Онколитический способ терапии рака молочной железы.

Изобретение относится к области медицины и молекулярной биологии и может быть использовано для разрушения клеток рака молочной железы (РМЖ), реализуемой посредством использования наночастиц с солями одновалентного таллия.

Рак молочной железы является наиболее распространенным инвазивным раком у женщин и второй основной причиной смерти от рака у женщин после рака легких.

Факторы риска развития рака молочной железы у женщин включают в себя: ожирение, отсутствие физических упражнений, употребление алкоголя, заместительную гормональную терапию во время менопаузы, ионизирующую радиацию, ранний возраст при первой менструации. Около 5-10% случаев связаны с генами, унаследованными от родителей, включая среди других BRCA1 и BRCA2. Риск заболевания возрастает с возрастом. После 20 лет вероятность развития рака молочной железы в следующем десятилетии составляет 0,6 процента. В возрасте 70 лет эта цифра достигает 3,84 процента.

По оценкам экспертов ВОЗ, в мире ежегодно регистрируют от 8 тыс. до 1 млн новых случаев заболевания раком молочной железы. По числу смертей от рака у женщин эта разновидность рака занимает второе место. Наиболее высока заболеваемость в США и Западной Европе; в России в 2005 году было выявлено 49548 новых случаев заболевания (19,8% всех видов опухолей у женщин), а число умерших составило 22830. В 2010 году рак молочной железы занимал 1-е место как в структуре заболеваемости женского населения России злокачественными новообразованиями (20,5%), так и в структуре смертности от таких заболеваний (17,2%); при этом число впервые выявленных случаев рака молочной железы выросло до 57241.

Методы лечения рака молочной железы включают в себя хирургическое лечение, лучевую терапию, а также лекарственное лечение: гормонотерапию, химиотерапию и таргетную терапию.

Основными лекарственными препаратами, применяемыми с разрешения FDA являются гуманизированные антитела, которые в некоторых протоколах применяются в сочетании с низкомолекулярными ингибиторами (по данным клинических испытаний, размещенных на сайте ClinicalTrials.gov 11.01.2017).

В статье Lehmann BD et al. Identification of human triple-negative breast cancer subtypes and preclinical models for selection of targeted therapies. (J Clin Invest. 2011; 121:2750-2767) идентифицировали семь подтипов тройных негативных линий опухолей рака молочной железы человека (TNBC (Triple-Negative Breast Cancer)) на основе глобального анализа экспрессии генов: базальный 1 (BL1), базальный 2 (BL2), иммуномодулирующий (IM), люминальный андрогенный рецептор (LAR), мезенхимальный (М), мезенхимальный стволовый элемент (MSL) и нестабильный (UNS). Каждый подтип имеет четкие характеристики, которые не только делают их более чувствительными к конкретным классам лекарств и ингибиторов, но, как установлено, служат потенциальными предикторами клинических ответов после текущей терапии.

Инвазивный статус TNBC связан с опухолью макрофагами, миелоидными клетками-предшественниками, новообразованными кровеносными сосудами и связанными с опухолью фибробластами. Эта среда является источником сигналов развития и самообновления, включая цитокины сигнальных путей NOTCH и WNT, такие как TGFβ и TNFα, которые поддерживают выживаемость раковых стволовых клеток. Кроме того, эти факторы могут «выбирать» метастатические пути, которые необходимы как для локального, так и для отдаленного метастазирования. Несколько генов, участвующих в эпителиально-мезенхимальном переходе (например, ЕМТ, TWIST1, SNAI1, SNAI2), деградация внеклеточного матрикса (матриксные металлопротеиназы, ММР), гипоксия (например, HIF1A) и ангиогенез (VEGF) были связаны с этим шагом. Выражение этих генов инициации метастазов и их генов-мишеней в первичных опухолях является прогностическим показателем плохого исхода.

