СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АРОМАТИЧЕСКОЙ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ГЕН ydiB, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЛОЖНОГО ЭФИРА НИЗШИХ АЛКИЛОВ АЛЬФА-L-АСПАРТИЛ-L-ФЕНИЛАЛАНИНА

Область техники

Настоящее изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способу получения ароматической L-аминокислоты с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae, модифицированной таким образом, что экспрессия гена ydiN, или гена ydiB, или обоих генов в указанной бактерии ослаблена.

Описание предшествующего уровня техники

Традиционно L-аминокислоты в промышленном масштабе могут быть получены методом ферментации с использованием штаммов микроорганизмов, полученных из природных источников, или их мутантов, специально модифицированных для того, чтобы увеличить продукцию L-аминокислот.

Описано множество методов увеличения продукции L-аминокислот, например путем трансформации микроорганизма рекомбинантной ДНК (см., например, патент США 4,278,765). Другие методы основаны на повышении активности ферментов, вовлеченных в биосинтез аминокислот и/или уменьшении чувствительности целевого фермента к обратному ингибированию продуцируемой L-аминокислотой (см., например, патенты США 4,346,170; 5,661,012 и 6,040,160).

Другим методом увеличения продукции L-аминокислот является ослабление экспресии одного или нескольких генов, вовлеченных в деградацию целевой L-аминокислоты; генов, экспрессия которых ведет к отвлечению предшественников целевой аминокислоты от пути биосинтеза L-аминокислоты; генов, вовлеченных в перераспределение потоков углерода, азота и фосфора; генов, кодирующих токсины и т.д.

Шикиматдегидрогеназа катализирует четвертую стадию пути биосинтеза шикимата, необходимого для биосинтеза ароматичесеих соединений в растениях и микроорганизмах. В Escherichia coli экспрессируются два паралога шикиматдегидрогеназы, НАДФ-спепифичный AroE и предполагаемый фермент YdiB. YdiB характеризуется как дегидрогеназа с двойной специфичностью хиннат/шикимат, использующая в качестве кофактора НАД либо НАДФ. Были определены структуры AroE и YdiB со свянанными кофакторами с разрешением 1.5 и 2.5 А соответственно. У обоих ферментов похожая структура с двумя α/β доменами, разделенными широкой щелью. Сравнение их динуклеотидсвязывающих доменов выявляет молекулярную основу для специфичности кофакторов. Отдельные молекулы демонстрируют конформационную трансформируемость, что позволяет предположить, что переключение между открытой и закрытой конформациями имеет место при связывании субстрата. Анализ последовательностей и сравнение структур привели к предположению механизма катализа и модели узнавания 3-дегидрошикимата (Michel G., et al., J Biol Chem. 23; 278(21): 19463-72(2003)).

Белок Escherichia coli YdiB, ортолог шикимат-5-дегидрогеназы, катализирует восстановление 3-дегидрошикимата до шикимата как часть пути синтеза шикимата, который отсутствует у млекопитающих, но необходим для синтеза de novo ароматических аминокислот, хинонов и фолата во многих других организмах. В этой связи путь синтеза шикимата выбран в качестве мишени для создаваемых антибиотиков. Кристаллографическая структура YdiB демонстрирует, что промотор содержит два α/β домена, связанных двумя α-спиралями, структура N-концевой области домена ранее не описана, структура С-концевой области домена - сгиб Россманна. НАД⁺ кофактор, выделяющийся при очистке вместе с белком, связан с доменом Россманна в вытянутой форме с никотинамидным кольцом в про-R конформации. Его сайт связывания имеет несколько особенностей, включая остаток цистеина, расположенный в непосредственной близости от никотинового кольца и скоба над рибозой аденозина, образованная остатками фенилаланина и лизина. Данная структура позволяет объяснить специфичность НАД в сравнении с НАДФ у различных членов семейства шикиматдегидрогеназ на основе вариативности аминокислотного сродства некоторых других остатков поблизости от этой рибозной группы. Между двумя доменами YdiB, в непосредственной близости от сайта акцептора гидрида на никотинамидном кольце, обнаружена полость, образованная остатками, которые на 100% консервативны для всех шикиматдегидрогеназ. Шикимат вписывается в этот сайт таким образом, что все его гетероатомы образуют сильные водородные связи с этими инвариантными остатками. Их строгая консервативность во всех ортологах способствует возможности расширения широкого спектра ингибиторов этого фермента. Природа и расположение активных остатков сайта позволяют предположить новый механизм реакции, в котором аспартат действует как общий кислотно-щелочной катализатор в процессе реакции переноса гидрида (Benach J., et. al., J Biol Chem. 23; 278(21): 19176-82 (2003)).

При образовании шикимовой кислоты генетически модифицированными Escherichia coli ранее было обнаружено, что условия избытка углерода (например, при лимите фосфора) благоприятствуют образованию шикимата, а не побочных продуктов пути синтеза шикимата, тогда как в условиях ограничения по углероду (глюкозе) ситуация противоположна. Проанализирован характер экспрессии генов продуцента шикимата W3110.shik1 (W3110 с делецией aroL и сверхэкспрессирующегося с плазмиды aroF) и штамма дикого типа, выращенных в хемостате (D=0.23/ч) в условиях ограничения по углероду и по фосфату. Результаты исследования позволяют предположить, что образование побочных продуктов в условиях ограничения по углероду объясняется активацией ряда генов пути биосинтеза шикимата. Гены ydiB, aroD и ydiN индуцировались только в W3110.shik1 в условиях ограничения по углероду. По сравнению с W3110 изменения lg(2) составляли: в 6.25 раз (ydiB); в 3.93 раз (aroD) и в 8.18 раз (ydiN). Кроме того, транскриптомный анализ выявил большие изменения при сравнении экспрессии в условиях ограничения по фосфату и по углероду, что в значительной степени может объясняться сопряжением анаболизма и катаболизма, которое имеет место при ограничении по фосфату и отсутствует при ограничении по углероду. Интересно, что при росте в условиях ограничения по углероду наблюдалось большее различие между штаммами, чем при росте в условиях ограничения по фосфату. Причина этого различия интерпретируется с точки зрения голодания по аминокислотам при ограничении по углероду, которое уменьшается при ограничении по фосфату благодаря активации aroK и aroA (Johansson L. and Liden G., J. Biotechnol. In Press, Corrected Proof, Available online 17 May 2006).

В настоящее время нет сообщений, описывающих использование ослабления экспрессии гена ydiN, или гена ydiB, или обоих генов для получения L-аминокислот.

Описание изобретения

Целями настоящего изобретения являются повышение продуктивности штаммов-продуцентов ароматической L-аминокислоты и предоставление способа получения L-аминокислот с использованием этих штаммов.

Вышеупомянутые цели были достигнуты путем установления того факта, что ослабление экспрессии гена ydiN, или гена ydiB, или обоих генов может привести к повышению продукции ароматических L-аминокислот, таких как L-фенилаланин, L-тирозин и L-триптофан.

Настоящее изобретение предоставляет бактерию семейства Enterobacteriaceae, обладающую способностью к повышенной продукции ароматических аминокислот, таких как L-фенилаланин, L-тирозин и L-триптофан.

Целью настоящего изобретения является предоставление бактерии-продуцента L-аминокислоты семейства Enterobacteriaceae, модифицированной таким образом, что экспрессия гена ydiN, или гена ydiB, или обоих генов в указанной бактерии ослаблена.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, в которой ослабление экспрессии указанного гена ydiN, или гена ydiB, или обоих генов осуществлено путем инактивации указанного гена ydiN, или гена ydiB, или обоих генов.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия принадлежит к роду Escherichia.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия принадлежит к роду Pantoea.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная ароматическая L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-фенилаланина, L-тирозина и L-триптофана.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа получения ароматической L-аминокислоты, который включает в себя:

- выращивание описанной выше бактерии в питательной среде,

- выделение указанной ароматической L-аминокислоты из культуральной жидкости.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, при этом указанная ароматическая L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-фенилаланина, L-тирозина и L-триптофана.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа получения сложного эфира низших алкилов α-L-аспартил-L-фенилаланина, включающего выращивание описанной выше бактерии в питательной среде с целью образования и накопления L-фенилаланина, при этом указанная бактерия обладает способностью к продукции L-фенилаланина, и синтез сложного эфира низших алкилов α-L-аспартил-L-фенилаланина из аспарагиновой кислоты или ее производных и полученного L-фенилаланина.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, дополнительно включающего этерифицирование L-фенилаланина с целью образования сложного эфира низшего алкила L-фенилаланина, конденсирование сложного эфира низшего алкила L-фенилаланина с производным аспарагиновой кислоты, при этом указанным производным является N-ацил-ангидрид L-аспарагиновой кислоты, выделение сложного эфира низших алкилов N-ацил-α-L-аспартил-L-фенилаланина из реакционной смеси и гидрогенизирование сложного эфира низших алкилов N-ацил-α-L-аспартил-L-фенилаланина для образования сложного эфира простых алкилов α-L-аспартил-L-фенилаланина.

