МУТАНТНАЯ ФОСФОРИБОЗИЛПИРОФОСФАТСИНТЕТАЗА, ФРАГМЕНТ ДНК, БАКТЕРИЯ РОДА ESCHERICHIA - ПРОДУЦЕНТ L-ГИСТИДИНА И СПОСОБ ПРОДУКЦИИ L-ГИСТИДИНА

Область техники.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения L-аминокислот, а именно аминокислоты, такой как L-гистидин. Более конкретно, настоящее изобретение касается использования нового фермента, устойчивого к ингибированию по типу обратной связи, участвующего в биосинтезе пуринов и L-гистидина. Более конкретно, настоящее изобретение касается использования новой мутантной фосфорибозилпирофоефатсинтетазы (ФРПФ синтетазы) из Е.coli, устойчивой к ингибированию по типу обратной связи, бактерии, принадлежащей к семейству Enterobacteriaceace и содержащей указанный фермент, и к способу получения L-гистидина методом ферментации с использованием штаммов указанных бактерий.

Предшествующий уровень техники

Традиционно L-аминокислоты в промышленном масштабе могут быть получены методом ферментации с использованием штаммов микроорганизмов, полученных из природных источников, или их мутантов, специально модифицированных для того, чтобы увеличить продукцию L-аминокислот.

Описано множество методов увеличения продукции L-аминокислот, например, путем трансформации микроорганизма рекомбинантной ДНК (см., например, патент США 4278765). Указанные методы основаны на повышении активности ферментов, вовлеченных в биосинтез аминокислот и/или уменьшении чувствительности целевого фермента к обратному ингибированию продуцируемой L-аминокислотой (см., например, выложенную патентную заявку Японии №56-18596 (1981), WO 95/16042 или патенты США 5661012 и 6040160).

5-фосфорибозил-α-1-пирофосфат (фосфорибозилпирофосфат, ФРПФ) и аденозин-5^'-трифосфат (АТФ) являются первичными субстратами в пути биосинтеза гистидина. ФРПФ связывает путь биосинтеза гистидина с путями биосинтеза пиримидиновых, пуриновых и пиридиновых нуклеотидов, а также триптофана (Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C. Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996).

Многие нуклеотиды, конкурируя с АТФ, ингибируют активность ФРПФ синтетазы. Тем не менее, единственным достаточно сильным нуклеотидным ингибитором является аденозин-5^'-дифосфат (АДФ); он конкурирует с АТФ, поскольку является аллостерическим ингибитором, который связывается с сайтом, отличным от активного сайта фермента (Hove-Jensen, В. et al, J. Biol. Chem. 261:6765-6771 (1986).

Мутанты с повышенной активностью ФРПФ синтетазы были получены как у Е.coli, так и S.typhimurium. Был получен мутант Е.coli с ФРПФ синтетазой, значение K_m к АТФ у которой возросло в 27 раз, при этом активность фермента больше не ингибировалась АМФ. Эта мутация выражается в замене аспартата в положении 128 на аланин (мутация prsDA). prs мутант S.tuphimurium является термочувствительным и сохраняет лишь 20% от активности природной ФРПФ синтетазы. Значения K_m к АТФ и рибозо 5^'-фосфату у этого мутантного фермента повышены, и снижена чувствительность к ингибированию АДФ. Эта мутация возникла в результате замены аргинина в положении 78 на цистеин (Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C. Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996).

Хорошо известно, что избыточная активность ФРПФ синтетазы и устойчивость этого фермента к пуриновым нуклеотидам у человека связаны с нарушениями развития нервной системы, вызывает заболевания гиперурикемию и подагру (Becker M.A. et al, Arthritis Rheum, 18:6 Suppl: 687-94 (1975); Zoref E. et al, J. Clin. Invest., 56(5): 1093-9 (1975)). Избыточная продукция мочевины у больных, обладающих повышенной активностью ФРПФ синтетазы, происходит из-за высокой концентрации ФРПФ в организме, стимулирующей, в свою очередь, синтез пуринов de novo. Было показано, что гиперактивность ФРПФ синтетазы возникает в результате точечной мутации - нуклеотидной замене А на Г в позиции 341 соответствующего гена, что приводит к аминокислотной замене аспарагина на серин в положении 113 зрелого фермента. Такая мутантная ФРПФ синтетаза устойчива к ингибированию пуриновыми нуклеотидами, которые ингибируют природный фермент по неконкурентному по отношению к АТФ механизму (Roessler, B.J. et al. J. Biol. Chem., v.268, No 35, 26476-26481 (1993); Becker, M.A. et al, J. Clin. Invest., 96(5): 2133-41 (1995)).

