НОВЫЙ ШТАММ, ВЫДЕЛЕННЫЙ ИЗ ТРАДИЦИОННОГО МЕДЖУ, МЕТОД ПРИГОТОВЛЕНИЯ СОЕВОГО КОДЖИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭТОГО ШТАММА И СОЕВЫЙ КОДЖИ, ПРИГОТОВЛЕННЫЙ ТАКИМ МЕТОДОМ

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новому штамму Bacillus amyloliquefaciens CJ14-6, выделенному из традиционного меджу и обладающему высокой протеазной активностью и активностью, направленной против ожирения; к способу приготовления соевого коджи с использованием этого нового штамма; и к соевому коджи, полученному таким способом приготовления.

Предпосылки создания изобретения

Меджу представляет собой ферментированный пищевой продукт, который служит в качестве основы для традиционных корейских ферментированных соевых продуктов, таких как ганджан (соевый соус), кочхуджан (паста чили) и дунджан (соевая паста). Меджу, приготовленный из сои как основного ингредиента, также представляет собой закваску, имеющую важное значение для приготовления традиционных корейских приправ, таких как ганджан (соевый соус), кочхуджан (красная паста чили) и дунджан (соевая паста).

Меджу (ферментированная соя) подразделяется, главным образом, на традиционный меджу, модифицированный меджу или коджи фабричного изготовления (Kokja) в зависимости от способа приготовления. Традиционный меджу приготавливают только из сои, которой придают определенную форму, обваливают рисовой соломкой, а затем ферментируют в течение определенного периода времени. Модифицированный меджу приготавливают из сои, обработанной паром и ферментированной штаммом Aspergillus sp. коджи фабричного изготовления получают путем ферментации пшеничных зерен или пшеничной муки штаммом Aspergillus oryzae.

Кочхуджан (красная паста чили) подразделяется, главным образом, на традиционный (корейского типа) кочхуджан и кочхуджан фабричного изготовления (модифицированный), в зависимости от способа приготовления. Традиционный кочхуджан представляет собой ферментированную приправу, приготовленную из порошка меджу для приготовления кочхуджана (смеси сои и зерен в определенном соотношении), крахмального ингредиента, подобного рисовой клейковине, хеот-гару (ячменного солодового порошка), соли и порошка чили, посредством ферментации и выдерживания. Кочхуджан фабричного изготовления представляет собой кочхуджан, который выдерживают в диастатических условиях, и вместо порошка меджу для кочхуджана, используют коджи вместе с культивированным Aspergillus oryzae. При приготовлении коджи, белковым ингредиентом является соя, а крахмальным ингредиентом является рисовая или пшеничная мука.

Чем больше женщин работает вне дома, тем чаще люди покупают кочхуджан фабричного изготовления. Поэтому, производство кочхуджана фабричного изготовления возрастает, а также увеличивается его экспорт.

Что касается стандартного метода приготовления кочхуджана фабричного изготовления, то в Kорейском патенте No. 10-0668056 описан соевый меджу и метод его приготовления, где культивированные микроорганизмы инокулируют в сою для ее ферментации. Более конкретно, в литературе описан метод приготовления соевого меджу, а также соевый меджу, приготовленный таким методом, где указанный метод включает стадию обработки сои паром и ее сушки и стадию ферментации посредством инокуляции сои культивированными микроорганизмами, выделенными из традиционного меджу, с последующей ферментацией этой сои в течение определенного периода времени.

Даже при применении стандартного способа, существует потребность в получении соевого коджи для крупномасштабного производства кочхуджана фабричного изготовления.

[Документы предшествующего уровня техники]

(Ссылка на патент 1) KR 10-0668056 B1 (опубликованный 11 января, 2007)

Описание изобретения

В попытке разработать способ крупномасштабного производства кочхуджана фабричного изготовления, авторами настоящего изобретения был обнаружен тот факт, что штамм Bacillus amyloliquefaciens CJ14-6, выбранный из штаммов с высокой протеазной активностью, выделенных из традиционных приправ, может быть использован в целях приготовления соевого коджи, подходящего для крупномасштабного производства кочхуджана фабричного изготовления, и на основе этого факта было создано настоящее изобретение.