Более детально настоящее изобретение описано ниже.

Наилучший способ осуществления настоящего изобретения

1. Бактерия согласно настоящему изобретению

Бактерия согласно настоящему изобретению - это бактерия-продуцент ароматической L-аминокислоты семейства Enterobacteriaceae, модифицированная таким образом, что экспрессия гена ydiN, или гена ydiB, или обоих генов в указанной бактерии ослаблена.

Согласно настоящему изобретению «бактерия-продуцент ароматической L-аминокислоты» означает бактерию, обладающую способностью к продукции и выделению ароматической L-аминокислоты в питательную среду, когда бактерия согласно настоящему изобретению выращивается в указанной питательной среде.

Используемый здесь термин «бактерия-продуцент ароматической L-аминокислоты» также означает бактерию, которая способна к продукции ароматической L-аминокислоты и вызывает накопление ароматической L-аминокислоты в ферментационной среде в больших количествах по сравнению с природным или родительским штаммом Е.coli, таким как штамм Е.coli K-12, и предпочтительно означает, что указанный микроорганизм способен накапливать в среде целевую L-аминокислоту в количестве не менее, чем 0.5 г/л, более предпочтительно не менее, чем 1.0 г/л. Термин «ароматическая L-аминокислота» включает в себя L-фенилаланин, L-тирозин и L-триптофан.

Семейство Enterobacteriaceae включает в себя бактерии, принадлежащие к родам Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pantoea, Photorhabdus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Morganella, Yersinia и т.д. Более конкретно, могут быть использованы бактерии, классифицируемые как принадлежащие к семейству Enterobacteriaceae в соответствии с таксономией, используемой в базе данных NCBI (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbinpost/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347). Предпочтительна бактерия, принадлежащая к роду Escherichia или Pantoea.

Термин "бактерия, принадлежащая к роду Escherichia" означает, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, использованного в настоящем изобретении, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (Е.coli).

Круг бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, не ограничен каким-либо образом, однако, например, бактерии, описанные в книге Neidhardt, F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Таблица 1), могут быть включены в число бактерий согласно настоящему изобретению.

Термин «бактерия, принадлежащая к роду Pantoea» означает, что бактерия относится к роду Pantoea в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. Недавно несколько видов Enterobacter agglomerans были классифицированы как Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii или подобные им, на основе анализа нуклеотидной последовательности 16S рРНК и т.д. (Int. J. Syst. Bacteriol., 43, 162-173 (1993)).

Термин «бактерия модифицирована таким образом, что экспрессия гена ydiN, или гена ydiB, или обоих генов ослаблена» означает, что указанная бактерия была модифицирована таким образом, что в результате модификации такая бактерия содержит пониженное количество белка YdiN, или белка YdiB, или обоих белков по сравнению с немодифицированной бактерией, или указанная бактерия не способна синтезировать белок YdiN, или белок YdiB, или оба белка.

Термин «инактивация гена ydiN, или гена ydiB, или обоих генов» означает, что естественная экспрессия модифицированного участка ДНК невозможна из-за делеции данного гена или его части или модификации примыкающих к гену областей, которые включают последовательности, контролирующие экспрессию гена, такие как промоторы, энхансеры, аттенуаторы и т.д.

Наличие или отсутствие гена ydiN gene и гена ydiB на хромосоме бактерии можно определить известными методами, включая ПЦР, блоттинг по Саузерну и т.п. Кроме того, уровни экспрессии гена можно оценить определением количества транскрибируемой с гена РНК с использованием различных известных методов, включая блоттинг по Нозерну, количественную ОТ-ПЦР и т.п. Количества или молекулярные массы кодируемых генами белков могут быть определены известными методами, включая SDS-ПААГ-электрофорез с последующим иммуноблотингом ПЦР (блоттинг по Вестерну) и т.п..

Ген ydiN (синонимы: ЕСК1689, b1691) кодирует белок YdiN (синоним: В1691). Ген ydiN (нуклеотиды с 1,770,536 по 1,771,801 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi: 49175990) расположен между открытой рамкой считывания ydiM и геном ydiB на хромосоме штамма Е.coli K-12. Нуклеотидная последовательность гена ydiN и аминокислотная последовательность YdiN, кодируемого геном ydiN, приведены в Перечне последовательностей под номерами 1 (SEQ ID NO: 1) и 2 (SEQ ID NO: 2) соответственно. Ген ydiB (синонимы: ECK1690, b1692) кодирует белок YdiB (синоним: В 1692). Ген ydiB (нуклеотиды с 1,771,813 по 1,772,679 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi: 49175990) расположен между геном ydiN и геном aroD на хромосоме штамма Е.coli K-12. Нуклеотидная последовательность гена ydiB и аминокислотная последовательность YdiB, кодируемого геном ydiB, приведены в Перечне последовательностей под номерами 3 (SEQ ID NO: 3) и 4 (SEQ ID NO: 4) соответственно.

Поскольку у представителей различных родов и штаммов семейства Enterobacteriaceae возможны некоторые вариации в нуклеотидных последовательностях, понятие инактивируемого гена не ограничивается генами, последовательности которых приведены в Перечне последовательностей под номерами 1 (SEQ ID No: 1) и 3 (SEQ ID No: 3), но также может включать и гены, гомологичные SEQ ID No:1 и SEQ ID No: 3, кодирующие варианты белков YdiN и YdiB. Термин «вариант белка» в значении, в котором он используется в настоящем изобретении, означает белок, имеющий изменения в аминокислотной последовательности, а именно делеции, вставки, добавления или замены аминокислот. Количество изменений в варианте белка зависит от положения аминокислотного остатка в трехмерной структуре или его типа. Количество изменений может быть от 1 до 30, предпочтительно от 1 до 15 и наиболее предпочтительно от 1 до 5 изменений в последовательностях SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4. Данные изменения в вариантах белка являются консервативными мутациями, при которых сохраняется функция белка. Другими словами, данные изменения могут иметь место в областях белка, некритичных для его трехмерной структуры. Это становится возможным благодаря тому, что некоторые аминокислоты обладают высокой гомологией друг к другу, и поэтому третичная структура при таких заменах не нарушается. Консервативная мутация - это мутация, при которой имеют место взаимные замены среди Phe, Trp, Tyr, если сайт замены - ароматическая аминокислота; среди Leu, Ile, Val, если сайт замены - гидрофобная аминокислота; между Gln, Asn, если сайт замены - положительно заряженная аминокислота; среди Lys, Arg, His, если сайт замены - основная аминокислота; между Asp, Glu, если сайт замены - кислая аминокислота и между Ser, Thr, если это аминокислота с гидроксильной группой. Консервативные замены являются типичными консервативными мутациями. Примеры консервативных замен включают замену Ala на Ser или Thr, замену Arg на Gln, His или Lys, замену Asn на Glu, Gln, Lys, His или Asp, замену Asp на Asn, Glu или Gln, замену Cys на Ser или Ala, замену Gln на Asn, Glu, Lys, His, Asp или Arg, замену Glu на Asn, Gln, Lys или Asp, замену Gly на Pro, замену His на Asn, Lys, Gln, Arg или Tyr, замену Ile на Leu, Met, Val или Phe, замену Leu на Ile, Met, Val или Phe, замену Lys на Asn, Glu, Gln, His или Arg, замену Met на Ile, Leu, Val или Phe, замену Phe на Trp, Tyr, Met, Ile или Leu, замену Ser на Thr или Ala, замену Thr на Ser или Ala, замену Trp на Phe или Tyr, замену Tyr на His, Phe или Trp, и замену Val на Met, Ile или Leu. Описанные выше замены, делеции, вставки, добавления, перестановки и т.п. одного или нескольких аминокислотных остатков включают природные мутации (мутант или вариант) в зависимости от видовых различий или индивидуальных различий микроорганизмов, содержащих гены ydiN или ydiB. Такой ген может быть получен модифицированием нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 1 или 3 с использованием, например, сайт-специфического мутагенеза, таким образом, что сайт-специфический аминокислотный остаток в кодируемом белке включает замены, делеции, вставки или добавления.

