Результат интеллектуальной деятельности: Способ получения пигментного комплекса из биомассы одноклеточных водорослей рода Chlorella

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способам извлечения комплекса пигментов (хлорофиллов и каротиноидов) из биомассы одноклеточных водорослей рода Chlorella. Извлекаемый комплекс пигментов может применяться в качестве пищевых добавок для изготовления пищевых продуктов, кормовых добавок, используемых в сельском хозяйстве, а также в составе косметических средств в качестве биологически активной добавки и натурального красителя.

Клеточная оболочка микроводорослей рода Chlorella состоит из целлюлозоподобных углеводов и белков. Устойчивая к химическим воздействиям клеточная оболочка является основным препятствием для извлечения из клетки ценных биологически активных компонентов. Обычно для переработки водоросли рода Chlorella используют комплексные методы, включающие кипячение или замораживание биомассы с целью разрушения клеток и ферментативный гидролиз компонентов биомассы, позволяющий перевести биологически активные вещества в водорастворимое состояние.

Известен способ получения комплекса биологически активных веществ из биомассы Chlorella vulgaris (Патент РФ №2256700, опубл. 20.07.2006 по классам МПК C12N 1/12, А23K 1/00, A23J 3/20, С12Н 1/00, C12N 1/12, C12R 1/89). Способ предусматривает культивирование биомассы водоросли, разрушение клеток биомассы и экстракцию биологически активных веществ. Для разрушения клеточных стенок используется двукратное замораживание биомассы при температуре от -4°С до -15°С в течение 6 часов. В качестве экстрагента используют католит, полученный в диафрагменном электролизере. Из недостатаков заявленного способа можно отметить то, что процесс замораживания биомассы как способ дезинтеграции клеточной оболочки микроводорослей обладает низкой эффективностью.

Известен также способ извлечения липидов из биомассы для получения альтернативного биодизельного топлива на основе липидов, экстрагированных из биомассы микроводоросли Chlorella. На первой стадии суспензия биомассы Chlorella подвергается обработке в аппарате, создающем вихревое электромагнитное поле с хаотически движущимися ферромагнитными частицами. В результате данной обработки клетки биомассы разрушаются, что облегчает последующую экстракцию липидов при помощи органических растворителей и обработки в импульсно-кавитационном аппарате (Патент РФ №2388812, опубл. 10.05.2010 по классам МПК C12N 1/12, С12Р 7/64). В заявленном способе можно отметить следующие недостатки. Разрушение клеток путем взаимодействия с хаотически движущимися ферромагнитными частицами неэффективно в связи с большими затратами электроэнергии на создание вихревого электромагнитного поля. Кроме того, клеточные оболочки разрушенных клеток сохраняют свою исходную морфологию, что снижает выход экстрагируемых веществ. Использование токсичных органических растворителей, таких, как хлороформ и четыреххлористый углерод, обусловливает непригодность предложенного способа для применения полученного экстракта в качестве пищевой и кормовой добавок.

Наиболее близким техническим решением, выбранным в качестве прототипа, является способ извлечения биологически активных веществ из биомассы микроводоросли рода Chlorella (Патент РФ №2460771, опубл. 10.09.2012 по классам МПК C12N 1/12, А23K 1/00, А61K 8/00).

Способ предусматривает несколько стадий обработки высушенной биомассы одноклеточной водоросли рода Chlorella, которую механически активируют в активаторах планетарного, вибрационного или виброцентробежного типов, обеспечивающих ускорение мелющих тел 60-400 м/с² при времени пребывания в зоне обработки 0,5-10 минут. После активации биомассу одноклеточной водоросли суспендируют в органическом растворителе, в качестве которых используют бензин или этиловый спирт, которые вносят при экстракции из расчета 5-7 литров органического растворителя на 1 кг сухой биомассы с последующей экстракцией при комнатной температуре в течение 3-5 часов. Полученный экстракт фильтрованием разделяют на растворимую и нерастворимую части и сушат с получением сухого липидно-пигментного комплекса. Нерастворимую часть подвергают дальнейшей обработке ферментными препаратами.

Недостатком прототипа является нагревание клеточной суспензии во время процесса механической активации и ее непосредственный контакт с кислородом воздуха, что приводит к деградации пигментов микроводоросли и потере их нативных свойств. Дальнейшее высушивание липидно-пигментного комплекса также увеличивает потери пигментов, образующих в этих условиях темно окрашенные соединения. Другим недостатком данного способа является использование в качестве экстрагента бензина, что приводит к непригодности полученных экстрактов в пищевой промышленности.

Техническая проблема, решаемая заявляемым изобретением, заключается в создании экологически чистого и эффективного способа извлечения пигментов из биомассы одноклеточной водоросли рода Chlorella.