Для преодоления клинических проблем с терапией рака молочной железы для повышения эффективности доставки терапевтических средств и лечения TNBC опухоли молочной железы были разработаны различные носители наночастиц для таргетирования опухолевых клеток, сосудистой системы опухоли и микроокружения опухоли (таблица 1). Большинство доклинических исследований TNBC используют человеческие линии опухолей молочной железы человека MDA-MB-231, MDA-MB-468, ВТ20 и 4Т1, а также модели опухолей ксенотрансплантата TNBC указанных клеточных линии у мышей. Однако из-за молекулярной гетерогенности TNBC новые визуализационные и терапевтические агенты должны тестироваться в моделях, которые более подробно описывают человеческое заболевание TNBC.

CRLX101 - это новый подход к химиотерапии опухолей в том числе и молочной железы человека, который исследуется в ходе испытаний на людях. Агент представляет собой наночастицу циклодекстринового полимера с адресными лигандами, которая доставляет лекарственное средство против рака (камптотецин). Он был разработан Марком Э. Дэвисом, профессором химического машиностроения в Калифорнийском технологическом институте, и специалистами в области терапии вставки, Inc., теперь Calando Pharmaceuticals, Inc., отсюда и оригинальное название «IT-101». Его новый способ доставки позволяет агенту и, следовательно, токсичному противораковым компонентам, предпочтительно накапливаться в раковой ткани. В свою очередь, ожидается снижение токсического побочного эффекта. Технология была лицензирована в июне 2009 года и запатентована (US Patent Applications 20180071404; 20170065723; 20160166567; 20160101185; 20160058875; 20140205594; 20140105891; 20130338103; 20130164282; 20130029909; 20120114658; 20120064071; 20110245201; 20110160159) компаниями Calando и Caltech, поглощенными Cerulean Pharma Inc.

Другой проблемой в терапии опухолей TNBC является хемочувствительность опухолей, которая служит не только как потенциальный ориентир для будущего лечения рецидивирующих опухолей, но также может дать представление об общей выживаемости. Результаты клинических исследований показали, что пациенты TNBC имеют разные ответы на химиотерапевтические средства, а популяция пациентов с TNBC (от 20 до 30%) имеет тенденцию к увеличению патологических полных ответов (pCR) по сравнению с пациентами, не являющимися TNBC, после неоадъювантной терапии и лучшей общей выживаемостью.

Наличие крупных лекарственно-устойчивых остаточных опухолей после неоадъювантной терапии связано с более высоким рецидивом опухоли и более низкой выживаемостью. Гистологический анализ опухолей хеморезистентных пациентов показал, что высокий уровень лекарственно-устойчивых опухолевых клеток экспрессирует стволовые клеточные биомаркеры рака молочной железы CD44^hi/CD24^1o. В целом, пациенты TNBC, которые не достигли pCR после неоадъювантной терапии, имеют худший прогноз по сравнению с пациентами с pCR. Таким образом, разработка новых подходов к решению двух основных задач в области клинического лечения пациентов с TNBC своевременного мониторинга терапевтических реакций и эффективного лечения лекарственно-устойчивых опухолевых клеток должна оказать значительное влияние на улучшение выживаемости пациентов с TNBC (US Patent Applications 20170202782; 20170218086; 20170340599). Сказанное выше, относится к камптотецину в полной мере.

Для повышения эффективности и снижения токсичности, химиопрепараты инкапсулируют, например, в вирусные частицы (вирионы) РНК-содержащих бактериофагов. Внимание к РНК-содержащим бактериофагам, в частности к MS2 (US Patent 6159728; US Patent Application 20100167981), как средства адресной (таргетной) доставки, объясняется простотой организации вириона. Из-за отсутствия на поверхности бактериофага MS2 специфических рецепторов к клеткам опухоли, проводят модификацию поверхности вириона, например, с помощью циклических iRGD пептидов, имеющих высокую аффинность к интегрину a_vb₃, для высокой точности введения (US Patent 5534257; US Patent Aplication 20130017210; Stacy L. Capehart et al. Controlled Integration of Gold Nanoparticles and Organic Fluorophores Using Synthetically Modified MS2 Viral Capsids // J Am. Chem. Soc. 2013, February 27; 135(8): 3011-3016). В литературе можно найти описание метода получения поверхностно модифицированных вирус-подобных частиц фага MS2, так чтобы обеспечивать их взаимодействие с рецепторами клеток опухолей и сосудов их питающих, по механизму лиганд-рецептор (Ruoslahti Е. Specialization of tumor vasculature // Nat Rev Cancer 2002 Feb; v. 2 (2): pp. 83-90; K.N. Sugahara et al. Tissue-Penetrating Delivery of compounds and Nanoparticles into Tumors // Cancer Cell December 8 2009, v. 16 (3), pp. 510-520).