Кроме того, варианты белков, кодируемых генами ydiN и ydiB, могут иметь гомологию не менее 80%, предпочтительно не менее 90% и наиболее предпочтительно не менее 95% по отношению к полной аминокислотной последовательности, показанной в Перечне последовательностей под номерами 2 (SEQ ID No: 2) и 4 (SEQ ID No: 4) соответственно. Активность белка YdiB может быть измерена методом, описанным в (Benach J., et. al., J Biol Chem. 23; 278(21): 19176-82 (2003) или Michel G., et al. (J Biol Chem. 23; 278(21):19463-72(2003)).

Кроме того, ген ydiN и ген ydiN могут быть вариантами, которые гибридизуются в жестких условиях с нуклеотидными последовательностями, приведенными в Перечне последовательностей под номерами 1 (SEQ ID No: 1) и 3 (SEQ ID No: 3), или с зондом, который может быть синтезирован на основе указанной нуклеотидной последовательности. «Жесткие условия» включают такие условия, при которых специфические гибриды, например гибриды с гомологией не менее 60%, предпочтительно не менее 70%, более предпочтительно не менее 80%, еще более предпочтительно не менее 90% и наиболее предпочтительно не менее 95%, образуются, а неспецифические гибриды, например гибриды с меньшей гомологией, чем указано выше, - не образуются. Практическим примером жестких условий является однократная отмывка, предпочтительно двух- или трехкратная, при концентрации солей 1×SSC, 0.1% SDS, предпочтительно 0.1×SSC, 0.1% SDS, при 60°С. Продолжительность отмывки зависит от типа используемой для блоттинга мембраны и, как правило, такова, как рекомендовано производителем. Например, рекомендуемая продолжительность отмывки для нейлоновой мембраны Hybond™ N+(Amersham) при строгих условиях - 15 минут. Предпочтительна двух-, трехкратная отмывка. Длина зонда может быть выбрана в зависимости от условий гибридизации, обычно от 100 н.п. до 1 т.н.п.

Гомология между последовательностями аминокислот может быть определена с использованием известных методов, например компьютерной программы BLAST 2.0.

Экспрессия гена ydiN, или гена ydiB, или обоих генов может быть ослаблена введением мутации в ген на хромосоме, при которой внутриклеточная активность белка, кодируемого геном, снижена или отсутствует по сравнению с немодифицированным штаммом. Такой мутацией гена может быть вставка гена устойчивости к антибиотику, или делеция гена или его части (Qiu, Z. and Goodman, M.F., J. Biol. Chern., 272, 8611-8617 (1997); Kwon, D.H. et al, J. Antimicrob. Chemother., 46, 793-796 (2000)). Экспрессия гена ydiN, или гена ydiB, или обоих генов также может быть ослаблена модификацией регуляторных последовательностей, таких как промотор или последовательность Shine-Dalgarno (SD) (заявка РСТ WO 95/34672; Carrier, T.A. and Keasling, J.D., Biotechnol Prog 15, 58-64 (1999)).

Например, следующие методы могут применяться для введения мутаций путем генной рекомбинации. Конструируется мутантный ген, и бактерия для ее модификации трансформируется фрагментом ДНК, содержащим мутантный ген. Затем нативный ген на хромосоме замещается гомологичной рекомбинацией мутантным геном, отбирается полученный штамм. Такое замещение гена с использованием гомологичной рекомбинации может быть проведено методом с использованием линейной ДНК, известным как "Red-зависимая интеграция" или "интеграция посредством Red-системы" (Datsenko, K.A., Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 12, 6640-6645 (2000), заявка РСТ WO 2005/010175) или методом с использованием плазмиды, репликация которой чувствительна к температуре (патент США 6,303,383 или патентная заявка Японии JP 05-007491А). Далее, введение сайт-специфической мутации путем замещения гена с использованием вышеупомянутой гомологичной рекомбинации может также быть осуществлено с использованием плазмиды с пониженной способностью к репликации в клетке хозяина.

Экспрессия гена также может быть ослаблена вставкой транспозона или IS фактора в кодирующую область гена (патент США 5,175,107), или традиционными методами, такими как мутагенез с использованием УФ излучения или обработка нитрозогуанидином (N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин).

Инактивация гена также может быть осуществлена традиционными методами, такими как мутагенез с использованием УФ излучения или обработка нитрозогуанидином (N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин), сайт-специфический мутагенез, разрушение гена с использованием гомологичной рекомбинации, или/и мутагенез вставкой-делецией (Yu, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12: 5978-83 and Datsenko, K.A. and Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12: 6640-45) также называемый "Red-зависимая интеграция".

Приведенное выше описание, касающееся вариантов белков, инактивации гена и других методов, может быть применимо к другим белкам, генам и конструированию бактерий, приведенным ниже.

Методы приготовления плазмидной ДНК, рестрикции и лигирования ДНК, трансформации, выбора нуклеотидов в качестве праймера и т.п. могут быть обычными методами, известными специалисту в этой области. Эти методы описаны, например, в Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, Т., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

Бактерия - продуцент ароматической L-аминокислоты

В качестве бактерии согласно настоящему изобретению, модифицированной таким образом, что экспрессия гена ydiN, или гена ydiB, или обоих генов ослаблена, может быть использована бактерия, способная к продукции ароматической или неароматической L-аминокислоты.

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем ослабления экспрессии гена ydiN, или гена ydiB, или обоих генов в бактерии, уже обладающей способностью к продукции ароматических L-аминокислот. С другой стороны, бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем придания бактерии, в которой экспрессия гена ydiN, или гена ydiB, или обоих генов уже ослаблена, способности к продукции ароматических L-аминокислот.

L-триптофан, L-фенилаланин и L-тирозин являются ароматическими аминокислотами и имеют общий путь биосинтеза. Примеры генов, кодирующих ферменты биосинтеза этих ароматических аминокислот, включают гены, кодирующие дезоксиарабиногептулозонатфосфатсинтазу (aroG), 3-дегидрохиннатсинтазу (aroB), шикиматдегидрогеназу, шикиматкиназу (aroL), 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу (aroA) и хоризматсинтазу (aroC) (EP763127). Следовательно, способность к продукции ароматических аминокислот может быть усилена увеличением числа копий генов, кодирующих эти ферменты, на плазмиде или хромосоме. Известно, что эти гены могут контролироваться регулятором транскрипции (tyrR), поэтому активность ферментов биосинтеза ароматических аминокислот может также быть увеличена путем делеции гена tyrR (EP 763127).

Для увеличения продукции ароматических аминокислот в бактерии может быть ослаблен биосинтез других аминокислот, иных чем целевая ароматическая аминокислота. Например, когда целевая аминокислота- L-триптофан может быть ослаблен биосинтез L-фенилаланина и/или L-тирозина (US 4,371,614). Кроме того, 3-дезокси-D-арабиногептулозонат-7-фосфатсинтетаза (DS), кодируемая генами aroF или aroG, подвержена ингибированию по типу обратной связи ароматическими аминокислотами. Следовательно, бактерия может быть модифицирована таким образом, чтобы содержать мутантную DS, не подверженную ингибированию по типу обратной связи. Такая мутантная DS может быть получена, например, заменой в aroF L-аспарагановой кислоты в положении 147 или L-серина в положении 181 на другую аминокислоту. В случае aroG мутантная DS может быть получена, например, заменой L-аспарагиновой кислоты в положении 146, L-метионина в положении 147, L-пролина в положении 150 или L-аланина в положении 202 на другую аминокислоту или заменой L-метионина в положении 157 и L-аланина в положении 219 на другую аминокислоту. Бактерия - продуцент ароматической L-аминокислоты может быть получена введением в бактерию мутантного гена, кодирующего такую матантную DS (EP 0488424). В особенности предпочтителен мутантный ген aroG (aroG4), в котором L-пролин в положении 150 заменен на L-лейцин. Нуклеотидные последовательности гена aroG дикого типа и аминокислотная последовательность DS, кодируемой геном aroG, приведены в Перечне последовательностей (SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20 соответственно).

