различного гистологического происхождения, и практически не экспрессируются в нормальных тканях (за исключением семенников и плаценты) (см. Водолажский Д.И., Кит О.И., Могушкова Х.А., Пушкин А.А., Тимошкина Н.Н. Раковые тестикулярные антигены в иммунотерапии злокачественных опухолей. Сибирский онкологический журнал. 2017; 16(2):71-81. DOI: 10.21294/1814-4861 - 2017-16-2-71-81).

Для некоторых РТА в результате многочисленных исследований было выявлено их прогностическое значение, которое может быть использовано для уточняющей диагностики и при раке тела матки (см. Matkovic В., Juretic A., Spagnoli G.C., Separovic V., Gamulin М., Separovic R., Saric N., Basic-Koretic M., Novosel I., Kruslin B. Expression of MAGE-A and NY-ESO-1 cancer/testis antigens in medullary breast cancer: retrospective immunohistochemical study. Croat Med J., 2011, no 2, pp.171-177).

MAGEA1 (Melanoma-associated antigen 1) - первый РТА определенный в меланоме, относится к группе тестикулярно-ограниченных РТ-генов, которые экспрессируются только в семенниках и больше ни в какой другой нормальной зрелой ткани, кроме плаценты (см. Hoon D.S., Yuzuki D., Hayashida М. et al. Melanoma patients immunized with melanoma cell vaccine induce antibody responses to recombinant MAGE-1 antigen 2. // The Journal of Immunology. - 1995. - Vol. 154. - P. 730-737).

MAGEB2 (Melanoma Antigen Family B2) относится к семейству MAGEB, информация о прогностическом потенциале отсутствует (см. NCBI).

PRAME1 (Melanoma antigen preferentially expressed in tumors) кодирует антиген, который преимущественно экспрессируется в меланомах человека и распознается цитолитическими Т-лимфоцитами. Он не экспрессируется в нормальных тканях, кроме семенников.

Профиль экспрессии аналогичен другим антигенам, таких семейств как MAGE, BAGE и GAGE. Для этого гена были обнаружены пять альтернативных вариантов транскрипции, кодирующих один и тот же белок (см. www.ncbi.nlm.nih.gov).

Из патентных источников известны:

1) «Способ прогнозирования выживаемости больных эндометриоидным раком тела матки» (см. патент RU 2299690 С1, опубл. 27.05.2007, Бюл. №15), в котором на основе оценки исходного соматического состояния больной и ряда иммуногистохимических параметров опухоли прогнозируется выживаемость больной эндометриоидным раком тела матки. В качестве иммуногистохимических параметров используются Ki-67 и HER2.

2) «Способ определения эффективности лечения рака тела матки» (см. патент RU 2424806 С1, опубл. 27.07.2011 г., Бюл. №21): на основе определения коэффициента соотношения тетрагидро-11-дезоксикортизола к кортизолу через 1,5-2 недели после окончания лечения в суточной моче прогнозируют длительность безрецидивного периода.

3) «Способ прогнозирования развития рецидива при раке тела матки» (см. патент RU 2250077 С2, опубл. 20.04.2005 г., Бюл. №11): включает биохимическое исследование в ткани злокачественной опухоли и эндометрия, при этом до и после проведения комплексного лечения определяют активности катепсина Д и кислотостабильных ингибиторов, рассчитывают коэффициент соотношения катепсина Д и кислотостабильных ингибиторов, и при уровне коэффициента, превышающем показатели, характерные для ткани интактного эндометрия, более чем в 2,4-2,8 раза, прогнозируют развитие рецидива рака эндометрия в срок до 6 месяцев.

4) «Способ прогнозирования выживаемости больных раком тела матки на основании уровня экспрессии гена ESR1» (патент RU 2611352 С1, опубл. 21.02.2017 Бюл. №6). Основан на расчете относительной экспрессии генетического локуса ESR1 с последующим вычислением соотношения экспрессии этого гена в опухолевой ткани относительно нормальной ткани матки по формуле K=REcancer/REnormal. При значении K в пределах 0,31≤K_ESR1≤0,81 прогнозируют благоприятный исход заболевания. При значении K в пределах 5,84≤K_ESR1≤9,32 прогнозируют неблагоприятный исход заболевания.

