Способ прогнозирования направленности патологического процесса при раке головки поджелудочной железы

Изобретение относится к медицине, а именно к биологическим исследованиям в онкологии, и может быть использовано для определения дальнейшего развития (генерализации) злокачественного процесса после оперативного лечения рака головки поджелудочной железы.

В структуре смертности РПЖ занимает четвертое место в мире с пятилетней выживаемостью около 5%. При этом пациенты, оперировавшиеся по поводу операбельных форм заболевания, имеют 20% 5-летнюю выживаемость с медианой от 12 до 20 месяцев. У пациентов с местнораспространенными формами заболевания без отдаленных метастазов медиана выживаемости составляет от 6 до 10 месяцев (см. Никулин М.П., Сельчук В.Ю., Чистяков С.С., Ибрагимов Т.Ф., Титова Г.В. Рак поджелудочной железы. Независимое издание для практикующих врачей. Источник www.rmj.ru (1726, публикация 22.03.14)).

В России заболеваемость раком поджелудочной железы составляет в среднем 8-9 человек на 100 тысяч населения. Рак поджелудочной железы наиболее часто регистрируют в возрасте 60-80 лет. Мужчины страдают в 1,5 раза чаще, чем женщины. Рак поджелудочной железы у 80% больных локализуется в головке органа, реже - в теле и хвосте железы, еще реже наблюдают мультицентрическую локализацию опухоли, а также диффузный рак, поражающий всю поджелудочную железу. Повышенная частота опухолей поджелудочной железы в головке органа связана с тем, что именно там потенциально высок контакт с канцерогенами, содержащимися в желчи или дуоденальном содержимом (см. Никулин М.П., Сельчук В.Ю., Чистяков С.С., Ибрагимов Т.Ф., Титова Г.В. Рак поджелудочной железы. Независимое издание для практикующих врачей. Источник www.rmj.ru (1726, публикация 22.03.14)).

Воздействие повреждающих факторов формирует разветвленную сеть взаимозависимых и взаимопотенцирующих изменений в пораженном органе. Модификация и/или деструкция мембран и цитоскелета клеток под воздействием протеолиза, развитие иммунопатологических, воспалительных, гидролитических, окислительных процессов приводят к массированному разрушению еще неповрежденных клеток поджелудочной железы, выходу интерстиций их содержимого, включая многочисленные протеолитические ферменты.

Названные факторы дополнительно потенцируют воспалительные, иммунопатологические, окислительные и протеолитические реакции. Это, в свою очередь, делает процесс поражения поджелудочной железы тотальным и нарастающим по степени, т.е. возможно и генерализованное распространение злокачественного процесса (Кульчиев А.А., Сланов А.В., Морозов А.А., Елоев В.А., Харахаш А.Я. Хирургические заболевания. Для послевузовской профессиональной подготовки Специальность №0401226 «Хирургия». Учебное пособие. Владикавказ 2009. 558 с.).

Изменения в системе протеолиза в пораженном органе отражаются в показателях активности не только ферментов системы общего и специфического протеолиза, но и белков, ограничивающих протеолитические реакции, - универсальных ингибиторов, в частности альфа-2-макроглобулина (α₂М), поскольку этот высокомолекулярный ингибитор является белком острой фазы воспаления и контролирует активность практически всех известных протеиназ.

Существуют данные о способности злокачественных опухолей синтезировать и выделять в окружающую среду различные белки, в том числе собственный α₂М, защищающий опухоль от атак иммунной системы (Зорина В.Н., Козлов И.Г., Третьякова Т.В. и соавт. Некоторые реактанты острой фазы при различных типах пролиферативных заболеваний придатков матки. Клиническая лабораторная диагностика. 2009; (10): 16-19).

В связи с этим становится очевидной целесообразность исследования острофазных белков крови, а именно α₂М, поскольку закономерными признаками опухолевой прогрессии являются дестабилизация биологических мембран, инициированная протеолизом, нарушение межклеточного взаимодействия и контактного ингибирования малигнизированных клеток. В процессе формирования синдрома системного воспалительного ответа организм теряет способность его регулировать. Причины этого пока не выяснены. Выделяемый опухолью модифицированный α₂М с искаженными свойствами не выполняет своих функций и не может препятствовать протеолитической агрессии.