Бактерия-продуцент L-фенилаланина

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-фенилаланина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (ВКМП В-8197); штамм HW1089 (АТСС-55371), содержащий ген pheA34 (патент США 5354672); мутантный штамм MWEC101-b (KR8903681); штаммы NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL В-12146 и NRRL В-12147 (патент США 4407952) и подобные им. Также в качестве родительских штаммов могут быть использованы бактерии, принадлежащие к роду Escherichia, - продуценты L-фенилаланина, такие как штамм E.coli K-12 [W3110(tyrA)/pPHAB] (FERM BP-3566), штамм E.coli K-12 [W3110(tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659), штамм E.coli К-12 [W3110(tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662) и штамм E.coli K-12 [W3110(tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB], названный как AJ12604 (FERM BP-3579) (Европейский патент ЕР 488424 В1). Кроме того, также могут быть использованы бактерии-продуценты L-фенилаланина, принадлежащие к роду Escherichia с повышенной активностью белков, кодируемых геном yedA или геном yddG (патентные заявки США 2003/0148473 А1 и 2003/0157667 A1).

Бактерия-продуцент L-триптофана

Примеры родительских штаммов, которые могут использоваться для получения бактерии-продуцента L-триптофана согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются ими, штаммы, принадлежащие к роду Escherichia, такие как Е.coli JP 4735/pMU3028 (DSM10122) и JP6015/pMU91 (DSM10123), лишенные активности триптофанил-тРНК синтетазы, кодируемой мутантным геном trpS (патент США 5756345); Е.coli SV164 (pGH5).

Е.coli SV164 (pGH5) содержит аллель serA, кодирующий фосфоглицератдегидрогеназу, не ингибируемую серином по типу обратной связи и аллель trpE, кодирующий антранилатсинтазу, не ингибируемую триптофаном по типу обратной связи (патент США 6180373). Нуклеотидная последовательность гена serA дикого типа и аминокислотная последовательность фосфоглицератдегидрогеназы, кодируемой геном serA, приведены в Перечне последовательностей (SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 18 соответственно).

Согласно описанию WO 94/08031 (International Patent Unexamined Publication in Japanese (Kohyo) No. 7-507693), в дефицитный по trpE штамм, Escherichia coli KB862 (DSM7196), был введен мутантный ген, кодирующий антранилатсинтазу, не подверженную ингибированию по типу обратной связи (также называемую далее "десенсибилизированная AS") для получения Escherichia coli SV164 (trpE8). В этот штамм SV164 была введена плазмида pGH5 (описана в WO 94/08031), содержащая ген serA 5, кодирующий фосфоглицератдегидрогеназу, не подверженную ингибированию по типу обратной связи (также называемую далее "десенсибилизированная PGD"). Штамм SV164/pGH5 способен к продукции триптофана и серина (US 7,045,320).

Escherichia coli KB862 был переименован в AJ13828 и согласно условиям Будапештского Договора, 21 декабря 2000 г.депонирован в National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (в настоящее время National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6, 1-1 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan) в качестве международного депонирующего органа, с инвентарным номером FERM ВР-7405.

Также могут быть использованы штаммы Е.coli AGX17 (pGX44) (NRRL В-12263) и AGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264), в которых отсутствует активность триптофаназы (патент США 4371614); штамм Е.coli AGX17/pGX50, pACKG4-pps, в котором усилена способность к синтезу фосфоенолпирувата (заявка РСТ WO 9708333, патент США 6319696), и подобные им. Также могут быть использованы бактерии-продуценты L-триптофана, принадлежащие к роду Escherichia, в которых увеличена активность белка, кодируемого геном yedA или геном yddG (заявки на патент США 2003/0148473 А1 и 2003/0157667 А1).

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-триптофана, согласно настоящему изобретению также включают в себя штаммы, в которых увеличена активность одного или нескольких ферментов, выбранных из группы, состоящей из антранилатсинтазы (trpE), фосфоглицератдегидрогеназы (serA) и триптофансинтазы (trpAB). И антранилатсинтаза, и фосфоглицератдегидрогеназа подвержены ингибированию L-триптофаном и L-серином по типу обратной связи, так что в эти ферменты могут быть введены мутации, снижающие чувствительность к ингибированию по типу обратной связи. Конкретные примеры штаммов с такой мутацией включают Е.coli SV164, антранилатсинтаза которой не чувствительна к ингибированию по типу обратной связи, и штамм-трансформант, полученный введением в Е.coli SV164 плазмиды pGH5 (заявка РСТ WO 94/08031), которая содержит мутантный ген serA, кодирующий фосфоглицератдегидрогеназу, которая не чувствительна к ингибированию по типу обратной связи.

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-триптофана, согласно настоящему изобретению также включают в себя штаммы, в которые введен триптофановый оперон, содержащий ген, кодирующий антранилатсинтазу, которая не чувствительна к ингибированию по типу обратной связи (заявка Японии 57-71397 А, заявка Японии 62-244382 А, патент США 4,371,614). Кроме того, способность к продукции L-триптофана может быть придана путем усиления экспрессии гена (из триптофанового оперона), кодирующего триптофансинтазу (trpBA). Триптофансинтаза состоит из двух субъединиц α и β, которые кодируются trpA и trpB соответственно. Кроме того, способность к продукции L-триптофана может быть увеличена усилением экспрессии оперона изоцитратлиазы-малатсинтазы (заявка РСТ WO 2005/103275).

Примеры родительских штаммов, которые могут быть использованы для получения бактерии-продуцента L-триптофана, согласно настоящему изобретению также включают в себя штаммы, в которые путем трансформации введен оперон, содержащий ген, кодирующий устойчивую к ингибированию по типу обратной связи фосфоглицератдегидрогеназу и ген, кодирующий устойчивую к ингибированию по типу обратной связи 3-дезокси-D-арабиногептулозонат-7-фосфатсинтетазу. Конкретные примеры таких штаммов включают штамм Е.coli SV164(P_tac-ideal→aroG4-serA5), содержащий оперон P_tac-ideal→aroG4-serA5, интегрированный в хромосому в точке 2.933.542 в составе экспрессионной кассеты из плазмиды pMDV3-aroG4-serA5. Интегративная плазмида pMDV3-aroG4-serA5 сконструирована на основе интегративной плазмиды pMDV3 (Zimenkov D. et al., Biotechnology in Russia, 6, 1-22 (2004)). В pMDV3 клонированы два фрагмента ДНК. Первый фрагмент- BglII-XbaI фрагмент ДНК плазмиды pMW118-P_tac-ideal-lacZ-ter_rrnB (Mashko S. et. al., Biotechnology in Russia, 5, 3-20 (2001)),

содержащий промотор P_tac-ideal (O_lac-ideal-P_tac/O_lac). Второй фрагмент ДНК - XbaI-EcoRI фрагмент полилинкера плазмиды pMW118 (GenBank/EMBL, инвентарный номер АВ005475). Далее в полученной плазмиде клонировали амплифицированный фрагмент ДНК, содержащий aroG4, для ПЦР использовались плазмида pAROG4 (Kikuchi Y. et. al., Appl. And Env. Microb., 761-2 (1997)) в качестве матрицы и праймеры P1 (SEQ ID NO: 5) и P2 (SEQ ID NO: 6), содержащие сайты узнавания рестриктаз XbaI и SmaI соответственно. Плазмида pAROG4 содержит ген aroG4, кодирующий 3-дезокси-D-арабиногептулозонат-7-фосфат (DAHP)-синтазу, не подверженную ингибированию фенилаланином по типу обратной связи. Полученная плазмида pMDV-aroG4 использовалась в качестве вектора для клонирования структурной части serA5. Амплифицированный фрагмент ДНК, содержащий serA5, получен с использованием ПЦР, для ПЦР использовались плазмида pGH5 (US Patent 6180373) в качестве матрицы и праймеры P3 (SEQ ID NO: 7) и P4 (SEQ ID NO: 8). Плазмида pGH5 содержит ген serA5, кодирующий фосфоглицератдегидрогеназу, не подверженную ингибированию серином по типу обратной связи. Данный амплифицированный фрагмент содержал сайт узнавания рестриктазы SmaI в 5'-области гена serA5 и сайты узнавания рестриктаз SalI, SphI, SacI в 3'-области гена serA5. Этот фрагмент ДНК клонирован в плазмиду pMDV-aroG4 по сайтам узнавания рестриктаз SmaI и SacI. Полученная интегративная плазмида pMDV3-aroG4-serA5 содержала оперон P_tac-ideal→aroG4-serA5.