Поэтому, целью настоящего изобретения является получение штамма Bacillus amyloliquefaciens CJ14-6, выделенного из традиционного меджу.

Другой целью настоящего изобретения является разработка способа приготовления соевого коджи с использованием указанного штамма.

Другой целью настоящего изобретения является получение соевого коджи, приготовленного указанным способом приготовления.

Для достижения целей настоящего изобретения необходимо получить штамм Bacillus amyloliquefaciens CJ14-6, выделенный из традиционного меджу и обладающий высокой протеазной активностью и активностью, направленной против ожирения.

В соответствии с этим, настоящее изобретение также относится к способу приготовления соевого коджи, который включает стадию паровой обработки сои, смоченной в воде, или добавления воды к сое и паровой обработки смоченной сои или сои с добавлением воды; и стадию приготовления соевого коджи посредством инокуляции штамма Bacillus amyloliquefaciens CJ14-6 в обработанную паром сою и ферментации обработанной паром сои.

В соответствии с этим, настоящее изобретение также относится к соевому коджи, полученному указанным способом приготовления.

Эффекты изобретения

В настоящем описании раскрывается эффект, позволяющий приготавливать кочхуджан фабричного изготовления в больших количествах с использованием штамма Bacillus amyloliquefaciens CJ14-6, выбранного в качестве нового штамма, выделенного из традиционного меджу и обладающего высокой протеазной активностью, для приготовления соевого коджи.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 представлено изображение адипоцитов контрольной группы, окрашенных анилиновым синим в экспериментальном Примере 1.

На фиг. 2 представлено изображение адипоцитов тест-группы Примера 2, окрашенных анилиновым синим в экспериментальном Примере 2.

Наилучшие варианты осуществления изобретения

Настоящее изобретение более подробно описано ниже.

В соответствии со своим первым вариантом, настоящее изобретение относится к штамму Bacillus amyloliquefaciens CJ14-6, выделенному из традиционного меджу и обладающему высокой протеазной активностью.

Более конкретно, различные штаммы были выделены из корейского традиционного меджу. В качестве первичного отбора различных штаммов, из активной среды были выделены штаммы Bacillus spp. с высокой протеазной активностью: а в качестве вторичного отбора из штаммов Bacillus spp., был выделен штамм с высокой протеолитической активностью из твердой культуральной среды на основе сои. Было проведено секвенирование рДНК 16s для идентификации конечного отбранного штамма Bacillus spp.

Штамм Bacillus spp., выделенный в качестве конечного отобранного штамма, был идентифицирован как Bacillus amyloliquefaciens (последовательность No. 1). Этот штамм с высокой протеазной активностью был назван «Bacillus amyloliquefaciens CJ14-6» и положен на депонирование в Корейский центр культур микроорганизмов (KCCM) 1 июля, 2015 (регистрационный номер No. KCCM11718P).

В соответствии со вторым своим вариантом, настоящее изобретение относится к способу приготовления соевого коджи, который включает стадию паровой обработки сои, смоченной в воде, или добавления воды к сое, и паровой обработки смоченной сои или сои с добавлением воды; и стадию приготовления соевого коджи посредством инокуляции штамма Bacillus amyloliquefaciens CJ14-6 в обработанную паром сою и ферментации обработанной паром сои.

Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу приготовления соевого коджи, включающему: смачивание отобранной и промытой сои в воде или добавление воды к отобранной и промытой сое; паровую обработку и охлаждение сои; инкубирование штамма Bacillus amyloliquefaciens CJ14-6 для получения культуральной среды; и инокуляцию культуральной среды штамма Bacillus amyloliquefaciens CJ14-6 в охлажденную сою и ферментацию сои для получения соевого коджи.

Способ приготовления может также включать стадию смачивания отобранной и промытой сои в воде для смачивания, которую выдерживали при 10-50°C в течение 1-15 часов до проведения стадии паровой обработки сои. Соя может быть обработана насыщенным паром (1,0-2,0 кгс/см²) при 100-150°C в течение 1-60 минут. Однако, способ паровой обработки, применяемый в настоящем изобретении, не имеет конкретных ограничений. Обработанная паром соя может быть подвергнута охлаждению приблизительно до 30-50°C, а более конкретно, приблизительно до 30-35°C.