Описанные изобретения используют более трудоемкие и сложные в анализе способы, при этом обладающие меньшей чувствительностью и специфичностью, чем предлагаемый нами.

Изобретение «Способ прогнозирования развития метастазов у больных раком тела матки на основе анализа экспрессии генов MAGEA1, MAGEB2 и PRAME1» является новым, так как относительная экспрессия данных РТА генов ранее не использовалась для решения поставленного технического результата.

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание нового, простого в исполнении, не дорогостоящего и более точного способа прогнозирования развития метастазов у пациенток с диагнозом рак тела матки.

Технический результат достигается тем, что получают кДНК на матрице тотальной РНК с помощью реакции обратной транскрипции, проводят амплификацию кДНК с высокоспецифичными праймерами для генов MAGEA1, MAGEB2, PRAME1 и GAPDH, анализируют первичные данные и вычисляют коэффициент относительной экспрессии (К) (соотношения относительной экспрессии генов MAGEA1, MAGEB2, PRAME1 в опухолевой ткани относительно условно нормальной ткани матки), сравнивают полученные значения К_MAGEA1, К_MAGEB2, К_PRAME1 с интервалами прогностических коэффициентов экспрессии, и при значении К_MAGEA1<1,9±0,47, К_MAGEB2<1,0±0,54 и К_PRAME1<1,1±0,21 прогнозируют течение заболевания без метастазов (чувствительность 95%, специфичность 90%), а при значении К_MAGEA1>3,9±0,87, К_MAGEB2>11,5±1,59 и К_PRAME1>3,8±0,98 прогнозируют развитие метастазов (чувствительность 85%, специфичность 90%). При значениях коэффициента К между указанными интервалами считают полученный результат неопределенным.

Заявленный анализ основан на определении экспрессии генов MAGEA1, MAGEB2, PRAME1, предварительно нормализованных относительно референсного локуса GAPDH, и последующем вычислении соотношения экспрессии гена в опухолевой ткани по отношению к нормальной ткани: К=E_cancer/E_normal.

Заявленный способ включает следующие приемы: выделение тотальной РНК из тканевых проб с помощью метода гуанидин-тиоционат-фенол-хлороформной экстракции; определение относительной экспрессии генетических локусов методом ПЦР-РВ в присутствии красителя EvaGreen Dye и специфичных праймеров на матрице синтезированной кДНК; анализ первичных данных с помощью программного продукта амплификатора; расчет экспрессии гена на основании соотношения сигналов, продуцируемых ампликонами изучаемой и референсной последовательностей, и обработка данных на соответствие значениям коэффициентов экспрессии, характерным для групп пациенток с метастазами или без метастазов.

Заявляемый способ осуществляется следующим образом.

На первом этапе отбирают образцы тканей пациенток - опухолевые и условно здоровые, из операционного или биопсийного материала. Образцы для транспортировки в лабораторию и хранения замораживают в жидком азоте.

Фрагменты ткани измельчают скальпелем и/или ножницами, дополнительно растирают в фарфоровых ступках в присутствии лизирующего раствора, содержащего 4 М гуанидин тиоцианат, 25 мМ цитрат натрия, 0,5% саркозил и 0,1 М 2-меркаптоэтанол.

Затем в лизат добавляют 1М цитрат Na рН 4,0, кислый фенол и смесь хлороформ/изоамиловый спирт, перемешивают на вортексе и охлаждают образцы при 0°С в течение 15 мин.

Дальнейшее выделение РНК из тканей проводят по методу по Р. Chomczynski & N. Sacchi (2006) (см. Chomczynski Р, Sacchi N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nat Protoc. 2006; 1(2):581-5). Выделенная РНК обрабатывается ДНКазой.

