СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ МЕСТНОРАСПРОСТРАНЁННОГО НЕРЕЗЕКТАБЕЛЬНОГО РАКА ПИЩЕВОДА

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для лечения местнораспространенного нерезектабельного рака пищевода.

В России рак пищевода находится на 14-м месте в структуре заболеваемости злокачественными новообразованиями и на 7-м месте в структуре смертности. В 2013 г. в нашей стране рак пищевода зарегистрирован у 7403 больных, умерло 6532 пациента, соотношение заболеваемости и смертности 0,88. Пятилетняя выживаемость составляет около 10% в не зависимости от гистологического типа и степени дифференцировки опухоли. Одной из причин низкой пятилетней выживаемости больных данной нозологией является поздняя диагностика рака пищевода. В большинстве случаев (68%) рак пищевода диагностируется в III-IV стадиях (см. Давыдов М.И., Аксель Е.М. Статистика злокачественных новообразований в России и странах СНГ в 2013 г. М., 2015).

Выбор тактики лечения больных раком пищевода зависит от локализации и уровня расположения опухоли в пищеводе, гистологической формы опухоли, стадии злокачественного процесса (см. Давыдов М.И., Стилиди И.С. Рак пищевода. М.: Практическая медицина, 2007). В настоящее время для лечения рака пищевода применяют хирургический, лучевой, химиотерапевтический и сочетанные методы лечения.

Хирургическое лечение является основным, его осуществляют при локальном и локорегионарном распространении, а также в паллиативных целях. В изолированном варианте оперативное пособие малоэффективно, поскольку к моменту постановки диагноза более половины больных раком пищевода имеют нерезектабельный или метастатический процесс (см. Скворцов М.Б. Рак пищевода: хирургическое лечение // Сибирский онкологический журнал. - 2011. - №4. - С. 21-30).

Лучевая терапия и химиотерапия в самостоятельном варианте носят паллиативный характер (см. Давыдов М.И., Стилиди И.С., Тер-Ованесов М.Д., Полоцкий Б.Е. Рак пищевода: современные подходы к диагностике и лечению // Русский медицинский журнал. - 2006. - №14. - С. 1006-1015). Химиотерапевтическое лечение больным раком пищевода кроме того применяют с целью повышения эффективности лучевой терапии, в неоадъювантном и адъювантном режимах, однако опухоли пищевода обладают умеренной чувствительностью к цитостатикам. Кроме того, проведение химиотерапии зачастую ограничено тяжелым состоянием больных (см. Моисеенко В.М. Возможности современного лекарственного лечения больных раком пищевода // Практическая медицина. - 2003. - Т. 4 - №2. - С. 83-90).

В отношении таргетной терапии рака пищевода скромный эффект достигнут на фоне применения бевацузумаба в комбинации с капецитабином (см. Гарин A.M., Базин И.С. Лекарственная терапия опухолей желудочно-кишечного тракта // Эффективная фармакотерапия. - 2015. - №2. - С. 16-23). Мультимодальный подход, включающий неоадъювантное химиолучевое воздействие с последующей операцией, на сегодняшний день является наиболее эффективным в лечении рака пищевода (см. Деньгина Н.В. Современные терапевтические возможности при раке пищевода // Практическая онкология. - 2012. - Т. 13. - №4. С. - 276-288). При его применении отмечают увеличение радикально прооперированных больных, некоторое улучшение показателей трехлетней выживаемости в сравнении с только хирургическим методом (см. Urschel J.D., Vasan Н. A meta-analisis of randomized controlled trials that compared neoadjuvant chemoradiation and surgery alone for resectable esophageal cancer // Am. J. Surg. - 2003. - Vol. 185. - №3. - P. 538-543.; Van Hagen P. Hulshof M.C., van Lanschot J.J. et al. Preoperative chemoradiotherapy for esophageal or junctional cancer // N. Engl. J. Med. - 2012. - Vol. 366. - №22. - P. 2074-2084.).

Тем не менее у больных раком пищевода имеют место стабильно низкие цифры отдаленной выживаемости как в развитых, так и в развивающихся странах - 17% (см. Siegel R., Ward Е., Brawley О., Jenal А. Cancer statistics, 2011: the impact of eliminating socioeconomic and racial disparities on premature cancer deaths // СA Cancer J. Clin. - 2011. - Vol. 61. - №4. - P. 212-236). Летальный исход обусловлен локальными рецидивами и метастазированием: в течение первого года с момента установления диагноза погибает до 65% больных, что ставит рак пищевода на первое место по одногодичной летальности (см. Скворцов М.Б. Рак пищевода: хирургическое лечение // Сибирский онкологический журнал. - 2011. - №4. - С. 21-30). Таким образом, агрессивное течение опухолей пищевода, неудовлетворительные результаты лечения диктуют необходимость поиска новых подходов к лечению данной тяжелой онкопатологии.