Соя может быть подвергнута паровой обработке в паровом стерилизаторе высокого давления (в автоклаве) при 100-150°C в течение 5-15 минут, а более конкретно, при 110°C в течение 10 минут.

Штамм Bacillus amyloliquefaciens CJ14-6 может быть использован в форме спор, инкубированных в культуральной среде. Культуральная среда может быть равномерно инокулирована по всей обработанной паром сое в количестве от 0,1 до 3,0 масс.% по общей массе соевого продукта.

Культуральной средой для инкубирования штамма может быть среда соевого соуса. Используемая здесь среда соевого соуса может быть приготовлена путем смешивания 1-10% соевого соуса, выбранного из группы, состоящей из соевого соуса корейского типа, соевого соуса фабричного изготовления или смешанного соевого соуса, и 0,1-10% сахара, выбранного из группы, состоящей из глюкозы, сахарозы, галактозы и мальтозы.

В другом своем варианте, настоящее изобретение включает инокуляцию среды соевого соуса (содержащей соевый соус фабричного изготовления и глюкозу) штаммом Bacillus amyloliquefaciens CJ14-6, полученным путем выделения из чистой культуры и хранения, и инкубирование при температуре в пределах от 30 до 42°C в течение 20-42 часов до образования спор с получением культуральной среды для Bacillus amyloliquefaciens CJ14-6.

После инокуляции штаммом Bacillus amyloliquefaciens CJ14-6, сою ферментируют при 30-45°C, а более конкретно при 34-44°C, в течение 1-3 дней с получением соевого коджи.

Способ приготовления может также включать стадию сушки после стадии ферментации.

В соответствии со своим третьим своим вариантом, настоящее изобретение относится к соевому коджи, полученному способом приготовления соевого коджи.

Соевый коджи, полученный способом приготовления согласно изобретению, может быть использован в целях крупномасштабного производства кочхуджана фабричного изготовления.

Настоящее изобретение более подробно описано со ссылкой на нижеследующие примеры, которые приводятся лишь в иллюстративных целях и не должны рассматриваться как ограничение объема настоящего изобретения.

[Примеры]

Пример 1: Выделение штамма из традиционного меджу и идентификация этого штамма

(1) Выделение и идентификация штамма

Штамм, используемый в качестве закваски для ферментации согласно изобретению, был выделен и отобран из традиционного меджу, поставляемого предприятиями по производству традиционных пищевых продуктов в провинциях Куунджи-ду, Кангвон-ду, Хунгбук и Хуннам.

Традиционный меджу разводили в стерилизованной воде, распределяли по питательному агару (Difco) и культивировали при 37°C. Пять живых микроорганизмов как доминантных видов, используемых в традиционном меджу, отбирали, выделяли из традиционного меджу методом выделения чистой культуры и идентифицировали. Отдельные выделенные штаммы были обозначены «CJ 3-27», «CJ 4-4», «CJ 5-10», «CJ 14-6» и «CJ 16-57», соответственно.

Выделенные штаммы культивировали в шейкере (при 200 об/мин) в питательном бульоне (Difco) при 37°C в течение 24 часов, а затем оценивали их протеазную активность. Результаты идентификации и оценки протеазной активности представлены в Таблице 1.

[Таблица 1]

Результаты идентификации выделенных штаммов, происходящих от традиционного меджу

(2) Первичный отбор

В результате первичного отбора были выделены и идентифицированы штаммы, такие как CJ 3-27, CJ-4-4, CJ 14-6 и CJ 16-57, кроме штамма CJ 5-10, который обладал самой низкой протеазной активностью.

(3) Вторичный отбор

Четыре штамма, выбранные при первичном отборе, были использованы для приготовления соевого коджи и проанализированы на их протеазную активность. Результаты измерения представлены в Таблице 2. При сравнении протеазной активности, штаммы с высокой протеазной активностью были названы штаммами вторичного отбора.