2. Способ согласно настоящему изобретению.

Способом согласно настоящему изобретению является способ получения ароматической L-аминокислоты, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления ароматической L-аминокислоты в питательной среде, и выделения ароматической L-аминокислоты из культуральной жидкости.

Согласно настоящему изобретению выращивание, выделение и очистка ароматической L-аминокислоты из культуральной или подобной ей жидкости может быть осуществлена способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых аминокислота продуцируется с использованием бактерии.

Выбранная для выращивания питательная среда может быть как синтетической, так и натуральной, при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и, если необходимо, соответствующее количество питательных добавок, необходимых для роста микроорганизмов. К источникам углерода относятся различные углеводы, такие как глюкоза и сахароза, а также различные органические кислоты. В зависимости от характера ассимиляции выбранного микроорганизма могут использоваться спирты, такие как этанол и глицерин. В качестве источника азота могут использоваться различные неорганические соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов, ферментолизат микроорганизмов. В качестве минеральных добавок могут использоваться фосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные им соединения. В качестве витаминов могут использоваться тиамин, дрожжевой экстракт и т.п.

Выращивание осуществляется предпочтительно в аэробных условиях, таких как перемешивание культуральной жидкости на качалке, взбалтывание с аэрацией, при температуре в пределах от 20 до 40°С, предпочтительно в пределах от 30 до 38°С. рН среды поддерживают в пределах от 5 до 9, предпочтительно от 6.5 до 7.2. рН среды может регулироваться аммиаком, карбонатом кальция, различными кислотами, основаниями и буферными растворами. Обычно выращивание в течение от 1 до 5 дней приводит к накоплению целевой ароматической L-аминокислоты в культуральной среде.

После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрацией через мембрану, а затем ароматическая L-аминокислота может быть выделена и очищена методами ионообменной хроматографии, концентрирования и/или кристаллизации.

Фенилаланин, образующийся способом настоящего изобретения, может использоваться, например, для получения сложного эфира низших алкилов α-L-аспартил-L-фенилаланина (также называемого "аспартам"). А именно способ настоящего изобретения включает способ получения сложного эфира низших алкилов α-L-аспартил-L-фенилаланина с использованием L-фенилаланина в качестве сырья. Способ включает синтез сложного эфира низших алкилов α-L-аспартил-L-фенилаланина из L-фенилаланина, получаемого описанным выше способом настоящего изобретения, и аспарагиновой кислоты или ее производных. В качестве сложных эфиров низших алкилов могут быть упомянуты метиловый эфир, этиловый эфир, пропиловый эфир и т.п.

В способе настоящего изобретения процесс синтеза сложного эфира низших алкилов α-L-аспартил-L-фенилаланина из L-фенилаланина и аспарагиновой кислоты или ее производных никак особо не ограничивается, и может использоваться любой традиционный способ при условии, что для синтеза сложного эфира низших алкилов α-L-аспартил-L-фенилаланина могут использоваться L-фенилаланин или его производные. Конкретно, сложный эфир низших алкилов α-L-аспартил-L-фенилаланин может быть получен, например, следующим способом (U.S. Pat. No. 3,786,039). L-фенилаланин этерифицируется с целью получения сложного эфира низшего алкила L-фенилаланина. Сложный эфир низшего алкила L-фенилаланина взаимодействует с производным L-аспарагиновой кислоты, у которого аминогруппа и β-карбоксильная группа защищены, а α-карбоксильная группа свободна для этерификации. К производным относятся N-ацилангидрид L-аспарагиновой кислоты, такой как N-формил-, N-карбобензокси- или N-p-метоксикарбобензокси-ангидрид L-аспарагиновой кислоты. При реакции конденсации образуется смесь N-ацил-α-L-аспартил-L-фенилаланина и N-ацил-β-L-аспартил-L-фенилаланина. Если реакция осуществляется в присутствии органической кислоты, константа диссоциации которой при 37°С 10^-4 или менее, отношение α-формы к β-форме в смеси увеличивается (Japanese Patent Laid-Open Publication No. 51-113841). Затем N-ацил-α-L-аспартил-L-фенилаланин выделяется из смеси и гидрогенизируется с целью получения α-L-аспартил-L-фенилаланина.

Краткое описание чертежей

На Фиг.1 изображены относительные положения праймеров Р5/9/5 и Р6/10/10 на плазмиде pMW118-attL-Cm-attR, используемой для ПЦР-амплификации гена cat.

На Фиг.2 изображено конструирование фрагмента хромосомной ДНК, содержащего инактивированный(-ые) целевой(-ые) ген(-ы).

Примеры

Настоящее изобретение будет более подробно описано ниже со ссылкой на следующие не ограничивающие настоящее изобретение Примеры.

Пример 1. Конструирование штамма с инактивированным геном ydiN

1. Делеция гена ydiN

Делецию гена ydiN осуществляли с использованием методики, разработанной Datsenko, К.А. и Wanner, B.L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12), 6640-6645), известной как "Red-зависимая интеграция". Фрагмент ДНК, содержащий маркер Cm^R, кодируемый геном cat, был получен при помощи ПЦР с использованием праймеров Р5 (SEQ ID NO: 9) и Р6 (SEQ ID NO: 10) и плазмиды pMW118-attL-Cm-attR в качестве матрицы (заявка РСТ WO 05/010175). Праймер Р5 содержит участок ДНК размером в 36 п.н., комплементарный участку ДНК, расположенному на 5'-конце гена ydiN, -tt- нуклеотиды для предотвращения сдвига рамки считывания и участок ДНК размером 28 п.н., комплементарный участку ДНК, расположенному на 3'-конце области attR. Праймер Р6 содержит участок ДНК размером в 36 п.н., комплементарный участку ДНК, расположенному на 3'-конце гена ydiN, и участок ДНК размером 28 п.н., комплементарный участку ДНК, расположенному на 5'-конце области attL. Использовали следующий температурный профиль для ПЦР: денатурация при 95°С в течение 3 мин; два первых цикла: 1 мин при 95°С, 30 сек при 50°С, 40 сек при 72°С; последующие 25 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 54°С, 40 сек при 72°С; и заключительная полимеризация: 5 мин при 72°С.

Полученный ПЦР-продукт длиной 1711 п.н. (Фиг.1), очищенный в агарозном геле, был использован для электропорации в штамм E.coli MG1655 (АТСС 700926), содержащий плазмиду pKD46 с термочувствительным репликоном. Плазмида pKD46 (Datsenko, K.A. and Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645) содержит ДНК-фрагмент фага λ длиной 2154 п.н. (позиции с 31088 по 33241 нуклеотидной последовательности с инвентарным номером J02459 в базе данных GenBank), а также содержит гены λ Red-гомологичной системы рекомбинации (гены γ, β, ехо) под контролем промотора P_araB, индуцируемого арабинозой. Плазмида pKD46 необходима для интеграции продукта ПЦР в хромосому штамма MG1655. Штамм MG1655 можно получить в American Type Culture Collection (P.O. Box 1549 Manassas, VA 20108, U.S.A.).

Электрокомпетентные клетки были получены следующим образом: ночную культуру штамма Е.coli MG1655 выращивали при 30°С в среде LB с добавкой ампициллина (100 мг/л), разводили в 100 раз, добавив 5 мл среды SOB (Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), содержащей ампициллин и L-арабинозу (1 мМ). Полученную культуру растили с перемешиванием при 30°С до достижения OD₆₀₀≈0.6, после чего делали клетки электрокомпетентными, путем концентрирования в 100 раз и трехкратного отмывания ледяной деионизированной Н₂О. Электропорацию проводили с использованием 70 мкл клеток и ≈100 нг ПЦР-продукта. После электропорации клетки инкубировали в 1 мл среды SOC (Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) при 37°С в течение 2.5 часов, после чего высевали на чашки с L-агаром, содержащим 30 мкг/мл хлорамфеникола, и выращивали при 37°С для отбора Cm^R-рекомбинантов. Затем для удаления плазмиды pKD46 проводили 2 пассажа на L-агаре с Cm при 42°С, и полученные колонии проверяли на чувствительность к ампициллину.