Из патентных источников известен «Способ лечения рака пищевода» (см. патент RU 2474420 С1, опубл. 10.02.2013, Бюл. №4), в котором с целью повышения эффективности проводимого лечения, уменьшения частоты возникновения осложнений и их тяжести, снижения общей токсичности, вызванной системным применением цитостатиков, в частности 5-фторурацилом, сохранением качества жизни пациентов, внутривенно вводят 5-фторурацил 2 раза в неделю по 300 мг/м² на одно введение с интервалом в 2-3 дня и одновременно перорально вводят «Колетекс-гель-ДНК-Л» 3 раза в день по 10-15 мл. В остальные дни недели перорально вводят гидрогелевый материал «Салфетка гидрогелевая «Колетекс-5-фтур» в объеме 5 мл один раз в день, причем за 10-15 мин до приема гелевого материала назначают дополнительный прием «Колетекс-гель-ДНК-Л» в объеме 10-15 мл. Продолжительность курса лечения 4 недели.

Также известен «Способ лечения местнораспространенного неоперабельного рака пищевода» (см. патент RU 2468836 С1, опубл. 10.12.2012, Бюл. №34), включающий предварительную аргоноплазменную коагуляцию опухоли, внутрипросветную брахитерапию высокой мощности в 1-й, 8-й и 15-й дни курса с разовой очаговой дозой 7 Гр синхронно с внутривенными введениями препаратов таксанового ряда и карбоплатина, последующее дистанционное облучение опухоли, РОД 1,8 Гр, 5 фракций/нед, СОД 40-45 Гр, отличающийся тем, что дистанционное облучение опухоли сопровождают применением производных фторпиримидинов в зависимости от степени дисфагии в следующих дозах: при дисфагии 0-1 степени - пероральным приемом капецитабина 600 мг/м² в дни лучевого лечения, при дисфагии 2-3 степени - внутривенными инфузиями 5-фторурацила 1000 мг/м² еженедельно. Способ обеспечивает оптимизацию циторедуктивного взаимодействия компонентов химиолучевой терапии и более полную реализацию ответа опухоли при снижении тяжелых общих и местных реакций.

Однако не всем больным показана лучевая и химиотерапия. Противопоказаниями являются, помимо распространенности процесса, соматическое состояние больных и сопутствующая патология.

Авторами Ю.А. Гриневич, В.Л. Ганул и др. в статье «Результаты применения полипептидов тимуса при комбинированном лечении больных раком пищевода или раком желудка с переходом на пищевод» (см. журнал «Онкология», Т. 3, №4, 2001 г., стр. 278-282) приводятся данные об изучении клинической эффективности применения полипептидов тимуса (ПТ) при комбинированном лечении больных раком пищевода или раком желудка с переходом на пищевод. В частности, включение в схему активной неспецифической иммунотерапии ПТ улучшило показатели 5-летней выживаемости. Также авторами установлено, что адаптивная иммунотерапия в виде трансплантации аутологичного костного мозга, преинкубированного с ПТ in vitro, не влияет на эффективность комбинированного лечения больных раком пищевода или раком желудка с переходом на пищевод.