Перед проведением реакции обратной транскрипции для проверки качества выделенной РНК проводят электрофорез в 2% геле агарозы по методу Masek Т. et al. (см. Masek Т., Vopalensky V., Suchomelova P., Pospisek M. Denaturing RNA electrophoresis in TAE agarose gels. // Anal Biochem. - 2005 -336(1) - P. 46-50.).

Перед проведением реакции обратной транскрипции измеряют концентрацию полученных препаратов РНК на флюориметре и нормализуют ее до 2 нг/мкл. Синтез кДНК можно проводить с использованием коммерческих наборов основанных на применении обратной транскриптазы M-MuLV Reverse Transcriptase и случайных праймеров (random hexamer). Реакцию обратной транскрипции проводят при 37°С в течение 30 минут.

Анализируемые последовательности генетических локусов амплифицировали в 20 мкл ПЦР-смеси, содержащей 12 нг кДНК, 0,20 мМ dNTPs, 2,5 мМ MgCl₂, 1х-ый ПЦР-буфер и 0,1 е.а. ДНК-полимеразы Thermus aquaticus, краситель EVA-Green и по 600 нМ прямого и обратного праймеров для референсного гена (GAPDH) или гена-мишени. Прямые и обратные праймеры были разработаны с использованием референсных последовательностей NCBI GenBank (таблица 1).

Количественную ПЦР-РВ амплификацию проводили на термоциклере в соответствии с инструкциями производителя по следующей программе. Первичная денатурация: t=95°C в течение 4 мин. 40 циклов: t=95°C в течение 10 с, t=58°C в течение 30 с, t=72°C в течение 30 с.

В одной постановке в качестве матрицы использовали одновременно кДНК опытной (опухоль) и контрольной (условно здоровая ткань) пробы для определения сигналов, продуцируемых амплификатами локусов MAGEA1, MAGEB2, PRAME1 и референсного GAPDH, каждого в трех повторностях.

Относительная экспрессия генетических локусов вычисляется следующим образом:

- рассчитывают медиану C_t по трем повторам для целевого локуса и референсного GAPDH,

- далее рассчитывают величину ΔC_t=C_t(ген мишень) - C_t(GAPDH)

- относительную экспрессию генетического локуса (RE) рассчитывают по формуле 2^-ΔCt.

Вывод об изменении экспрессии гена делают, сравнивая показатели относительной экспрессии генетических локусов в опухолевой и условно здоровой ткани. Для этого вычисляют медиану RE_оп опухолевых образцов и медиану RE_к контрольных (условно здоровая ткань) для каждого генетического локуса и рассчитывают соотношение относительной экспрессии генов в опухолевой ткани по отношению к нормальной ткани матки: К=RE_cancer/RE_normal.

Далее сравнивают полученные значения К с интервалом прогностического коэффициента экспрессии, и при значении К_MAGEA1<1,9±0,47, К_MAGEB2<1,0±0,54 и К_PRAME1<1,1±0,21 прогнозируют течение заболевания без метастазов (чувствительность 95%, специфичность 90%), а при значении К_MAGEA1>3,9±0,87, К_MAGEB2>11,5±1,59 и К_PRAME1>3,8±0,98 прогнозируют развитие метастазов (чувствительность 85%, специфичность 90%). При значениях коэффициента К между указанными интервалами считают полученный результат неопределенным.

Для доказательства прогностической ценности гена MAGEA1, MAGEB2 и PRAME1 приводим 2 выписки из историй болезни.

1) Больная А., 61 год, госпитализирована в марте 2016 г. в онкогинекологическое отделение РНИОИ с верифицированным диагнозом рак тела матки после биопсии эндометрия по месту жительства. Морфологическое заключение о наличии эндометриоидной аденокарциномы было подтверждено при пересмотре в РНИОИ.