Описан процесс получения пуриновых нуклеозидов с помощью ферментации микроорганизмов, принадлежащих к Escherichia и обладающих способностью к продукции пуриновых нуклеозидов благодаря prsDA мутации (European patent application EP1004663A1). Но в настоящее время нет данных, описывающих мутантную бактериальную ФРПФ синтетазу, устойчивую к ингибированию пуриновыми нуклеотидами по принципу обратной связи, и использование этой мутантной ФРПФ синтетазы для улучшения продукции L-гистидина у штаммов-продуцентов L-гистидина.

Описание изобретения

Целью настоящего изобретения является предоставление новой мутантной бактериальной ФРПФ синтетазы, увеличение продуктивности штаммов, продуцирующих L-гистидин, и предоставление способа получения L-гистидина с использованием указанных штаммов.

Данная цель была достигнута путем конструирования новой мутантной ФРПФ синтетазы из Е. coli. Принимая во внимание высокую консервативность гена prsA (Taira M. et al, J. Biol. Chem., v.262, No 31, pp.14867-14870 (1987)), была сконструирована мутантная ФРПФ синтетаза из E. coli, содержащая мутацию, соответствующую человеческой мутации Asn-113. Было показано, что использование такой мутантной ФРПФ синтетазы может повысить продукцию L-гистидина в случае, когда дополнительные копии соответствующего гена введены в клетки соответствующего штамма-продуцента. Таким образом, было совершено настоящее изобретение.

Настоящее изобретение включает в себя следующее:

1. Мутантная бактериальная фосфорибозилпирофосфатсинтетаза (ФРПФ синтетаза), в которой L-аминокислотный остаток, соответствующий позиции 115 аминокислотной последовательности в природной ФРПФ синтетазе из Escherichia coli, заменен на другой L-аминокислотный остаток, и чувствительность указанного фермента к ингибированию пуриновыми нуклеотидами по типу обратной связи утрачена.

2. Мутантная ФРПФ синтетаза в соответствии с п.1, в которой остаток аспартата, соответствующий позиции 115 аминокислотной последовательности в природной ФРПФ синтетазе, заменен на остаток серина.

3. Мутантная ФРПФ синтетаза, в соответствии с любым из пунктов 1 или 2, в которой природная ФРПФ синтетаза получена из Escherichia coli.

4. Мутантная ФРПФ синтетаза, в соответствии с п.3, которая содержит делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в аминокислотную последовательность в одном или нескольких положениях, отличных от положения 115 аминокислотной последовательности, которая нечувствительна к ингибированию пуриновыми нуклеотидами по типу обратной связи.

5. Фрагмент ДНК, кодирующий мутантную ФРПФ синтетазу, в соответствии с любым из п.п. с 1 по 4.

6. Бактерия, принадлежащая к семейству Enterobacteriaceae, которая содержит ДНК, в соответствии с п.5, и обладает способностью к продукции L-гистидина.

7. Бактерия в соответствии с п.6, в которой активность мутантной ФРПФ синтетазы повышена.

8. Бактерия в соответствии с п.7, в которой бактерия принадлежит к роду Escherichia.

9. Бактерия в соответствии с п.7, в которой активность мутантной ФРПФ синтетазы повышена путем увеличения экспрессии гена, кодирующего мутантную ФРПФ синтетазу.