Для приготовления соевого коджи, 1 кг сои смачивали в очищенной воде в течение 12 часов, подвергали паровой обработке в паровом стерилизаторе высокого давления (в автоклаве) при 110°C в течение 10 минут, а затем охлаждали до 35°C. Каждый выделенный штамм добавляли к охлажденной сое в количестве 2,0 масс.% по общей массе продукта и инкубировали при 37°C в течение 3 дней. Культивированные таким образом штаммы были использованы для приготовления отдельного соевого коджи.

Для определения протеазной активности, каждый соевый коджи подвеграли экстракции и фильтрации при 30°C в течение одного часа, и фильтрат использовали в качестве раствора кофермента. Раствор для ферментативной реакции получали путем добавления 0,5 мл раствора кофермента, 1,5 мл 2% молочного казеина в качестве субстрата и 1 мл буфера Макливена (pH 6,0) и инициировали ферментативную реакцию при 38°C в течение одного часа. Затем, для суспендирования реакционной смеси добавляли 3 мл 0,4M раствора TCA, и после фильтрации, реакционный раствор достаточно хорошо смешивали с 5 мл 0,4M Na₂CO₃ и 1 мл фенолового реагента. Полученный раствор оставляли на 30 минут при 38°C для проявления окраски, и оценивали его оптическую плотность на спектрофотометре на 660 нм. Ферментативная активность выражается как количество фермента, продуцирующего тирозин в количестве 1 мкг в минуту, и эта активность была принята за одну единицу. Тирозин был использован в качестве эталонного вещества для построения калибровочной кривой.

[Таблица 2]

Сравнение протеазной активности для соевого коджи с использованием штаммов первичного отбора

Исходя из результатов, представленных в Таблице 2, были отобраны штаммы CJ 3-27 и CJ 14-6 с высокой протеазной активностью.

(4) Третий отбор: In-vitro активность 3T3-L1 против ожирения

(A) Клеточная линия

Как и в случае дифференцировки жировых клеток, клетки 3T3-L1, используемые в качестве клеточной линии мышиных эмбриональных фибробластов, были закуплены в Корейском банке клеточных линий (KCLB).

(B) Культивирование клеток

Культивирование клеток 3T3-L1 осуществляли с использованием культуральной среды DMEM, содержащей 10% BCS и 1% пенициллина-стрептомицина. Клетки, после их пролиферации до 70% в чашке для культивирования, подвергали центрифужному разделению при 1000 об/мин и субкультивировали в отношении 1:5.

(C) Анализ на MTT

Исходя из способности дегидрогеназы живых клеточных митохондрий реагировать с MTT и образовывать кристаллы MTT-формазана темно-синего цвета был проведен анализ на MTT методом, описанным Carmichael и сотрудниками. 500 мкл клеток 3T3-L1 на лунку высевали в 48-луночный планшет в концентрации 1,5 × 10⁴/мл и инкубировали в инкубаторе (37°C, 5% CO₂) в течение 24 часов для иммобилизации клеток на дне планшета. На следующий день, образец вводили в каждую лунку до конечной концентрации 1000 мкг/мл, 250 мкг/мл или 0 мкг/мл. После инкубирования в течение 24 часов, среду, содержащую образец, доводили до 5 мг/мл и добавляли раствор тиазолилового синего и бромида тетразолия в количестве 50 мкл на лунку до конечной концентрации 500 мкг/мл. Клетки инкубировали в инкубаторе (37°C, 5% CO₂) в течение 4 часов. После завершения реакции, среду, содержащую реагент MTT, удаляли и добавляли 300 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) для растворения кристаллов MTT-формазана, которые давали окраску через 5 минут, и определяли оптическую плотность этой среды на 540 нм на микроплантшет-ридере для ELISA.

(D) Индуцирование дифференцировки клеток 3T3-L1

Для индуцирования дифференцировки клеток, клетки высевали в 6-луночный планшет в концентрации 2,5 × 10⁴/мл и инкубировали в культуральной среде DMEM, содержащей 10% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина в инкубаторе (37°C, 5% CO₂) в течение 4 дней до тех пор, пока они не приобретали пост-конфлюэнтное состояние. В качестве позитивного контроля, в тесте на эффективность против ожирения был использован ресвератрол, способный ингибировать дифференцировку пре-адипоцитов, ускорять адиполиз и предотвращать адипогенез посредством индуцирования самопризвольного клеточного «суицида» зрелых адипоцитов.