Задача решается за счет предлагаемого способа, который включает концентрирование клеточной суспензии микроводоросли в щелочной среде 0,1н NaOH при рН 11-12, фильтрацию полученной суспензии, обезвоживание полученной сырой биомассы путем воздушной сушки при температуре 25-35°С, механическую активацию биомассы путем дезинтеграции клеточной оболочки с помощью обработки в СВЧ-поле мощностью 120 Вт при атмосферном давлении в течение 10 минут при температуре 50-60°С, последующую экстракцию пигментного комплекса из сухой биомассы путем ступенчатой мацерации с использованием ультразвука мощностью 30-40 кГц при температуре 30-40°С 96%-ным этиловым спиртом, выпаривание растворителя из полученного жидкого экстракта проводят под вакуумом 1-5 кПа при температуре 30-40°С.

Обезвоживание полученной сырой биомассы может быть осуществлено путем лиофильной сушки до получения сухой биомассы с влажностью не более 3,0%.

При концентрировании клеточной суспензии микроводоросли рода Chlorella путем образования флоков в щелочной среде и дальнейшей седиментации биомассы в указанных условиях способствует эффективному проведению процесса концентрирования и максимальному сохранению пигментов (хлорофиллов и каротиноидов). В области рН 11 наблюдается порог перехода от скрытой к явной флокуляции, который соответствует концентрации электролитов, снижающих -потенциал поверхности клеток в суспензии до критической величины. Применение щелочных сред с рН ниже 11 не обеспечивает необходимой эффективности флокуляции, что снижает выход концентрированной суспензии. Дальнейшее увеличение концентрации электролита выше порога коагуляции приводит к резкому повышению скорости флокуляции клеток. Наибольшая эффективность процесса концентрирования клеточной суспензии микроводоросли достигается при рН 11-12, обеспечивающей флокуляцию 85,0-92,3%.

Эффективность флокуляции ЭФ, % рассчитывали по формуле (1):

где

OD_750(τ0) - оптическая плотность суспензии в момент времени τ₀,

OD_750(τ) - оптическая плотность осветленного слоя суспензии в момент времени τ (τ>τ0).

Повышение рН выше 12 приводит к снижению содержания пигментов в экстракте.

На чертеже представлена зависимость динамики автофлокуляции при различных значениях рН, где кривые 1, 2, 3, 4, 5, 6 соответствуют значениям рН 7, 8, 9, 10, 11, 12.

Осветленный слой питательной среды в полученном концентрате клеточной суспензии сливают и затем отделяют биомассу фильтрацией с помощью мембранного фильтра под давлением.

Применение лиофильной или воздушной сушки в качестве обезвоживания биомассы микроводоросли при температуре минус 55°С и давлении 1 мБар и при температуре 25-35°С соответственно способствует сохранению суммы пигментов, а также их количественного соотношения и его нативных свойств в процессе удаления влаги (табл. 1).

Количественное содержание пигментов, полученных в результате экстракции, определяли спектрофотометрическим методом (Sumanta Nayek Research Journal of Chemical Sciences. - 2014. - Vol. 4(9) - P. 63-69.)

Для количественного анализа хлорофилла и каротиноидов использовали полосы поглощения пигментов в области 440, 649 и 664 нм. Концентрацию хлорофилла a (Cha), хлорофилла b (Chb) и каротиноидов (Сх+с) в экстрактах рассчитывали по формулам 2-4:

где

Cha: концентрация хлорофилла а (мкг/мл)

Chb: концентрация хлорофилла b (мкг/мл)

Сх+с: концентрация каротиноидов (мкг/мл)

А440, А649, А664 - оптическая плотность экстрактов при длинах волн 470 нм, 649 нм и 664 нм соответственно.

Концентрацию пигментов А (мг/г в пересчете на массу навески) определяли по формуле (5):

где

С - концентрация пигментов, мг/л,

V - объем вытяжки, мл,

m - навеска, г.

Проведение обезвоживания биомассы путем воздушной сушки при температуре ниже 25°С не позволяет получить сухой продукт с содержанием остаточной влаги до 3,0%. Увеличение температуры воздушной сушки выше 35°С приводит к окислительной деградации пигментов, что подтверждается изменением окраски сухой биомассы до более темной.

Для осуществления процесса активации биомассы использовали воздействие СВЧ-поля мощностью 120 Вт при температуре 50-60°С для разрушения клеточной оболочки микроводоросли. Короткое время проведение процесса активации (10 минут) при температуре 50-60°С способствует сохранению нативных свойств пигментов. Проведение дезинтеграции клеточной оболочки при температуре ниже 50°С не позволяет достичь нужного процента выхода пигментов в экстракты. Применение СВЧ-обработки при температуре выше 60°С приводит к окислительной деградации пигментов (табл. 2).

Проведение процесса ступенчатой мацерации полученного суспендированного после дезинтеграции полупродукта с использованием ультразвука (УЗ) частотой 30-40 кГц при температуре 30-40°С 96%-ным этиловым спиртом позволяет провести процесс выделения пигментов до полного истощения сырья, что обусловливает экономическую эффективность процесса экстракции. Использование УЗ с частотой ниже 30 кГц приводит к снижению содержания пигментов в экстрактах, что связано неполным разрушением хлоропластов, в то время как повышение частоты УЗ выше 40 кГц не оказывает заметного влияния на увеличение выхода пигментов в экстракт.