Известен способ прогнозирования безрецидивной выживаемости путем исследования матричной металлопротеиназы (ММП-9) (см. Serum matrikx metalloproteinase-9 in head and neck squamous cell carcinoma is a prognostic marker. Ruokolainen Henni, Paavo, Turpreenniemi-Hujanen Taina. Int. J. Cancer. 2005; 116 (3): 422-427). Авторы определяли ММП-9 в сыворотке крови больных плоскоклеточным раком головы и шеи. Высокий уровень сывороточной ММП-9 связывали с низкой безрецидивной выживаемостью (до 40% больных) и, наоборот, низкий уровень сывороточной ММП-9 связывали с хорошей выживаемостью (до 69% больных). Считают, что уровень сывороточной ММП-9 перед лечением может служить прогностическим фактором. Однако этот способ не использовался при злокачественных опухолях головки поджелудочной железы и не является для них специфичным.

Известен способ определения белка S-100B в сыворотке крови больных меланомой (см. Significace of serum S-100B in melanoma patients before and after sentinel node bipsy. Smit Leonie H.M., Nieweg Omgo E., Korse Catharina M., Bonfrer Joahnnes M.G., Kroon Bin B.R. Surg. Oncol. 2005; 90 (2): 66-70). Однако такой анализ не проводился при злокачественных новообразованиях головки поджелудочной железы, что не дает возможности прогнозировать генерализацию процесса при этой патологии. По мнению самих авторов, использование теста для раннего выявления рецидива меланомы дает сомнительные результаты. Метод пригоден только для выявления уже развившегося рецидива меланомы.

Известен способ определения в сыворотке крови тимидинкиназы у больных с глиальными опухолями ЦНС (Neuron specific enolase [NSE] and thymidine kinase [TK] as markhers in biological fluids of brain tineos patients. Boiardi A., Munari L., Silvani A., Solero C.L., Bombardieri E. Ital. Y / Neurol. Sci. 1990; 11 (4): 359-366). Сущность метода заключается в том, что определяют сывороточную тимидинкиназу и используют в качестве маркера рецидива заболевания после хирургического лечения больных с глиальными опухолями. Метод основан на флуориметрическом определении тимина в биологическом материале путем окисления 12,5% бромной водой и последующей нейтрализации щелочным раствором о-аминобензальдегида. Однако этот метод не применялся для прогнозирования генерализации злокачественного процесса при опухолях поджелудочной железы и, по мнению самих авторов, специфичность метода для злокачественных опухолей составляет 36%, что, с нашей точки зрения, недостаточно для использования данного показателя в качестве маркера генерализации процесса. Кроме того, в ходе определения образуется несколько промежуточных продуктов обмена (глюкоза, ацетомолочная кислота и ряд других), которые имеют близкую флуоресценцию и мешают определению, что снижает точность анализа.

Известен способ определения (см. Патент RU №2433410. Бюллетень №31 от 10.11.2011), разработанный в РНИОИ и который мы выбрали в качестве прототипа. Сущность метода заключается в том, что в ликворе больных в 1-2 сутки после удаления злокачественной опухоли головного мозга определяют активность сериновой протеиназы - плазмина и на основании полученных результатов прогнозируют развитие продолженного роста опухоли в течение 4-5 месяцев после операции. Метод хорошо зарекомендовал себя и используется в отделении опухолей центральной нервной системы РНИОИ по настоящее время. Однако данный метод неприменим для прогноза направленности патологического процесса при раке поджелудочной железы, поскольку при развитии в головке поджелудочной железы злокачественной опухоли вызывает, как правило, механическую желтуху, что влияет на белковосинтетическую функцию печени - основного органа синтеза плазминогена и его активаторов. Наличие злокачественной опухоли в ткани поджелудочной железы существенно влияет на содержание этих белков в плазме крови, поэтому данные показатели не могут быть использованы в качестве прогностических.

Перечисленные методы не применялись при обследовании больных с опухолями головки поджелудочной железы и не могут быть использованы для прогнозирования отдаленных последствий, в частности генерализации злокачественного процесса в ближайшие месяцы после оперативного лечения.

Техническим результатом изобретения являются прогноз направленности патологического процесса при раке головки поджелудочной железы, раннее выявление сроков генерализации злокачественного процесса.

Поставленная цель достигается тем, что в цитратной плазме крови больного на 15-е сутки после панкреатодуоденальной резекции определяют активность универсального ингибитора α₂-макроглобулина, при значении этого показателя от 10,57 ИЕ/мл до 12,37 ИЕ/мл прогнозируют развитие генерализации злокачественного процесса в течение 2,5-6 месяцев после операции, а при его значении от 5,18 ИЕ/мл до 5,98 ИЕ/мл прогнозируют течение послеоперационного периода без генерализации процесса в течение 12 месяцев.