На день 0, клетки в пост-конфлюэнтном состоянии обрабатывали средой для индуцирования дифференцировки, содержащей 10% FBS, 1% пенициллина-стрептомицина, 5 мкг/мл инсулина, 1 мкМ дексаметазона (DMS) и 0,5 мM 3-изобутил-1-метилксантина (IBMX) в течение 72 часов. На дни 3 и 5, клетки инкубировали с культуральной средой DMEM, активирующей дифференцировку и содержащей 10% FBS, 1% пенициллина-стрептомицина и 10 мкг/мл INS. После замены среды, все образцы обрабатывали до концентрации 10 мкг/мл, 50 мкг/мл или 0 мкг/мл и доводили до концентрации 20 мкг/мл как позитивного контроля.

(E) Окрашивание масляным красным O и количественная оценка

Для определения степени дифференцировки клеток 3T3-L1 во время инкубирования, клетки окрашивали реагентом масляным красным О для окрашивания липидных капелек модифицированным методом, описанным Rene et al. и Kasturi et al. на 7-ой день, то есть, в последний день дифференцировки.

Клетки на стадии дифференцировки иммобилизовали в каждой лунке, содержащей 4% параформальдегида (в PBS) посредством реакции при комнатной температуре в течение одного часа или более. Клетки удаляли из среды для иммобилизации и окрашивали 0,5% масляным красным О в течение одного часа. Для удаления остаточного красителя, клетки дважды промывали проточной водой до тех пор, пока вообще не оставалось окрашивающего реагента. Окрашенные липидные капельки растворяли в изопропаноле и измеряли их оптическую плотность на 510 нм.

In-vitro активность против ожирения определяли путем сравнения активности, ингибирующей дифференцировку адипоцитов, для двух штаммов Bacillus amyloliquefaciens, CJ 3-27 и CJ 14-6, которые, как было обнаружено, обладали высокой протеазной активностью.

[Таблица 3]

Степень ингибирования дифференцировки адипоцитов штаммами вторичного отбора

Статистическая калибровка: t-критерий Стьюдента

* P < 0,05

Как можно видеть из результатов, представленных в Таблице 3, в культуральной среде штамма CJ 14-6 обнаруживался значимый уровень ингибирования дифференцировки адипоцитов, тогда как в культуральной среде CJ 3-27 не обнаруживалось каких-либо значимых изменений в уровне ингибирования дифференцировки адипоцитов.

Пример 2: Приготовление соевого коджи

В этом примере, новый штамм конечного отбора Bacillus amyloliquefaciens CJ 14-6 использовали в качестве закваски для ферментации в целях приготовления соевого коджи методом приготовления, описанным в Примере 1-(1).

Для сравнения со стандартным соевым меджу, полученного с использованием Aspergillus oryzae, приготавливали соевый коджи с использованием коммерчески доступного Aspergillus oryzae от Chungmoo Fermentation Co. в качестве закваски для ферментации в целях приготовления соевого коджи методом, описанным в Примере 1-(1).

(1) Определение протеазной активности

Каждый соевый меджу оценивали на протеазную активность. Результаты оценки представлены в таблице 4.

[Таблица 4]: Ферментативная активность соевого коджи, оцениваемая с использованием нового штамма Bacillus amyloliquefaciens CJ 14-6 и стандартного штамма Aspergillus oryzae

Как можно видеть из результатов, представленных в таблице 4, соевый меджу, приготовленный с использованием нового штамма Bacillus amyloliquefaciens CJ 14-6, имел протеазную активностью, которая на 120,6% превышала протеазную активность соевого коджи, приготовленного с использованием стандартного штамма Aspergillus oryzae. Это указывало на то, что использование соевого коджи, приготовленного с помощью нового штамма Bacillus amyloliquefaciens CJ 14-6, может стимулировать активность разложения белка при его использовании в кочхуджане или дунджане и способствовать улучшению вкусовых качеств.