10. Бактерия в соответствии с п.9, в которой активность мутантной ФРПФ синтетазы повышена путем увеличения количества копий гена, кодирующего мутантную ФРПФ синтетазу, или путем изменения последовательности регулирующей экспрессию указанного гена таким образом, что происходит повышение экспрессии указанного гена.

11. Бактерия в соответствии с п.10, в которой количество копий указанного гена увеличено путем интеграции в хромосому вышеупомянутой бактерии дополнительных копий гена, кодирующего мутантную ФРПФ синтетазу.

12. Способ получения L-гистидина, включающий стадии выращивания бактерии в соответствии с любым из пп. с 6 по 11, в питательной среде и сбора из культуральной жидкости полученного и накопленного в ней L-гистидина.

13. Способ в соответствии с п.12, в котором у указанной бактерии повышена экспрессия генов биосинтеза L-гистидина.

ФРПФ синтетаза, содержащая замену аминокислотного остатка аспартата в позиции, соответствующей позиции 115 аминокислотной последовательности природной ФРПФ синтетазы, может считаться "мутантной ФРПФ синтетазой", а ДНК, кодирующая мутантную ФРПФ синтетазу, может считаться "мутантным геном prsA" или "мутантным геном ФРПФ синтетазы", и ФРПФ синтетаза без указанной замены может считаться "природной ФРПФ синтетазой".

Настоящее изобретение более детально будет описано ниже.

1. Мутантная ФРПФ синтетаза и мутантный ген prsA.

Известно, что генетические и функциональные причины гиперактивности человеческой ФРПФ синтетазы, возникающей из-за устойчивости к ингибированию указанного фермента пуриновыми нуклеотидами, связаны с заменой одного нуклеотида в гене prsA (Roessler, B.J. et al. J. Biol. Chem., v.268, No 35, 26476-26481 (1993)). Основываясь на высокой консервативности гена prsA (Taira M. et al., J. Biol. Chem., v.262, No 31, рр.14867-14870 (1987)), была сконструирована мутантная ФРПФ синтетаза из Е. coli, несущая мутацию, соответствующую мутации Asn-113 в ФРПФ синтетазе человека. Такая мутация неизвестна для всех бактериальных ФРПФ синтетаз. Термин "бактериальная ФРПФ синтетаза" означает ФРПФ синтетазу, присутствующую в бактериях семейства Enterobacteriaceae, коринебактериях, бактериях, принадлежащих к роду Bacilluc и так далее.

Семейство Enterobacteriaceae включает в себя бактерии, принадлежащие к родам Escherichia, Erwinia, Providencia и Serratia. Род Escherichia предпочтителен.

Замена аминокислотного остатка, соответствующего аспартату в позиции 115 ФРПФ синтетазы из Escherichia coli любой другой аминокислотой, предпочтительно серином, в аминокислотной последовательности природной ФРПФ синтетазы [ЕС 2.7.6.1] из Е. coli приводит к образованию мутантного белка, устойчивого к ингибированию пуриновыми нуклеотидами, такими как пуриновые ди- и мононуклеотиды, прежде всего, гуанозин-5^'-дифосфат (ГДФ), аденозин-5^'-дифосфат (АДФ) и аденозин-5^'-монофосфат (АМФ).

Мутантную ФРПФ синтетазу получают путем введения мутаций в нуклеотидную последовательность природного гена prsA с использованием традиционных методов. В качестве природного prsA может быть упомянут ген prsA из Е. coli (нуклеотиды с 1260151 по 1261098 в последовательности с инвентарным номером NC_000913, gi:16129170 в базе данных GenBank, SEQ ID NO:1). Ген prsA расположен между рамками считывания (ORF) ychM и ychM на хромосоме штамма E. coli К-12. Таким образом, ген E. coli может быть получен с помощью ПЦР (полимеразная цепная реакция; по White, T.J. et al., Trends Genet., 5,185 (1989)) с использованием праймеров, синтезированных на основе нуклеотидной последовательности указанного гена. Гены из других микроорганизмов, кодирующие ФРПФ синтетазу, могут быть получены таким же образом.