Из литературных источников известно применение иммунокорректора - Трансфер фактора™ в виде монотерапии и в составе комплексного лечения рака пищевода (см. Пинаев С.К., Пинаева О.Г., Чижов А.Я. Первый опыт терапии рака пищевода с использованием иммунокорректора Трансфер Фактор™ // Технологии живых систем. - 2014. - №4, - С. 59-62.). Авторы приводят два первых наблюдения использования препаратов ТФ при раке пищевода. В одном наблюдении у больного раком нижней трети пищевода T1-2N0M0 в связи с отказом от специального лечения вследствие наличия тяжелой сопутствующей патологии проводилась монотерапия ТФ. Через два месяца лечения достигнута полная регрессия опухоли, подтвержденная фибро-эзофагогастродуоденоскопией (ФЭГДС). В последующем через 4 месяца развилось местное прогрессирование опухоли без отдаленного метастазирования. Продолжительность жизни составила 26 месяцев с момента установления диагноза. Во втором наблюдении больному раком нижней трети пищевода Т 1N0M0 терапия ТФ проводилась на фоне дистанционной лучевой терапии. Через два месяца также достигнута полная регрессия опухоли, подтвержденная ФЭГДС. В последующем у пациента по данным динамического наблюдением с регулярным контролем, включающим ФЭГДС, сохранялась стойкая ремиссия на протяжении двух лет (в августе 2012 года в возрасте 76 лет пациент погиб от инфаркта миокарда). Таким образом, отмечен выраженный лечебный эффект ТФ при раке пищевода, сопоставимый с химиолучевой терапией. При этом сочетание иммунотерапии препаратами ТФ и лучевой терапии обладает эффектом синергии и позволяет добиться полной стойкой регрессии опухоли пищевода. Высказано предложение при достижении регрессии «инкурабельного» рака пищевода на фоне препаратов ТФ вновь возвращаться к вопросу о возможности проведения специального лечения. Также высказаны предложения по расширению подобных исследований с целью получения репрезентативных данных о месте и значении препаратов ТФ в программах комплексного лечения рака пищевода.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является разработка способа лечения больных местнораспространенным нерезектабельным раком пищевода, позволяющего увеличить продолжительность и улучшить качество жизни.

Технический результат достигается тем, что в условиях процедурного кабинета после обработки кожи передней грудной стенки раствором антисептика вводят внутрикожно по 0,3 мл аутологичной дендритно-клеточной вакцины по две инъекции с каждой стороны грудины примерно между III и IV, IV и V ребрами таким образом, что суммарно достигают 5.000.000 дендритных клеток, через 2 недели после введения первой дендритно-клеточной вакцины вводят вторую дендритно-клеточную вакцину в той же дозировке 5.000.000 клеток, через 2 недели после введения второй вакцины вводят третью по счету дендритно-клеточную вакцину в суммарной дозировке 10.000.000 дендритных клеток, через 2 недели после третьего введения дендритно-клеточной вакцины вводят четвертую по счету дендритно-клеточную вакцину в суммарной дозировке 10.000.000 дендритных клеток таким образом, что за весь курс вакцинотерапии больные получают 30.000.000 клеток.

Способ осуществляется следующим образом.

Периферическую венозную кровь забирали в стерильные 50-мл пробирки, содержащие антикоагулянт (K₃- ЭДТА), и разбавляли равным объемом питательной среды RPMI-1640 (Панэко, Россия). Затем 10 мл полученной суспензии наслаивали на 3 мл «Ficoll-Paque Premium» и центрифугировали в 15 мл стерильных пробирках при 1500 об/мин в течение 40 мин при комнатной температуре (см. Boyum A. Separation of leukocytes from blood and bone marrow // Scand. J. Clin. Lab. Investig. - 1968. - Vol. 21 - Suppl. 97. p. 1-9).

После центрифугирования на дне пробирки оставались эритроциты и гранулоциты, а мононуклеарные клетки (МНК) - на границе раздела фаз. Прозрачный слой среды, расположенный непосредственно над опалесцирующим слоем, содержащим МНК, удаляли, а МНК собирали по всей площади сечения пробирки, добиваясь очистки от других клеток.

Взвесь МНК вносили в стерильные 15 мл центрифужные пробирки, разбавляли 4-кратным избытком неполной питательной среды RPMI-1640 и тщательно ресуспендировали. Отмывали МНК в неполной питательной среде RPMI-1640 двукратным центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин.

Затем проводили подсчет и оценку жизнеспособности МНК с помощью камеры Горяева и 0,4% трипанового синего, получали 3,5-7×10⁶ и более клеток с жизнеспособностью не менее 98%.

Для получения ДК из МНК периферической крови последние помещали в неполную питательную среду RPMI-1640 (посевная доза 1,5×10⁶кл/мл) и 2 плоскодонных культуральных флакона 75 см² с вентилируемыми пробками для выращивания адгезионных культур. Инкубировали в условиях контролируемого 5% СО₂ и 98% влажности при 37°С в течение 2-х часов.

Затем среду RPMI-1640, содержащую не прикрепившиеся клетки (преимущественно лимфоциты), удаляли и повторно промывали оставшиеся на подложке клетки 4 мл среды RPMI-1640.

В культуральные флаконы добавляли 15 мл среды CellGroDC, ростовые факторы и факторы дифференцировки: GM-CSF (72 нг/мл) и IL-4 (20 нг/мл).