2. Подтверждение делеции гена ydiN с помощью ПЦР.

Мутанты с делетированным геном ydiN, содержащие ген устойчивости Cm, были проверены с помощью ПЦР. Локус-специфичные праймеры Р7 (SEQ ID NO: 11) и Р8 (SEQ ID NO: 12) были использованы для проверки делеции с помощью ПЦР. Использовался следующий температурный профиль для ПЦР-проверки: денатурация при 94°С в течение 3 мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 94°С, 30 сек при 54°С, 1 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С. Длина продукта ПЦР, полученного в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток родительского штамма ydiN + MG1655, составляет 1461 п.н. Длина продукта ПЦР, полученного в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток мутантного штамма, составляет 1900 п.н. (Фиг.2). Мутантный штамм был назван MG1655 ΔydiN::cat.

Пример 2. Продукция L-фенилаланина штаммом Е.coli AJ12739-ΔydiN.

Для оценки влияния инактивации гена ydiN на продукцию L-фенилаланина ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655 ΔydiN::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент L-фенилаланина Е.coli AJ12739 с помощью Р1-трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY) с целью получения штамма AJ12739-ΔydiN::cat. Штамм AJ12739 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 117545 Москва, 1^ый Дорожный проезд, 1) 6 ноября 2001 года с инвентарным номером ВКПМ В-8197, затем 23 августа 2002 г. было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора.

Далее ген устойчивости к Cm (ген cat) может быть элиминирован из хромосомы штамма AJ12739-ΔydiN::cat с использованием int-xis системы. С этой целью штамм AJ12739-ΔydiN::cat может быть трансформирован плазмидой pMWts-Int/Xis (WO 2005010175). Селекция трансформированных клонов может быть произведена с использованием среды LB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл). Чашки могут быть инкубированы в течение ночи при 30°С. Ген cat может быть удален из трансформированных клонов путем выращивания отдельных колоний при 37°С (при этой температуре репрессор CIts в некоторой мере инактивируется, тогда как гены int/xis активируются) с последующей селекцией вариантов Cm^SAp^R. Удаление гена cat из хромосомы штаммов может быть подтверждено при помощи ПЦР. Локус-специфичные праймеры Р7 (SEQ ID NO: 11) и Р8 (SEQ ID NO: 12) могут быть использованы для такого подтверждения путем ПЦР. Условия проведения ПЦР могут быть такими же, как описано выше. Продукт ПЦР, полученный в случае клеток с удаленным геном cat, должен быть длиной в 294 п.н. Таким образом, может быть получен штамм AJ12739-ΔydiN, в котором инактивирован ген ydiN и из которого удален ген cat.

Оба штамма, AJ12739 и AJ12739-ΔydiN, могут быть выращены при 37°С в течение 18 часов в питательном бульоне, 0.3 мл полученных культур может быть внесено в 3 мл ферментационной среды в пробирки размером 20×200 мм, и культуры могут быть выращены при 37°С в течение 48 часов на роторной качалке. По окончании ферментации количество накопленного в среде фенилаланина может быть определено с помощью тонкослойной хроматографии (TLC). Для этой цели могут быть использованы TLC-пластинки размером 10×15 см, покрытые 0.11 мм-слоем силикагеля Сорбфил без флуоресцентного индикатора (Акционерное Общество Сорбполимер, Краснодар, Россия). Пластинки Сорбфил могут быть экспонированы в подвижной фазе следующего состава: пропан-2-ол: этилацетат: 25% водного аммиака: вода = 40:40:7:16 (v/v). Раствор (2%) нингидрина в ацетоне может быть использован для визуализации.

Может быть использована ферментационная среда следующего состава, г/л:

Глюкозу и сульфат магния стерилизуют отдельно. СаСО₃ стерилизуют сухим жаром при 180°С в течение 2 часов. рН доводят до 7.0.

Пример 3. Продукция L-триптофана штаммом Е.coli SV164 (P_tac-ideal→aroG4-serA5)-ΔydiN.

Для оценки влияния инактивации гена ydiN на продукцию L-триптофана ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655 ΔydiN::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент L-триптофана Е.coli SV164 (P_tac-ideal→aroG4-serA5) с помощью P1-трансдукции с целью получения штамма SV164 (P_tac-ideal→aroG4-serA5)-ΔydiN::cat. Штамм SV164 содержит аллель trpE, кодирующий антранилатсинтазу, не подверженную ингибированию триптофаном по типу обратной связи. Штамм SV164 (P_tac-ideal→aroG4-serA5) содержит оперон P_tac-ideal→aroG4-serA5, интегрированный в хромосому в точке 2.933.542 в составе экспрессионной кассеты из плазмиды pMDV3-aroG4-serA5. Нуклеотидная последовательность оперона Р_tac-ideal→aroG4-serA5 представлена в Перечне последовательностей (SEQ ID NO: 21). Положение генов в опероне следующее: P_tac-ideal (1 to 116), aroG4 (133 to 1185) и serA5 (1209 to 2438). В гене aroG4 L-пролин в положении 150 в дезоксиарабино-гептулозонатфосфатсинтазе дикого типа (SEQ ID NO: 20) заменен на L-лейцин. В гене serA5 удален остаток тирозина в положении 410 в фосфоглицератдегидрогеназе дикого типа (SEQ ID NO: 18).

Далее ген устойчивости к Cm (ген cat) может быть элиминирован из хромосомы штамма SV164 (P_tac-ideal→aroG4-serA5)-ΔydiN::cat с использованием int-xis системы. Для этого штамм SV164 (P_tac-ideal→aroG4-serA5)-ΔydiN::cat может быть трансформирован плазмидой pMWts-Int/Xis. Селекция трансформированных клонов может быть произведена с использованием среды LB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл). Чашки могут быть инкубированы в течение ночи при 30°С. Ген cat может быть удален из трансформированных клонов путем выращивания отдельных колоний при 37°С (при этой температуре репрессор CIts в некоторой мере инактивируется, тогда как гены int/xis активируются) с последующей селекцией вариантов Cm^SАр^R. Удаление гена cat из хромосомы штаммов может быть подтверждено при помощи ПЦР. Локус-специфичные праймеры Р7 (SEQ ID NO: 11) и Р8 (SEQ ID NO: 12) могут быть использованы для такого подтверждения путем ПЦР. Условия проведения ПЦР могут быть такими же, как описано выше. Продукт ПЦР, полученный в случае клеток с удаленным геном cat, должен быть длиной в 294 п.н. Таким образом, может быть получен штамм SV164 (P_tac-ideal→aroG4-serA5)-ΔydiN, в котором инактивирован ген ydiN и из которого удален ген cat.

Оба штамма, SV164 (P_tac-ideal→aroG4-serA5)-ΔydiN и SV164 (P_tac-ideal-aroG4-serA5), могут быть выращены с перемешиванием при 37°С в течение 18 часов в 3 мл питательного бульона. По 0.3 мл полученных культур может быть внесено в 3 мл ферментационной среды в пробирки размером 20×200 мм, и культуры могут быть выращены при 37°С в течение 48 часов на роторной качалке при 250 об/мин. После выращивания количество накопленного в среде триптофана может быть определено с помощью TLC, как описано в Примере 2.

Компоненты использованной ферментационной среды представлены в Таблице 1; группы компонентов А, В, С, D, Е, F и Н стерилизуют отдельно, как и показано в Таблице 1, чтобы избежать нежелательных взаимодействий во время стерилизации.