Задачей настоящего изобретения является создание нового способа таргетной доставки препаратов для терапии TNBC.

Решение указанной задачи обеспечивается тем, что адресность достигается вирионом фага MS2, модифицированным циклическим лигандом iRGD, имеющим высокую аффинность к интегрину a_vb₃ и ковалентно связанным с оболочкой. При этом сердцевина модифицированного вириона фага MS2 должна содержать геномную РНК и соль таллия. Проникновение поверхностно модифицированных вирионов в клетки опухоли обеспечивается за счет лиганд-рецепторного взаимодействия iRGD с интегринами a_vb₃.

Результаты исследований иллюстрируются следующими графическими изображениями:

Фиг. 1 - размеры опухоли;

Фиг. 2 - некроз опухоли.

Предлагаемый способ может быть реализован на базе существующего уровня техники следующей последовательностью действий.

Пример 1. Получение высокого титра фага MS2 проводили по методу, описанному в уровне техники (Княжев В.А., Сивов И.Г., Сергиенко В.И. РНК-трансдукция неинфекционными вирионами фага MS2 // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология 2002, №3, стр. 56-63). Контролями служили секвенирование ОТ-ПЦР фрагмента геномной РНК, а также определение титра методом агаровых слоев (Gratia A. Numerical Relations between Lysogenic Bacteria and Particles of Bacteriophage // Ann. Inst. Pasteur 1936, v. 57, p. 652). Концентрирование вирионов фага, проводили после осветления клеточного лизата центрифугированием (15000 об/мин) с последующим осаждением ПЭГ-6000 в присутствии NaCl, как известно специалистам. Концентрирование препарата фага так же проводили обезвоживанием сухим сефадексом G-10.

Пример 2. Наполнение сердцевины вирионов фага MS2 солями таллия.

А. Методом вакуумной сушки, когда проводили сушку смеси препарата фага с растворами таллия.

Б. Методом разборки - сборки, когда его проводили по протоколу, известному специалистам (US Patent 8987173), выдерживая фаг 24 часа в буфере ST (50 mM трис, 100 mM NaCl) в присутствии 0.25М ТМАО и 0,1М соли таллия. Затем раствор центрифугировали при 10,000g 10 минут. Супернатант смешивали с ПЭГ6000 и NaCl до конечной концентрации 12,5% и 0.5М, соответственно. Через 2 часа раствор осаждали центрифугированием (17,800g в течение 45 минут) при 4°С. Осадок растворяли в минимальном количестве ST буфера и вновь осаждали при 10,000g в течение 10 минут. Надосадок фракционировали и фракции, соответствующие интактным капсулам вируса MS2, собирали и после хранили в 4°С в ST буфере.

Пример 3. Модификация поверхности вирионов пептидами.

А. Синтез пептидов со структурой (NH2)GGGCRGDK/RGPD/EC(COOH).