Удаление растворителя из полученного жидкого экстракта для получения пигментного комплекса проводят под вакуумом (1-5 кПа), создаваемом обычными устройствами, прилагаемыми в комплекте к лабораторным роторным испарителям, при температуре не более 30-40°С. Удаление растворителя при температуре ниже 30°С увеличивает время проведения процесса и снижает его эффективность. Увеличение температуры испарения выше 40°С приводит к окислению пигментов и изменению окраски продукта. Выход пигментного комплекса составляет от 2,8 до 3,3 мас. % от исходной биомассы водоросли Chlorella.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. Клеточную суспензию одноклеточной водоросли рода Chlorella sorokiniana, штамм 211-8k из коллекции водорослей университета Гёттингена (Culture Collection of Algae at University, international acronym SAG), полученной путем культивирования на питательной среде, подвергают концентрированию путем доведения рН среды до 11 добавлением 0,1 н NaOH, после образования флоков сливают осветленный слой питательной среды и подвергают фильтрации на мембранном фильтре под вакуумом. Полученный полупродукт подвергают воздушной сушке при температуре 25°С до остаточного содержания влаги 2,8%, после чего полученную сухую биомассу помещают в стеклянную емкость, смешивают с 96%-ным этиловым спиртом в соотношении 4 объемных частей растворителя на 1 часть сухой биомассы (по массе), герметично закрывают и проводят обработку СВЧ-полем мощностью 120 Вт при атмосферном давлении в течение 10 минут при температуре 50°С. После активации полученную смесь доливают экстрагентом из расчета 6 объемных частей 96%-ного этилового спирта на 1 часть сухой биомассы. Емкость с экстрактом помещают на водяную баню УЗУ-25 и ведут экстракцию при температуре 35°С и озвучивании в режиме 40 кГц в течение 30 минут, после чего экстракт центрифугируют при 3,5 тыс. об/мин в течение 3 минут и заливают биомассу новой порцией экстрагента. Количество циклов экстракции составляет 3. Полученные экстракты объединяют и сгущают в роторном испарителе в вакууме (1 кПа) при температуре 30°С. Полученный продукт содержит пигментный комплекс (хлорофиллы и каротиноиды) в количестве 3,0% от взятой сухой биомассы.

Пример 2. Концентрирование биомассы водорослей рода Chlorella осуществляется в условиях примера 1. Полученный полупродукт подвергают воздушной сушке при температуре 35°С. Обработку СВЧ-полем мощностью 120 Вт при атмосферном давлении в течение 10 минут при температуре 60°С. После активации полученную смесь доливают экстрагентом из расчета 6 объемных частей 96%-ного этилового спирта на 1 часть сухой биомассы. Емкость с экстрактом помещают на водяную баню УЗУ-25 и ведут экстракцию при температуре 30°С и озвучивании в режиме 30 кГц в течение 30 мин, после чего экстракт отделяют фильтрованием на мембранном фильтре под давлением и заливают биомассу новой порцией экстрагента. Количество циклов экстракции составляет 2. Полученные экстракты объединяют и сгущают в роторном испарителе в вакууме (5 кПа) при температуре 35°С. Полученный продукт содержит пигментный комплекс (хлорофиллы и каротиноиды) в количестве 2,9% от взятой сухой биомассы.

Пример 3. Клеточную суспензию одноклеточной водоросли рода Chlorella, полученной путем культивирования на питательной среде, подвергают концентированию путем доведения рН среды до 12 добавлением 0,1 н NaOH, после образования флоков сливают осветленный слой питательной среды и подвергают фильтрации на мембранном фильтре под давлением. Полученный полупродукт подвергают лиофильной сушке в установке модели «АК» (производство «Профлаб») при температуре минус 55°С и давлении 1 мБар до остаточного содержания влаги не более 3,0%. После чего полученную сухую биомассу помещают в стеклянную емкость, смешивают с 96%-ным этиловым спиртом в соотношении 4 объемных частей растворителя на 1 часть сухой биомассы, герметично закрывают и проводят обработку СВЧ-полем мощностью 120 Вт при атмосферном давлении в течение 10 минут при температуре 55°С. После активации в полученную смесь добавляют экстрагент из расчета 6 объемных частей 96%-ного этилового спирта на 1 часть сухой биомассы. Емкость с экстрактом помещают на водяную баню УЗУ-25 и ведут экстракцию при температуре 40°С и озвучивании в режиме 35 кГц в течение 10 мин, после чего экстракт центрифугируют при 3,5 тыс. об/мин в течение 3 минут и заливают биомассу новой порцией экстрагента. Количество циклов экстракции составляет 5. Полученные экстракты объединяют и сгущают в роторном испарителе в вакууме (3 кПа) при температуре 40°С. Полученный продукт содержит пигментный комплекс (хлорофиллы и каротиноиды) в количестве 3,3% от взятой сухой биомассы.

Предлагаемый способ получения пигментного комплекса из биомассы одноклеточной водоросли Chlorella позволяет получить концентрированный комплекс натуральных пигментов, которые могут быть использованы в качестве натурального красителя и биологически активной добавки в пищевой, косметической и фармацевтической отраслях промышленности.