Мутантная ФРПФ синтетаза может содержать делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в одном или нескольких положениях, отличных от положения 115 аминокислотной последовательности, при условии, что они не снижают активность ФРПФ синтетазы. Термин "активность ФРПФ синтетазы" означает активность по катализу реакции образования 5-фосфорибозил-α-1-пирофосфата (ФРПФ) из рибозо-5-фосфата и АТФ с высвобождением АМФ. Уровень каталитической активности ФРПФ синтетазы в экстрактах клеток, а также степень ингибирования АДФ может быть измерена с помощью частично измененного метода, предложенного К. F. Jensen et al. (Analytical Biochemistry, 98,254-263 (1979)). В частности, в качестве субстрата может быть использован [α-³²Р]АТФ, при этом следует измерять количество высвобождающегося в ходе реакции [³²Р]АМР.

Количество "нескольких" аминокислот различается в зависимости от положения и типа аминокислотного остатка в трехмерной структуре белка. Этот факт имеет следующее объяснение. Некоторые аминокислоты обладают высокой гомологией друг к другу, и различия между такими аминокислотами не оказывают существенного влияния на трехмерную структуру белка и его активность. Таким образом, мутантной ФРПФ синтетазой согласно настоящему изобретению, может являться белок, имеющий гомологию, не меньшую, чем от 30 до 50%, предпочтительно от 50% до 70% по отношению к общему количеству аминокислотных остатков, входящих в состав ФРПФ синтетазы, и обладающий активностью ФРПФ синтетазы.

Согласно настоящему изобретению термин "L-аминокислотный остаток, соответствующий позиции 115 аминокислотной последовательности", обозначает аминокислотный остаток, соответствующий позиции 115 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2. В ФРПФ синтетазе из E. coli аминокислотным остатком в позиции 115 является аспартат. Номера позиций аминокислотных остатков могут изменяться. Например, если один аминокислотный остаток вставлен в N-концевую область белка, то номер позиции постоянно находящегося в этом месте аминокислотного остатка изменяется с 115 на 116. В таких случаях, аминокислотный остаток, исходно соответствующий позиции 115, согласно настоящему изобретению считается находящимся на позиции 115.

Для того чтобы определить, какой L-аминокислотный остаток соответствует позиции 115 аминокислотной последовательности ФРПФ синтетазы из Е. coli, необходимо произвести сравнение аминокислотной последовательности ФРПФ синтетазы из Е. coli (SEQ ID NO: 2) и аминокислотной последовательности ФРПФ синтетазы из интересующей бактерии. Это позволит выяснить, какой L-аминокислотный остаток соответствует позиции под номером 115 в аминокислотной последовательности ФРПФ синтетазы из интересующей бактерии.

ДНК, кодирующая практически такой же белок, как мутантная ФРПФ синтетаза, описанная выше, может быть получена, например, путем модификации соответствующей нуклеотидной последовательности с использованием сайт-направленного мутагенеза таким образом, что один или несколько аминокислотных остатков будут удалены, заменены, введены или добавлены. Модифицированная подобным образом ДНК может быть получена традиционными методами, использующими обработку химическими реагентами и содержание в условиях, вызывающих мутации. К подобного рода обработкам относятся обработка in vitro ДНК, содержащей мутантный ген prsA, с помощью гидроксиламина, или обработка бактерии, принадлежащей к роду Escherichia и содержащей мутантный ген prsA, с помощью УФ излучения или химического реагента, такого как N-метил-N^'-нитро-N-нитрозогуанидин или азотистая кислота, традиционно используемого для такого рода обработок.

Замены, делеции, вставки или добавления нуклеотида, как описано выше, также включают в себя мутации, которые существуют в природе (мутанты или варианты), например, на основе индивидуальных различий или ввиду естественных различий между видами или родами бактерий, содержащих ФРПФ синтетазу.

ДНК, кодирующая практически такой же белок, как мутантная ФРПФ синтетаза, может быть получена путем выделения из клетки, которая содержит мутантную ФРПФ синтетазу, подвергнутую обработке мутагенами ДНК, которая гибридизуется с используемой в качестве зонда ДНК, содержащей известную последовательность гена prsA или его часть, в жестких условиях, и которая кодирует белок, обладающий активностью ФРПФ синтетазы.