Культуральные флаконы инкубировали в СО₂-инкубаторе.

На 3-й и 5-й день культивирования добавляли свежую порцию GM-CSF (72 нг/мл) и IL-4 (20 нг/мл).

На 7-й день культивирования в каждый флакон добавляли ростовые факторы и факторы дифференцировки GM-CSF (72 нг/мл), IL-4 (20-45 нг/мл) и TNF-α (20 нг/мл), а также клеточный лизат культуры клеток HeLa из расчета 3 клетки культуры HeLa на 1 дендритную клетку.

Для приготовления лизата, содержащего антигены культуры HeLa, клетки культивировали во флаконах в полной питательной среде DMEM/F12 с 10% телячьей эмбриональной сыворотки с добавлением глутамина и гентамицина (50 мкг/мл) в условиях контролируемого 5% СО₂ и 98% влажности при 37°С.

После достижения конфлюэнтного монослоя производили пересев клеток и дальнейшее культивирование в течение недели.

После получения достаточного количества клеточной массы из флаконов отбирали культуральную среду, снимали клетки культуры HeLa с подложки с помощью раствора трипсин-Версена и ресуспендировали до получения однородной клеточной суспензии.

Проводили подсчет клеток в камере Горяева и определение процента жизнеспособных клеток по окрашиванию с 0,4% трипановым синим.

Для получения клеточного лизата выполняли шесть последовательных циклов моментального замораживания суспензии клеток в жидком азоте и оттаивания до комнатной температуры в фосфатно-солевом буфере без криопротектора (качество лизиса клеток контролировали с помощью 0,4% трипанового синего).

В дальнейшем клеточный детрит осаждали центрифугированием (10 мин, 3000 об/мин, 20°С) и фильтровали супернатант через стерильный фильтр (диаметр пор 0,2 мкм).

Опухолевый лизат, полученный из культуры HeLa, хранили при -20°С до использования.

Спустя 48 часов после добавления лизата культуры HeLa отбирали культуральную среду, центрифугировали, удаляли надосадочную жидкость. В каждый флакон добавляли 3 мл раствора трипсин-Версена и инкубировали в СО₂-инкубаторе в течение 5 мин.

Затем снимали клетки скрепером, осаждали центрифугированием (10 мин, 1000 об/мин, 20°С), удаляли супернатант. Объединяли клетки из двух флаконов с полученными клетками из надосадочной жидкости путем их ресуспендирования в неполной среде RPMI 1640 (конечный объем 10 мл).

Отбирали аликвоту клеточной суспензии, равную 0,1 мл, и проводили подсчет клеток в камере Горяева и определение процента жизнеспособных клеток с помощью окрашивания 0,4% трипановым синим.

Затем отбирали 200000 клеток для определения иммунофенотипа зрелых ДК на проточном цитометре, которое проводили путем выделения на графиках популяции МНК-ДК и очистки ее от дебриса и лимфоцитов с помощью меток CD45, CD3, CD4, CD8, CD16+56, CD19.

Оценка стадии созревания мононуклеаров производилась с помощью антител к CD1a, CD11c, CD14, CD33, CD38, CD83, CD86, HLA-DR.

Необходимое количество клеток дендритной вакцины осаждали центрифугированием, отмывали в 10 мл 0,9% раствора хлорида натрия, содержащего 10% альбумина человека, производили подсчет и оценку жизнеспособности с помощью автоматического счетчика клеток «Countess» и 0,4% трипанового синего.

При соблюдении вышеуказанных условий получали клетки с жизнеспособностью не менее 98% и иммунофенотипом зрелых ДК (CD14-, CD1alow, CD83high, HLA-DRhigh, CD80high, CD86high, CCR7high).

Для введения ДК вакцины 1/2 клеток (от 5 до 10×10⁶), ресуспендированных в 1,5 мл 0,9% изотонического раствора NaCl, содержащего 10% альбумина человека, переносили в ампулу и доставляли в клиническое отделение для введения больному.

Другую 1/2 ДК криоконсервировали и хранили в жидком азоте до следующей вакцинации.

Лечение начинают с введения первой дендритно-клеточной вакцины в условиях процедурного кабинета абдоминального отделения, после обработки кожи передней грудной стенки раствором антисептика вводят внутрикожно по 0,3 мл аутологичной дендритно-клеточной вакцины по две инъекции с каждой стороны грудины примерно между III и IV, IV и V ребрами таким образом, что суммарно достигают 5.000.000 дендритных клеток.