Изобретение «Способ прогнозирования направленности патологического процесса у больных злокачественными опухолями головки поджелудочной железы» является новым, так как оно неизвестно из уровня достижений медицины в области прогнозирования развития генерализации злокачественного процесса.

Новизна изобретения заключается в том, что в плазме крови больного, полученной на 15-17 сутки после панкреатодуоденальной резекции, определяют активность α₂-макроглобулина и при ее повышении свыше 10 ИЕ/мл (ингибиторных единиц на 1 мл плазмы крови) прогнозируют генерализацию злокачественного процесса в течение 2,5-6 месяцев после оперативного вмешательства. Активность α₂-макроглобулина ниже 6 ИЕ/мл позволяет прогнозировать течение послеоперационного периода без развития генерализации злокачественного процесса в течение 12 месяцев. Такой способ прогнозирования является новым и дает возможность своевременно принять адекватные меры для разработки патогенетической терапии с целью предотвращения развития генерализации злокачественного процесса.

В открытых источниках информации России, стран СНГ, ближнего и дальнего зарубежья указаний на аналогичный способ прогнозирования развития генерализации злокачественного процесса после панкреатодуоденальной резекции нами не обнаружено.

Изобретение является промышленно применимым, так как может быть воспроизведено и многократно повторено в любой клинической лаборатории лечебных учреждений системы здравоохранения.

Способ осуществляется следующим образом.

На 15-17 сутки после панкреатодуоденальной резекции и лечения (перед выпиской) у больного производится взятие крови в стандартную пластиковую пробирку, содержащую цитрат натрия, в соотношении 9:1. Цитратную кровь центрифугируют 15 мин при 3000 об/мин, отбирают плазму и 50 микролитров используют для определения α₂-макроглобулина по его трипсинсвязывающей способности (см. Пасхина Т.С. Современные методы в биохимии. М.: Наука. 1987 г.).

Определение основано на способности α₂-макроглобулина блокировать протеолитическую активность протеиназ, в данном случае - трипсина, сохраняя способность ферментов к расщеплению низкомолекулярных синтетических субстратов. Реагирование с молекулой фермента осуществляется путем конформационных изменений в молекуле ингибитора, при этом его молекула образует карман, в котором располагается активный центр, туда же попадает центр фермента, обладающий протеолитической активностью. Реакция образования ковалентной связи между ферментом и ингибитором осуществляется уже в кармане ингибитора. Центр эстеразной активности фермента остается снаружи. После окончания реакции фермент теряет протеолитическую и сохраняет эстеразную активность, при этом он становится недоступным для действия других ферментов и ингибиторов. Последнее его свойство используется при определении количества α₂М в исследуемом образце. В качестве связываемого фермента применяется трипсин.

Ход определения.

В кювету спектрофотометра, содержащую 1,75 мл 0,05 М трис-HCl буфера, рН 8,0, вносят 100 мкл разведенной в 10 раз плазмы крови и 50 мкл 0,1% раствора трипсина в 0,001 н. HCl, содержащей 10 ммоль CaCl₂.

После инкубации при 25°C добавляют 0,03% раствор соевого ингибитора трипсина в 0,05 М трис-HCl буфере рН 8,0 и после следующей 5-минутной инкубации при 25°C в реакционную среду вносят 1 мл раствора низкомолекулярного синтетического субстрата - этилового эфира N-α-бензоил-L-аргинина.

После этого регистрируют на спектрофотометре реакцию гидролиза низкомолекулярного синтетического субстрата (этилового эфира N-α-бензоил-L-аргинина) со связанным с α₂М трипсином при длине волны 253 нанометра в течение 10 минут против контрольной пробы, содержащей только реактивы (2 мл 0,05 М трис-HCl буфера, рН 8,0+1 мл раствора низкомолекулярного синтетического субстрата этилового эфира N-α-бензоил-L-аргинина).

Результаты сравниваются с данными исследования донорской плазмы крови, полученной со станции переливания крови. На выполнение метода вместе с расчетом требуется 30-40 минут.

В качестве примера приводим выписки из историй болезни.

Пример №1. Больная У. Дата рождения 29.05.1946. Поступила в торакоабдоминальное отделение 13.01.2014 г. Жалобы при поступлении на общую слабость, снижение массы тела на 15 кг, наличие холангиостомы.

02.10.2013 проведена чрескожная чреспеченочночная холангиостомия, аппаратный плазмаферез, 05.12.2013 - курс XT: Гемзар 1000 мг в 1 и 8 дни.