Термин "жесткие условия", упомянутый здесь, означает условия, при которых образуются так называемые специфические гибриды, а неспецифические не образуются. Достаточно сложно точно определить такие условия в конкретных цифрах. Например, к жестким условиям относятся условия, при которых гибридизуются ДНК, обладающие высокой степенью гомологии, к примеру, ДНК, обладающие гомологией не менее 50% друг относительно друга, а ДНК, обладающие гомологией менее 50% друг относительно друга, не гибридизуются.

Для оценки степени гомологии между ДНК возможно использование нескольких способов расчета, таких как BLAST search, FASTA search и CrustalW.

BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) это самообучающийся алгоритм поиска, используемый программами BLASTP, BLASTN, BLASTX, MEGABLAST, TBLASTN, и TBLASTX; эти программы оценивают значимость найденных результатов с использованием статистических методов Karlin, Samuel и Stephen F. Altschul ("Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes". Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:2264-68; "Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences". Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90:5873-7). Способ поиска FASTA описан W.R.Pearson ("Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology, 1990 183:63-98). Способ ClustalW описан Thompson J.D., Higgins D.G. и Gibson T.J. ("CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice". Nucleic Acids Res. 1994, 22:4673-4680).

С другой стороны, жесткие условия могут быть описаны условиями, при которых различные ДНК гибридизуются друг с другом при концентрациях соли, соответствующих стандартным условиям отмывки при гибридизации по Саузерну, например, 60°С, 1 х SSC, 0.1% SDS, предпочтительно 0.1 х SSC, 0.1% SDS. В качестве зонда для ДНК, кодирующей варианты и гибридизующейся с геном prsA, также может быть использована часть нуклеотидной последовательности под номером SEQ ID NO:1. Зонд подобного рода может быть получен в результате ПЦР с использованием в качестве затравок олигонуклеотидов, полученных на основе нуклеотидной последовательности под номером SEQ ID NO:1, и фрагмента ДНК, содержащего нуклеотидную последовательность под номером SEQ ID NO:1, в качестве матрицы. В случае когда в качестве зонда используется фрагмент ДНК длиной около 300 пар оснований, условия отмывки при гибридизации соответствуют, например, 50°С, 2 х SSC и 0.1% SDS. Продолжительность отмывки зависит от вида мембраны, используемой для блоттинга и, как правило, рекомендована производителем. Например, рекомендуемая продолжительность отмывки для мембраны Hybond^TM N+nylon (Amersham) в жестких условиях составляет 15 минут.

Среди генов, способных к гибридизации в описанных выше условиях, могут существовать гены с возникшим в кодирующей части в результате мутаций стоп-кодоном, а также гены, кодирующие неактивный белок, из-за мутаций в активном центре. Тем не менее, от таких дефективные генов легко избавиться путем лигирования смеси генов с коммерчески доступными экспрессионными векторами и последующих измерений уровня активности ФРПФ синтетазы у полученных белков.

2. Бактерия согласно настоящему изобретению

Бактерией согласно настоящему изобретению является бактерия, принадлежащая к семейству Enterobacteriacea, продуцент L-гистидина, содержащая ДНК, кодирующую мутантную ФРПФ синтетазу согласно настоящему изобретению. Далее, бактерией согласно настоящему изобретению является бактерия, принадлежащая к семейству Enterobacteriacea, - продуцент L-гистидина, в которой, согласно настоящему изобретению, повышена активность мутантной ФРПФ синтетазы. Конкретно, бактерией согласно настоящему изобретению является бактерия, принадлежащая к семейству Enterobacteriacea, - продуцент L-гистидина, в которой продукция L-гистидина указанной бактерией повышена в результате повышения активности белка согласно настоящему изобретению в клетке указанной бактерии.