Пептид синтезировали методом твердофазного пептидного синтеза исходя из Fmoc-аминокислот на автоматическом пептидном синтезаторе 433А Applied Biosystems на смоле с присоединенным остатком Fmoc-Cys(Acm). Использовали следующие производные аминокислот: Fmoc-Cys(Acm), Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Pro. Снятие Fmoc-защитной группы с N-концевой альфа-аминогруппы растущей пептидной цепи проводили 22%-ным раствором 4-метилпиперидина в N-диметилформамиде (Алешина Е.Ю., Пындык Н.В., Мойса А.А., Санжаков М.А., Харыбин О.Н., Николаев Е.Н., Колесанова Е.Ф. Синтез фрагмента P-амилоида 5RHDSGY10 и его изомеров. Биомед. химия, 2008, т. 54, №2, 154-166). Присоединение аминокислот к растущей пептидной цепи (кроме Fmoc-Cys(Acm)) осуществляли с предварительной активацией Fmoc-аминокислот гексафторфосфатом 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3 -тетраметиламиния в присутствии 1-гидроксибензо-триазола и 2,4,6-коллидина согласно процедуре FastMoc, описанной в инструкции к синтезатору. Fmoc-Cys(Acm) присоединяли с активацией in situ, используя в качестве активатора диизопропил-карбодиимид в присутствии 1-гидроксибензотриазола. По окончании синтеза пептид снимали со смолы обработкой смесью трифторуксусной кислоты, три-(изопропил)-силана, 3,6-диокса-1,8-октандитиола и воды (в объемном соотношении 94:1:2,5:2,5) и осаждали метил-трет-бутиловым эфиром. Осадок пептида растворяли в 10%-ном водном ацетонитриле с 0,1% трифторуксусной кислоты, и полученный раствор подвергали очистке методом ВЭЖХ на колонке Zorbax SB-C8, 21,2×250 мм, 7 мкм в градиенте концентрации ацетонитрила в 0,1% водном растворе трифторуксусной кислоты. Фракцию, содержащую целевой пептид, собирали и упаривали под вакуумом и затем проводили удаление защитных Acm-групп с остатков цистеина с одновременным формированием дисульфидного мостика по известной методике (Fernando Albericio et al. Preparation and handling of peptides containing methionine and cysteine // In: Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. Eds. W.C. Chang and P.D. White. Oxford University Press, 2000). Пептид подвергали повторной очистке методом ВЭЖХ на той же колонке, фракцию целевого пептида упаривали под вакуумом.

Б. Ковалентное связывание пептида с оболочкой фаговых частиц проводили с использованием диметиладипимидата в соответствии со стандартной процедурой, известной специалистам (М.Н.V. Van Regenmortel, S. Muller. Synthetic peptides as antigens. Elsevier, 1999, pp. 88-90).

Пример 4. Получение мышей ксенографов MDA-MB-231; MDA-MB-468; HCC1806; BT-549; ВТ-20 и определение эффективности действия препарата на этих моделях.

Здоровым взрослым «голым» мышам женского пола (Nude линия NCRNU-F) вводили предварительно рассчитанные концентрации клеток указанных линий. Чтобы усилить соответствующую активность клеток их, в ряде случаев, растили в условиях, известных специалистам. Клетки собирали и вводили мышам подкожно. Смесь для введения содержала 5-15 млн. клеток в буфере с пенициллином и стрептомицином, а также комбинацию валерата 17β-эстрадиола (15 мг) и 300 мкл Matrigel. В период 2-х месяцев, выживших мышей отбирали для анализа приживления опухоли. Полученную модель считали «позитивной» по данным гистологического анализа, иммунофлуоресценции и ПЦР, в сравнении с контролем.

Препарат поверхностно модифицированных вирионов фага, содержащих соль таллия (МВТ), в дозе 10⁸ частиц вводили перорально, добавляя стерильный препарат частиц в питьевую воду, трем группам мышей с прижившимися опухолями (размером 5, 7 и 10 мм³) и двум контрольным группам с опухолью (получавшей цисплатин в терапевтической дозе) и интактным животным. Исчезновение клеток указанных линий у ксенографов, получавших МВТ, наблюдали к 12 дню с момента получения первой дозы. Однако, в группе с большой опухолью (10 мм³) животные к указанному сроку погибали в 15% случаев. У всех павших животных размер опухоли был значительно снижен (см. фиг. 1). Однако, у павших животных с опухолью большого размера обнаружили перитонеальный экссудат, который по биохимическим показателям соответствовал лабораторным значениям «синдрома лизиса опухоли» (СЛО), где концентрации: мочевой кислоты > 1 мг/мл, натрия > 0,5 мг/мл, фосфора > 0,5 мг/мл.

Таким образом, предлагаемый онколитический способ терапии рака молочной железы, позволяет обеспечить эффективное направленное цитоксическое воздействие на очаговые и метастатические скопления опухолевых клеток и может быть реализован в амбулаторных условиях на базе имеющегося оборудования.