Объективный (локальный) статус - лимфоузлы, доступные пальпации, не увеличены, симптом Щёткина отрицательный, живот мягкий, безболезненный. Предварительный диагноз при поступлении: Рак головки поджелудочной железы, кл. гр. 2

УЗИ: брюшная полость, 09.01.2014, заключение: Образование на головке поджелудочной железы, состояние после ЧЧХС и холецистэктомии. Дилатация Вирсунгова протока. Печень без очаговых изменений. Нефроптоз 2 степени справа.

КТ: брюшная полость, 25.09.2013, заключение: КТ картина соответствует гиповаскулярному образованию головки поджелудочной железы. Дилатация желчных протоков.

Верификация процесса (гистологический анализ): №1921-923/14 G2: протоковая аденокарцинома с нейроэндокринноклеточным компонентом, с инвазией стенки кишки. Проведенное лечение: операция 14.01.2014 - панкреатодуоденальная резекция.

Заключительный диагноз: злокачественное заболевание головки поджелудочной железы, St II, T₃N₀M₀, кл. гр. 3.

29.01.2015 активность α₂-макроглобулина плазмы составила 12,04 ИЕ/мл.

07.02.2014 г. больная выписана из стационара. Больная выписалась в удовлетворительном состоянии. На контрольный осмотр через 1 месяц не явилась. Смерть наступила от генерализации процесса через 5 месяцев после выписки.

Пример №2. Больной К. Дата рождения 27.03.1957. 08.04.2014 г. поступил в торакоабдоминальное отделение. Жалобы при поступлении: на наличие холангиостомы в правом подреберье, доставляющей неудобства, снижение массы тела.

Объективный (локальный) статус - лимфоузлы, доступные пальпации, не увеличены, симптом Щёткина отрицательный, живот при пальпации мягкий, безболезненный.

MPT от 07.03.2014: опухоль головки поджелудочной железы с инвазией в окружающую клетчатку.

Верификация процесса (гистологический анализ): умеренно дифференцированная протоковая аденокарцинома с инфильтративным ростом, фиброзом стромы, выраженным некрозом.

УЗИ от 07.03.2014: образование в проекции головки поджелудочной железы.

ФДС от 07.03.2014 - выраженный эрозивный гастрит, кандидоз пищевода.

09.04.2014 выполнена операция - панкреатодуоденальная резекция и наложение обходных анастомозов.

Заключительный диагноз. Рак поджелудочной железы T₄N₁M₀, st III, кл. гр. 2 (с-25).

24.04.2015 г. активность α₂-макроглобулин плазмы крови составила 5,32 ИЕ/мл.

В послеоперационном периоде выписался без осложнений, в удовлетворительном состоянии.

Контрольные осмотры: 2.06.14; 22.07.14; 2.09.14; 28.10.14; 26.01.15; 30.03.15.

В течение 12 месяцев ухудшения состояния не зафиксировано.

Авторами были обследованы 62 больных раком головки поджелудочной железы, находившихся на лечении в отделении абдоминальной онкологии №2 РНИОИ и подвергавшихся поэтапному лечению по поводу рака головки поджелудочной железы.

На 15 сутки после панкреатодуоденальной резекции у больных взята кровь из локтевой вены с соблюдением общепринятых правил, в плазме крови определена активность универсального ингибитора α₂М. Результаты исследования плазмы крови у 7 больных раком головки поджелудочной железы на 15 сутки после ПДР показали активность α₂М в пределах от 10,13 ИЕ/мл до 13,63 ИЕ/мл, а у больных без осложнений - от 4,095 ИЕ/мл до 5,951 ИЕ/мл, что не имело достоверных отличий от нормы. Установлено, что у 19 больных (30,7%) наблюдались различные осложнения, из них у 7 человек (11,3% от общего количества больных) в послегоспитальный период наблюдалась генерализация злокачественного процесса в сроки от 2,5 до 6 месяцев после панкреатодуоденальной резекции (ПДР).

Технико-экономическая эффективность способа заключается в его высокой специфичности, возможности объективной оценки индивидуальной реакции на развитие рака головки поджелудочной железы, удаление опухоли, быстрого проведения анализа в день взятия крови, что позволит своевременно изменить схемы лечения.

Специфичность способа для прогнозирования течения послегоспитального периода без развития генерализации злокачественного процесса - 88,7%, для прогнозирования дальнейшего развития злокачественного заболевания в организме после панкреатодуоденальной резекции в послегоспитальный период - 93,6%.