Конкретно бактерией согласно настоящему изобретению является бактерия принадлежащая к семейству Escherichia, продуцент L-гистидина, в которой продукция L-гистидина указанной бактерией увеличена за счет повышения в клетке бактерии активности белка согласно настоящему изобретению, а именно мутантной ФРПФ синтетазы. Более конкретно бактерия согласно настоящему изобретению содержит ДНК, в которой повышена экспрессия мутантного гена prsA на хромосоме или на плазмиде в такой бактерии и обладает повышенной способностью к продукции L-гистидина.

"Бактерия, обладающая способностью к продукции L-гистидина" означает бактерию, способную накапливать L-гистидин в среде, во время культивирования бактерии согласно настоящему изобретению в ферментационной среде. Способность к продукции L-гистидина может быть передана или усилена селекцией. Используемый здесь термин "бактерия, обладающая способностью к продукции L-гистидина" означает также бактерию, способную производить и накапливать в культуральной среде L-гистидин в количествах, больших, чем природный или родительский штаммы, и прежде всего означает, что микроорганизм способен производить и накапливать в среде L-гистидин в концентрациях не меньше, чем 0,5 г/л, более предпочтительно не меньше, чем 1,0 г/л.

Семейство Enterobacteriacea включает в себя бактерии, принадлежащие к родам Escherichia, Erwinia, Providensia и Serratia. Род Escherichia предпочтителен.

Термин "бактерия, принадлежащая к роду Escherichia" означает, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, использованного в настоящем изобретении, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (Е. coli).

Термин "активность мутантной ФРПФ синтетазы повышена", означает, что удельная активность ФРПФ синтетазы выше, чем у неизмененного штамма, например, родительского. В качестве примера можно привести случай, когда увеличено количество молекул ФРПФ синтетазы на клетку, случай, когда повышена специфическая активность ФРПФ синтетазы в пересчете на одну молекулу ФРПФ синтетазы и так далее. Далее, в качестве природного штамма, служащего объектом для сравнения, может быть упомянута, например, Escherichia coli К-12. Как результат повышения уровня внутриклеточной активности ФРПФ синтетазы может рассматриваться эффект увеличения количества накапливаемого в питательной среде L-гистидина.

Повышение активности мутантной ФРПФ синтетазы в бактериальной клетке может быть достигнуто с помощью усиления экспрессии гена, кодирующего мутантную ФРПФ синтетазу. В качестве гена, кодирующего мутантную ФРПФ синтетазу, могут быть использованы любые гены, кодирующие мутантную ФРПФ синтетазу, полученные из бактерий, принадлежащих к семейству Enterobacteriacea, а также гены, полученные из других бактерий, таких как например, коринеформные бактерии. Среди этих генов гены, полученные из бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, предпочтительны.

Трансформация бактерии с помощью ДНК, кодирующей белок, означает введение указанной ДНК в клетку бактерию, например, с помощью традиционных методов, для того чтобы усилить экспрессию гена, кодирующего белок согласно настоящему изобретению, и повысить активность белка в клетке бактерии.

К методам увеличения экспрессии генов относятся методы увеличения числа копий гена. Введение гена в вектор, способный к функционированию в бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, увеличивает число копий указанного гена. Для подобных целей могут быть предпочтительно использованы многокопийные векторы. Примерами многокопийных векторов являются pBR322, pUC19, pBluescript KS⁺, pACYC177, pACYC184, pAYC32, pMW119, pET22b и подобные им. Кроме того, усиление экспрессии гена может быть достигнуто путем введения некоторого числа копий гена в бактериальную хромосому, например, методом гомологичной рекомбинации или подобным.

С другой стороны, усиление экспрессии генов может быть достигнуто помещением ДНК согласно настоящему изобретению под контроль более сильного промотора взамен природного. Сила промотора определяется частотой акта инициации синтеза РНК. Методы оценки силы промотера и примеры сильных промоторов описаны у Deuschle, U., Kammerer, W., Gentz, R., Bujard, H. (Promoters in Escherichia coli: a hierarchy of in vivo strength indicates alternate structures. EMBO J. 1986,5,2987-2994). Например, Р_R промотор известен как сильный конститутивный промотор. В качестве сильных промоторов известны P_L промотор, lac промотор, trp промотор, trc промотор, фага лямбда и подобные им.