Показатели K_MAGEA1=4,2, K_MAGEB2=12,5 и K_PRAME1=2,9 соответствовали прогностическим коэффициентам, характерным для развития метастазов.

16.03.2016 г. больной было выполнено хирургическое вмешательство согласно стандарту лечения: нервосберегающая пангистерэктомия, тазовая и селективная парааортальная лимфаденэктомия. При макроскопической оценке в удаленной матке была обнаружена полиповидная экзофитная опухоль, распространяющаяся на всю полость матки, исключая цервикальный канал. Послеоперационное течение - без особенностей.

Морфологический анализ после операции: в полости матки эндометриоидная аденокарцинома G2 с инвазией в миометрий на глубину 2 мм при толщине стенки матки 2,5 см; в удаленных лимфоузлах и по линии резекции влагалища признаков опухолевого роста не обнаружено.

В октябре 2016 г. при очередном диспансерном осмотре в культе влагалища у больной был обнаружен рецидив, подтвержденный цитологически (ц.а. - аденокарцинома). В этой связи больной было проведено 6 курсов полиохимиотерапии по схеме САР (циклофосфан-адриамицин-цисплатин).

На фоне проведения последнего курса в марте 2017 г. в правой паховой области у пациентки появился метастаз. Опухоль верифицирована, (ц.а. - метастаз аденокарциномы).

В апреле 2017 года, где во время обследования были обнаружены метастатические лимфоузлы в правой аксиллярной области, верифицированные при пункционной биопсии, как аденокарцинома.

В апреле 2017 года начата II линия полихимиотерапии по схеме AUC-7, которую больная не закончила из-за продолжающейся неконтролируемой генерализации с метастазами в легкие. Смерть больной наступила в мае 2017 года, через 15 месяцев после стандартного радикального лечения.

2) Больная Е., 63 года, госпитализирована в онкогинекологическое отделение РНИОИ в ноябре 2016 г. с верифицированным и подтвержденным при пересмотре в РНИОИ диагнозом: рак тела матки в глубокой менопаузе, (г.а. - аденокарцинома). На догоспитальном этапе при сонографическом комбинированном исследовании была обнаружена матка без признаков миомы, нормальных размеров, с неравномерно утолщенным эндометрием до 6-8 мм, местами повышенной эхогенности в зоне срединного М-эха. При СРКТ признаков отдаленного метастазирования и поражения тазовых и парааортальных лимфоузлов не обнаружено.

30 ноября 2016 г. больной выполнена стандартная операция: нервосберегающая пангистерэктомия, тазовая и селективная парааортальная лимфаденэктомия. Макроскопически преимущественно в области дна и верхней половины полости матки обнаружена экзофитная опухоль с инфильтрацией в миометрий и очагами деструкции. Послеоперационный период - без осложнений. Морфологический анализ - G2 эндометриоидная аденокарцинома с инвазией 1/2 стенки матки.

Показатели К_MAGEA1=1,2, К_MAGEB2=1,1 и К_PRAME1=0,9 соответствовали прогностическим коэффициентам, характерным для развития заболевания без метастазов.

В лимфатических узлах и по линии резекции влагалища признаков опухолевого роста не обнаружено, что позволило определить степень распространения процесса, как T1bN0M0. Согласно стандарту комбинированного лечения больная получила курс адъювантной сочетано-лучевой терапии общей СОД: ТА=50 Гр, ТВ=40, FP и эндовагинально 40 Гр.

Больная наблюдается без признаков рецидива и метастазов.

Предлагаемым способом было осуществлено прогнозирование развития/или отсутствия метастазов у 30 пациенток с диагностированным раком тела матки.

Заявляемый способ является экономически оправданным, осуществляется в условиях стандартной лаборатории молекулярной биологии (ПЦР), без использования специального дорогостоящего оборудования; обладает высокой чувствительностью и специфичностью, универсален, его осуществление возможно с операционными биоптатами, регистрацию результатов производят однократно в конце исследования, способ занимает менее 8 часов.