Пример 4. Конструирование штамма с инактивированным геном ydiB

1. Делеция гена ydiB

Делецию гена ydiB осуществили с использованием методики "Red-зависимая интеграция". Фрагмент ДНК, содержащий маркер Cm^R, кодируемый геном cat, был получен при помощи ПЦР с использованием праймеров Р9 (SEQ ID NO: 13) и P10 (SEQ ID NO: 14) и плазмиды pMW118-attL-Cm-attR в качестве матрицы. Праймер Р9 содержит участок ДНК размером в 36 п.н., комплементарный участку ДНК, расположенному на 5'-конце гена ydiB, -tt-нуклеотиды для предотвращения сдвига рамки считывания и участок ДНК размером 28 п.н., комплементарный участку ДНК, расположенному на 3'-конце области attR. Праймер Р10 содержит участок ДНК размером в 36 п.н., комплементарный участку ДНК, расположенному на 3'-конце гена ydiB, и участок ДНК размером 28 п.н., комплементарный участку ДНК, расположенному на 5'-конце области attL. Использовали следующий температурный профиль для ПЦР: денатурация при 95°С в течение 3 мин; два первых цикла: 1 мин при 95°С, 30 сек при 50°С, 40 сек при 72°С; последующие 25 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 54°С, 40 сек при 72°С; и заключительная полимеризация: 5 мин при 72°С.

Полученный ПЦР-продукт длиной 1711 п.н. (Фиг.1), очищенный в агарозном геле, был использован для электропорации в штамм Е.coli MG1655, содержащий плазмиду pKD46 с термочувствительным репликоном. Плазмида pKD46 необходима для интеграции продукта ПЦР в хромосому штамма MG1655.

Электрокомпетентные клетки были получены следующим образом: ночную культуру штамма Е.coli MG1655 выращивали при 30°С в среде LB с добавкой ампициллина (100 мг/л), разводили в 100 раз, добавив 5 мл среды SOB, содержащей ампициллин и L-арабинозу (1 мМ). Полученную культуру растили с перемешиванием при 30°С до достижения OD₆₀₀≈0.6, после чего делали клетки электрокомпетентными, путем концентрирования в 100 раз и трехкратного отмывания ледяной деионизированной Н₂О. Электропорацию проводили с использованием 70 мкл клеток и ≈100 нг ПЦР-продукта. После электропорации клетки инкубировали в 1 мл среды SOC (Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) при 37°С в течение 2.5 часов, после чего высевали на чашки с L-агаром, содержащим 30 мкг/мл хлорамфеникола, и выращивали при 37°С для отбора Cm^R-рекомбинантов. Затем для удаления плазмиды pKD46 проводили 2 пассажа на L-агаре с Cm при 42°С и полученные колонии проверяли на чувствительность к ампициллину.

2. Подтверждение делеции гена ydiB с помощью ПЦР.

Мутанты с делетированным геном ydiB, содержащие ген устойчивости Cm, были проверены с помощью ПЦР. Локус-специфичные праймеры P11 (SEQ ID NO: 15) и P12 (SEQ ID NO: 16) были использованы для проверки делеции с помощью ПЦР. Использовался следующий температурный профиль для ПЦР-проверки: денатурация при 94°С в течение 3 мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 94°С, 30 сек при 54°С, 1 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С. Длина продукта ПЦР, полученного в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток родительского штамма ydiB⁺ MG1655, составляет 1083 п.н. Длина продукта ПЦР, полученного в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток мутантного штамма, составляет 1927 п.н. (Фиг.2). Мутантный штамм был назван MG1655 ΔydiB::cat.

Пример 5. Продукция L-фенилаланина штаммом Е.coli AJ12739-ΔydiB.

Для оценки влияния инактивации гена ydiB на продукцию L-фенилаланина ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655 ΔydiB::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент L-фенилаланина Е.coli AJ12739 с помощью Р1-трансдукции с целью получения штамма AJ12739-ΔydiB::cat.

Далее ген устойчивости к Cm (ген cat) может быть элиминирован из хромосомы штамма AJ12739-ΔydiB::cat с использованием int-xis системы. С этой целью штамм AJ12739-ΔydiB::cat может быть трансформирован плазмидой pMWts-Int/Xis. Селекция трансформированных клонов может быть произведена с использованием среды LB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл). Чашки могут быть инкубированы в течение ночи при 30°С. Ген cat может быть удален из трансформированных клонов путем выращивания отдельных колоний при 37°С (при этой температуре репрессор CIts в некоторой мере инактивируется, тогда как гены int/xis активируются) с последующей селекцией вариантов Cm^SAp^R. Удаление гена cat из хромосомы штаммов может быть подтверждено при помощи ПЦР. Локус-специфичные праймеры P11 (SEQ ID NO: 15) и P12 (SEQ ID NO: 16) могут быть использованы для такого подтверждения путем ПЦР. Условия проведения ПЦР могут быть такими же, как описано выше. Продукт ПЦР, полученный в случае клеток с удаленным геном cat, должен быть длиной в 321 п.н. Таким образом, может быть получен штамм AJ12739-ΔydiB, в котором инактивирован ген ydiB и из которого удален ген cat.

Оба штамма, AJ12739 и AJ12739-ΔydiB, могут быть выращены при 37°С в течение 18 часов в питательном бульоне, 0.3 мл полученных культур может быть внесено в 3 мл ферментационной среды в пробирки размером 20×200 мм, и культуры могут быть выращены при 37°С в течение 48 часов на роторной качалке. По окончании ферментации количество накопленного в среде фенилаланина может быть определено с помощью TLC, как описано в Примере 2.

Может быть использована ферментационная среда следующего состава, г/л:

Глюкозу и сульфат магния стерилизуют отдельно. СаСО₃ стерилизуют сухим жаром при 180°С в течение 2 часов. рН доводят до 7.0.

Пример 6. Продукция L-триптофана штаммом Е.coli SV164 (P_tac-ideal→aroG4-serA5)-ΔydiB.

Для оценки влияния инактивации гена ydiB на продукцию L-триптофана ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655 ΔydiB::cat переносили в штамм-продуцент L-триптофана Е.coli SV164 (P_tac-ideal→aroG4-serA5) с помощью Р1-трансдукции с целью получения штамма SV164 (P_tac-ideal→aroG4-serA5)-ΔydiB::cat.

Далее ген устойчивости к Cm (ген cat) элиминировали из хромосомы штамма SV164 (P_tac-ideal→aroG4-serA5)-ΔydiB::cat с использованием int-xis системы. С этой целью штамм SV164 (P_tac-ideal→aroG4-serA5)-ΔydiB::cat трансформировали плазмидой pMWts-Int/Xis. Селекцию трансформированных клонов производили с использованием среды LB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл). Чашки инкубировали в течение ночи при 30°С. Ген cat удаляли из трансформированных клонов путем выращивания отдельных колоний при 37°С (при этой температуре репрессор CIts в некоторой мере инактивируется, тогда как гены int/xis активируются) с последующей селекцией вариантов Cm^SAp^R. Удаление гена cat из хромосомы штаммов подтверждали при помощи ПЦР. Для такого подтверждения путем ПЦР использовали локус-специфичные праймеры P11 (SEQ ID NO: 15) и Р12 (SEQ ID NO: 16). Условия проведения ПЦР были такими же, как описано выше. Продукт ПЦР, полученный в случае клеток с удаленным геном cat, был длиной в 321 п.н. Таким образом, получили штамм SV164 (P_tac-ideal→aroG4-serA5)-ΔydiB, в котором инактивирован ген ydiB и из которого удален ген cat.

Оба штамма, SV164 (P_tac-ideal→aroG4-serA5)-ΔydiB и SV164 (P_tac-ideal→aroG4-serA5), выращивали с перемешиванием при 32°С в течение 18 часов в 3 мл питательного бульона. По 0.3 мл полученных культур вносили в 3 мл ферментационной среды в пробирки размером 20×200 мм и культуры выращивали при 32°С в течение 50 часов на роторной качалке при 250 об/мин. Было определено, что на этот момент времени глюкоза была полностью утилизирована. После выращивания количество накопленного в среде триптофана определяли с помощью TLC, как описано в Примере 2. Результаты по крайней мере трех независимых ферментаций представлены в Таблице 2. Как видно, инактивация гена ydiB приводит к увеличению продукции триптофана.

Компоненты использованной ферментационной среды представлены в Таблице 1; группы компонентов А, В, С, D, Е, F и Н стерилизуют отдельно, как и показано в Таблице 1, чтобы избежать нежелательных взаимодействий во время стерилизации.