Усиление трансляции может быть достигнуто путем введения в ДНК согласно настоящему изобретению более эффективной последовательности Shine-Dalgarno (SD последовательности) вместо природной SD последовательности, где под SD последовательностью подразумевается область, находящаяся на цепи ДНК перед старт-кодоном мРНК и взаимодействующая с 16SPHK рибосомы (Shine J. and Dalgamo L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1974, 71,4,1342-6).

Использование сильного промотора может быть совмещено с увеличением числа копий гена.

Методы получения хромосомной ДНК, гибридизации, ПЦР, получения ДНК плазмид, расщепления и лигирования ДНК, трансформации, отбора олигонуклеотидов в качестве затравок и другие подобные методы являются обычными методами, хорошо известными для специалиста в указанной области техники. Перечисленные методы описаны в Sambrook, J., and Russell D., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Third Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) или подобных изданиях.

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем введения вышеуказанных ДНК в бактерию, уже обладающую способностью к продукции L-гистидина. С другой стороны, бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем придания бактерии, уже содержащей указанные ДНК, способности к продукции L-гистидина.

В качестве родительских штаммов, в которых активность белка согласно настоящему изобретению будет повышена, могут быть использованы бактерии, принадлежащие к роду Escherichia, - продуценты L-гистидина, такие как штамм E. coli 24 (ВКПМ В-5945, Российский патент 2003677); штамм Е. coli 80 (ВКПМ В-7270, Российский патент 2119536); штаммы Е. coli NRRL В-12116 - В12121 (патент США 4388405); штаммы Е. coli Н-9342 (FERM ВР-6675) и Н-9343 (FERM ВР-6676) (патент США 6344347); штамм Е. coli Н-9341 (FERM BP-6674) (Европейская патентная заявка 1085087А2); штамм Е. coli AI80/pFM201 (патент США 6258554) и подобные им.

Желательно, чтобы бактерия - продуцент L-гистидина в дальнейшем была модифицирована с целью усиления экспрессии биосинтеза L-гистидина. К ключевым генам биосинтеза L-гистидина относятся ген hisG и гены оперона hisBHAFI, предпочтительно ген hisC, кодирующий АТФ фосфорибозилтрансферазу, устойчивую к ингибированию по принципу обратной связи (Российские патенты 20003677 и 2119536).

3. Способ согласно настоящему изобретению.

К способу согласно настоящему изобретению относится способ продукции L-гистидина, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления указанной L-гистидина в питательной среде, и сбора L-гистидина из культуральной жидкости.

Согласно настоящему изобретению выращивание, сбор и очистка L-гистидина из культуральной или подобной ей жидкости может быть осуществлена способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых аминокислота продуцируется с использованием микроорганизма. Питательная среда, используемая для выращивания, может быть как синтетической, так и натуральной, при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и, если необходимо, соответствующее количество питательных добавок, которые требуются микроорганизму для роста. К источникам углерода относятся различные углеводы, такие как глюкоза и сахароза, и различные органические кислоты. В зависимости от степени ассимиляции используемого микроорганизма могут использоваться спирты, такие как этанол и глицерин. В качестве источника азота могут использоваться различные соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов и ферментолизат микроорганизмов. В качестве минеральных добавок используются монофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные соединения. Некоторые питательные добавки могут быть при необходимости добавлены в питательную среду. Например, если микроорганизму для роста необходим пролин (ауксотрофия по пролину), соответствующее количество тирозина может быть добавлено в питательную среду для выращивания.

Выращивание осуществляется предпочтительно в аэробных условиях, таких как перемешивание, ферментация с аэрацией, при температуре от 20 до 42°С, предпочтительно от 37 до 40°С. рН питательной среды находится в пределах от 5 до 9, предпочтительно от 6.5 до 7.2. рН среды может регулироваться аммиаком, карбонатом кальция, различными кислотами, основаниями и буферами. Обычно выращивание в течение от 1 до 5 дней приводит к накоплению целевой L-аминокислоты в культуральной жидкости.