Визуально наблюдается реакция в виде образования папул, незначительной гиперемии в месте введения препарата. Отмечается субфебрильная температура тела в течение двух суток после введения вакцины. Аллергических реакций, как и других нежелательных побочных явлений, не зафиксировано.

Через 2 недели после введения первой дендритно-клеточной вакцины вводят вторую дендритно-клеточную вакцину по той же схеме, в той же дозировке 5.000.000 клеток.

Всего за два сеанса вакцинотерапии больные получают 10.000.000 клеток.

Через 2 недели после введения второй вакцины вводят третью по счету дендритно-клеточную вакцину по той же схеме в суммарной дозировке 10.000.000 дендритных клеток. Визуально наблюдается реакция в виде образования папул, незначительной гиперемии в месте введения препарата. Отмечается субфебрильная температура тела в течение двух суток после введения вакцины.

Аллергических реакций, как и других нежелательных побочных явлений, не зафиксировано.

Через 2 недели после третьего введения дендритно-клеточной вакцины вводят четвертую по счету дендритно-клеточную вакцину в суммарной дозировке 10.000.000 дендритных клеток. Всего за 3 и 4 сеансы вакцинотерапии больные получают 20.000.000 клеток.

За весь курс вакцинотерапии больные получили 30.000.000 клеток.

Для лучшего понимания сущности заявленного изобретения, а также для подтверждения его соответствия условию "промышленная применимость" приводим пример конкретной реализации способа.

Пример №1. Больная П., 1937 г.р.

15.07.2015 г. обратилась в поликлинику НИОИ, где в ходе обследования был выставлен диагноз: «Рак с/3 пищевода St IV (T3N1M1) (LYM), кл. гр. 2. Дисфагия III ст.». Гистологический анализ (ГА) - плоскоклеточный ороговевающий рак. Сопутствующая патология: ИБС, гипертоническая болезнь 2 ст., риск высокий.

СКРТ ОГК (органов грудной клетки), БП (брюшной полости) и ОМТ (органов малого таза) от 15.07.2015 г.: инфильтративный рак средне- и нижнегрудного отдела пищевода на протяжении 10 см суживает его просвет. Л/у заднего средостения до 2,5 см.

ФЭС от 15.07.2015 г. Устье пищевода на 17 см от резцов. На 29 см определяется циркулярная мелкобугристая инфильтрация слизистой. На 39 см просвет пищевода значительно сужен, с трудом проходим для эндоскопа за счет изъязвления с приподнятыми краями. Кардия на 41 см, эластичная. Привратник, ДПК без особенностей.

16.07.2015 г. выполнено эндоскопическое стентирование зоны опухолевого стеноза. Перенесла удовлетворительно.

17.07.2015 г. после обработки кожи передней грудной стенки раствором антисептика ввели внутрикожно по 0,3 мл аутологичной дендритно-клеточной вакцины примерно между III и IV, IV и V ребрами по две инъекции с каждой стороны грудины таким образом, что суммарно составляет 5.000.000 дендритных клеток.

31.07.2015 г. вводят вторую дендритно-клеточную вакцину в той же дозировке 5.000.000 клеток.

14.08.2015 г. вводят третью по счету дендритно-клеточную вакцину в суммарной дозировке 10.000.000 дендритных клеток.

28.08.2015 г. вводят четвертую по счету дендритно-клеточную вакцину в суммарной дозировке 10.000.000 дендритных клеток.

Таким образом, за весь курс вакцинотерапии больная получила 30.000.000 клеток.

Введение вакцин больная переносила удовлетворительно. Местных реакций не отмечалось. Через 2-3 дня от введения отмечалось повышение температуры тела до 37,1-37,2°С. Температура купировалась самостоятельно.

СКРТ ОГК, БП и ОМТ от 31.08.2015 г.: опухоль с/3 пищевода на протяжении 7,5 см, состояние после стентирования. Внутригрудные лимфоузлы не увеличены.

На сегодняшний день (спустя 6 месяцев) больная чувствует себя удовлетворительно, питается самостоятельно, отмечает нормальное прохождение твердой пищи по пищеводу.

Данным способ было пролечено 5 больных. Способ позволяет увеличить продолжительность и улучшить качество жизни.

Изобретение является промышленно применимым, может быть многократно воспроизведено в лечебных учреждениях онкологического профиля, осуществляющих высокотехнологичную помощь.