Экспериментальный пример 1: Определение эффекта, направленного против ожирения, для соевого коджи , приготовленного с использованием нового штамма (CJ 14-6)

Эксперимент на животных проводили для оценки эффекта, направленного против ожирения, для соевого коджи, приготовленного с использованием нового штамма Bacillus amyloliquefaciens CJ 14-6. Животными, используемыми в эксперименте, являются самцы белых крыс (крысы S.D. в возрасте 5 недель), которые были закуплены у Damool Science (Южная Корея) и содержались в вивариумах при 18±2°C в условиях освещения с регулируемым 12-часовым суточным циклом день-ночь (от 08:00 до 20:00).

Крыс распределяли на две группы, каждая из которых состояла из семи животных. В контрольной группе, к порошкообразному корму для белых крых добавляли 20% свиного жира, и крысам давали корм с высоким содержанием жира. В группе Примера 2, крысам давали тот же самый корм с высоким содержанием жира, включающий 0,91% соевого коджи, приготовленного с использованием нового штамма согласно изобретению. Масса тела и масса жировой ткани крыс представлены в Таблицах 5 и 6, соответственно.

Массу тела и потребление корма оценивали каждую неделю и массу жировой ткани и содержание липидов определели после 12-часового голадания до окончания испытаний. Взятую кровь подвергали центрифужному разделению при 1900× g в течение 20 минут для выделения сыворотки, которую использовали как образец для определения содержания липидов в сыворотке крови. Для анализа содержания общих липидов, содержания нейтральных жиров и содержания общего холестерина в печени и в жировых тканях, к 0,1 г собранной печени и жировых тканей добавляли хлороформ-метанол (2:1, об./об.), а затем оставляли в холодильнике на 3 дня и смачивали в дистиллированной воде. Печень и жировые ткани подвергали центрифужному разделению при 1150× g в течение 20 минут и определяли содержание общих липидов в липидном слое, то есть, в нижнем слое. Жировую ткань разводили и использовали для определения содержания общего холестерина и нейтральных жиров. Содержание липидов в сыворотке крови и в тканях, оцененное в анализах на содержание липидов, представлено в Таблицах 7-10.

Для определения ферментативной активности при биосинтезе жирной кислоты в жировой ткани добавляли 0,1M фосфатно-калиевого буфера (pH 7,4, 37°C) в объеме, который в три раза превышал массу жировой ткани, и после гомогенизации, жировую ткань подвергали центрифужному разделению при 3000 об./мин. в течение 15 минут. Полученный таким образом супернатант подвергали центрифужному разделению при 15000 об./мин. в течение 30 минут для сбора второго супернатанта. Данные измерения ферментативной активности представлены в Таблицах 11 и 12.

Для определения размера адипоцитов, собранные адипоциты иммобилизовали с использованием раствора Боуэна с получением парафинового блока, который затем разрезали на кусочки и окрашивали анилиновым синим. Затем получали изображения адипоцитов на электронном микроскопе для сравнения адипоцитов в каждой обработанной области.

[Таблица 5]

[Таблица 6]

[Таблица 7]

[Таблица 8]

[Таблица 9]

[Таблица 10]

[Таблица 11]

[Таблица 12]

[Таблица 13]

[Таблица 14]

Статистическая калибровка: t-критерий Стьюдента

* P <0,05

** P <0,01

*** P <0,001

Как можно видеть из результатов Таблицы 5, у группы Примера 2 наблюдался прирост массы тела, составляющий не более, чем 91,5% по сравнению с контрольной группой. В соответствии с результатами, представленными в Таблице 6, у группы Примера 2 наблюдалось снижение массы жировой ткани вокруг почек по сравнению с контрольной группой, и таким образом, масса жировой ткани вокруг почек у группы Примера 2 не более, чем на 83,3% превышала массу жировой ткани у контрольной группы.

В соответствии с этим, результаты, представленные в этом Примере, показали, что соевый коджи, приготовленный с использованием нового штамма (CJ 14-6), эффективно снижает массу тела.

[Регистрационный номер]

Депозитарий: Корейский Центр культур микроорганизмов (Международный)

Регистрационный No.: KCCM11718P

Дата депонирования: 1 июля, 2015 г.

INDICATIONS RELATING TO DEPOSITED MICROORGANISM

OR OTHER BIOLOGICAL MATERIAL

(PCT Rule 13bis)

Form PCT/RO/134 (July1998; reprint January 2004).