Пример 7. Конструирование штамма с инактивированными ydiN и ydiB генами

1. Делеция генов ydiN и ydiB

Делецию генов ydiN и ydiB осуществляли с использованием методики "Red-зависимая интеграция". Фрагмент ДНК, содержащий маркер Cm^R, кодируемый геном cat, был получен при помощи ПЦР с использованием праймеров Р5 (SEQ ID NO: 9) и P10 (SEQ ID NO: 14) и плазмиды pMW118-attL-Cm-attR в качестве матрицы. Использовали следующий температурный профиль для ПЦР: денатурация при 95°С в течение 3 мин; два первых цикла: 1 мин при 95°С, 30 сек при 50°С, 40 сек при 72°С; последующие 25 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 54°С, 40 сек при 72°С; и заключительная полимеризация: 5 мин при 72°С.

Полученный ПЦР-продукт длиной 1711 п.н. (Фиг.1), очищенный в агарозном геле, был использован для электропорации в штамм Е.coli MG1655, содержащий плазмиду pKD46 с термочувствительным репликоном. Плазмида pKD46 необходима для интеграции продукта ПЦР в хромосому штамма MG1655.

Электрокомпетентные клетки были получены следующим образом: ночную культуру штамма Е.coli MG1655 выращивали при 30°С в среде LB с добавкой ампициллина (100 мг/л), разводили в 100 раз, добавив 5 мл среды SOB, содержащей ампициллин и L-арабинозу (1 мМ). Полученную культуру растили с перемешиванием при 30°С до достижения OD₆₀₀≈0.6, после чего делали клетки электрокомпетентными, путем концентрирования в 100 раз и трехкратного отмывания ледяной деионизированной Н₂О. Электропорацию проводили с использованием 70 мкл клеток и ≈100 нг ПЦР-продукта. После электропорации клетки инкубировали в 1 мл среды SOC (Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) при 37°С в течение 2.5 часов, после чего высевали на чашки с L-агаром, содержащим 30 мкг/мл хлорамфеникола и выращивали при 37°С для отбора Cm^R-рекомбинантов. Затем для удаления плазмиды pKD46 проводили 2 пассажа на L-агаре с Cm при 42°С, и полученные колонии проверяли на чувствительность к ампициллину.

2. Подтверждение делеции генов ydiN и vdiB с помощью ПЦР.

Мутанты с делетированными генами ydiN и ydiB, содержащие ген устойчивости Cm, были проверены с помощью ПЦР. Локус-специфичные праймеры P11 (SEQ ID NO: 15) и P12 (SEQ ID NO: 16) были использованы для проверки делеции с помощью ПЦР. Использовался следующий температурный профиль для ПЦР-проверки: денатурация при 94°С в течение 3 мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 94°С, 30 сек при 54°С, 1 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С. Длина продукта ПЦР, полученного в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток родительского штамма ydiNB + MG1655, составляет 2339 п.н. Длина продукта ПЦР, полученного в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток мутантного штамма, составляет 1900 п.н. (Фиг.2). Мутантный штамм был назван MG1655 ΔydiNB::cat.

Пример 8. Продукция L-фенилаланина штаммом Е.coli AJ12739-ΔydiNB.

Для оценки влияния инактивации генов ydiN и ydiB на продукцию L-фенилаланина ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655-ΔydiNB::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент L-фенилаланина Е.coli AJ12739 с помощью P1-трансдукции с целью получения штамма AJ12739-ΔydiNB::cat.

Далее ген устойчивости к Cm (ген cat) может быть элиминирован из хромосомы штамма AJ12739-ΔydiNB::cat с использованием int-xis системы. С этой целью штамм AJ12739-ΔydiNB::cat может быть трансформирован плазмидой pMWts-Int/Xis. Селекция трансформированных клонов может быть произведена с использованием среды LB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл). Чашки могут быть инкубированы в течение ночи при 30°С. Ген cat может быть удален из трансформированных клонов путем выращивания отдельных колоний при 37°С (при этой температуре репрессор CIts в некоторой мере инактивируется, тогда как гены int/xis активируются) с последующей селекцией вариантов Cm^SAp^R. Удаление гена cat из хромосомы штаммов может быть подтверждено при помощи ПЦР. Локус-специфичные праймеры Р7 (SEQ ID NO: 11) и P12 (SEQ ID NO: 16) могут быть использованы для такого подтверждения путем ПЦР. Условия проведения ПЦР могут быть такими же, как описано выше. Продукт ПЦР, полученный в случае клеток с удаленным геном cat, должен быть длиной в 294 п.н. Таким образом, может быть получен штамм AJ12739-ΔydiNB, в котором инактивированы гены ydiN и ydiB и из которого удален ген cat.

Оба штамма, AJ12739 и AJ12739-ΔydiNB, могут быть выращены при 37°С в течение 18 часов в питательном бульоне, 0.3 мл полученных культур может быть внесено в 3 мл ферментационной среды в пробирки размером 20×200 мм, и культуры могут быть выращены при 37°С в течение 48 часов на роторной качалке. По окончании ферментации количество накопленного в среде фенилаланина может быть определено с помощью TLC, как описано в Примере 2.

Может быть использована ферментационная среда следующего состава, г/л:

Глюкозу и сульфат магния стерилизуют отдельно. СаСО₃ стерилизуют сухим жаром при 180°С в течение 2 часов. рН доводят до 7.0.

Пример 9. Продукция L-триптофана штаммом Е.coli SV164 (P_tac-ideal→aroG4-serA5)-ΔydiNB.

Для оценки влияния инактивации генов ydiN и ydiB на продукцию L-триптофана ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655 ΔydiNB::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент L-триптофана Е.coli SV164 (P_tac-ideal→aroG4-serA5) с помощью P1-трансдукции с целью получения штамма SV164 (P_tac-ideal→aroG4-serA5)-ΔydiNB::cat.

Далее ген устойчивости к Cm (ген cat) может быть элиминирован из хромосомы штамма SV164 (P_tac-ideal→aroG4-serA5)-ΔydiNB::cat с использованием int-xis системы. С этой целью штамм SV164 (P_tac-ideal→aroG4-serA5)-ΔydiNB::cat может быть трансформирован плазмидой pMWts-Int/Xis. Селекция трансформированных клонов может быть произведена с использованием среды LB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл). Чашки могут быть инкубированы в течение ночи при 30°С. Ген cat может быть удален из трансформированных клонов путем выращивания отдельных колоний при 37°С (при этой температуре репрессор CIts в некоторой мере инактивируется, тогда как гены int/xis активируются) с последующей селекцией вариантов Cm^SAp^R. Удаление гена cat из хромосомы штаммов может быть подтверждено при помощи ПЦР. Локус-специфичные праймеры Р7 (SEQ ID NO: 11) и Р12 (SEQ ID NO: 16) могут быть использованы для такого подтверждения путем ПЦР. Условия проведения ПЦР могут быть такими же, как описано выше. Продукт ПЦР, полученный в случае клеток с удаленным геном cat, должен быть длиной в 294 п.н. Таким образом, может быть получен штамм SV164 (P_tac-ideal→aroG4-serA5)-ΔydiNB, в котором инактивированы гены ydiN и ydiB и из которого удален ген cat.

Оба штамма, SV164 (P_tac-ideal→aroG4-serA5)-ΔydiNB и SV164 (Р_tac-ideal→aroG4-serA5), могут быть выращены с перемешиванием при 37°С в течение 18 часов в 3 мл питательного бульона. По 0.3 мл полученных культур может быть внесено в 3 мл ферментационной среды в пробирки размером 20×200 мм, и культуры могут быть выращены при 37°С в течение 48 часов на роторной качалке при 250 об/мин. После выращивания количество накопленного в среде триптофана может быть определено с помощью TLC, как описано в Примере 2.

Компоненты использованной ферментационной среды представлены в Таблице 1; группы компонентов А, В, С, D, Е, F и Н стерилизуют отдельно, как и показано в Таблице 1, чтобы избежать нежелательных взаимодействий во время стерилизации.

Хотя указанное изобретение описано в деталях со ссылкой на Наилучший способ осуществления изобретения, для специалиста в указанной области техники очевидно, что могут быть совершены различные изменения и произведены эквивалентные замены, и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения.

Каждому из упомянутых выше документов соответствует ссылка, и все цитируемые документы являются частью описания настоящего изобретения.

Промышленная применимость

Согласно настоящему изобретению, в бактерии, принадлежащей к семейству Enterobacteriaceae, может быть усилена продукция ароматических L-аминокислот.