После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрацией через мембрану, а затем целевая L-аминокислота может быть собрана и очищена методами ионообменной хроматографии, концентрирования и кристаллизации.

Наилучший способ осуществления изобретения

Настоящее изобретение более детально описано со ссылкой на примеры. В указанных примерах аминокислоты являются аминокислотами L- конфигурации, если не указано иное.

Пример 1. Клонирование природного гена prsA из E. coli и создание мутантных генов prsDA и prsDS.

Полная нуклеотидная последовательность штамма Е.coli К-12 определена (Science, 277, 1453-1474, 1997). На основе приведенной нуклеотидной последовательности были синтезированы праймеры, приведенные под номерами SEQ ID No. 3 (праймер 1) и SEQ ID No.4 (праймер 2) для амплификации гена prsA. Праймер 1 содержит сайт узнавания фермента рестрикции BqlII, введенный на ее 5^'-конец. Затравка 2 содержит сайт узнавания фермента рестрикции XbaI, введенный на ее 5^'-конец.

Хромосомная ДНК штамма Е.coli К12, использованная в качестве матрицы для ПЦР, была получена стандартным методом. ПЦР осуществлялась на "Applied Biosystems GeneAmp PCR System 2400" в следующих условиях: начальная денатурация ДНК 3 минуты при 95°С, затем 30 циклов денатурации 30 секунд при 95°С, отжиг 60 секунд при 60°С, наращивание фрагмента 120 секунд при 72°С и финальная полимеризация в течение 7 минут при 72°С с использованием Taq-полимеразы (Fermentas, Литва). Полученный фрагмент ДНК, содержащий prsA ген без промотора, был обработан рестриктазами BglII и XbaI и подставлен под Р_R промотор в интегративный вектор pMWl 19-Р_R, предварительно обработанный теми же рестриктазами. Вектор pMW119-Р_R был сконструирован на основе коммерчески доступного вектора pMW119 путем введения промотора Р_R из фага λ и сайтов attR и attL, необходимых для дальнейшей Mu-интеграции. Таким образом была получена плазмида pMW-P_R-prsA.

Мутантный ген prsDA (замена аспартата 128 на аланин в ФРПФ синтетазе, кодируемой мутантным геном prsDA) был получен с помощью ПЦР, как описано выше, с использованием праймеров 1 (SEQ ID No. 3) и 2 (SEQ ID No. 4), и плазмиды pUCprsDA в качестве матрицы. Плазмида pUCprsDA детально описана в Европейской патентной заявке ЕР 1004663 А1. Полученный ПЦР продукт был обработан рестриктазами BglII и XbaI и подставлен под Р_R промотор в интегративный вектор pMW119-Р_R, предварительно обработанный теми же рестриктазами. Таким образом была получена плазмида pMW-P_R-prsDA.

Мутантный ген prsDS (замена аспартата 115 на серин в ФРПФ синтетазе, кодируемой мутантным геном prsDS) был получен с помощью двух последовательных этапов ПЦР. На первом этапе два фрагмента гена были синтезированы с использованием праймеров 1 (SEQ ID No. 3) и 3 (SEQ ID No. 5) для первого фрагмента и праймеров 2 (SEQ ID No. 4) и 4 (SEQ ID No. 6) для второго. Хромосомная ДНК штамма E. coli К12 использовалась в качестве матрицы. Полученные ПНР продукты были разделены с помощью электрофореза и выделены из геля. На втором этапе ПЦР эти два фрагмента ДНК были объединены, и таким образом был получен мутантный ген prsDS. Полученный ПЦР продукт, содержащий ген prsDS, был обработан рестриктазами BglII и XbaI и подставлен под Р_R промотор в интегративный вектор pMW119-Р_R, предварительно обработанный теми же рестриктазами. Таким образом была получена плазмида pMW-P_R-prsDS.

Пример 2. Влияние усиления экспрессии гена purH на продукцию гистидина.

Были сконетруированны три бесплазмидных штамма-продуцента L-гистидина, содержащие в бактериальной хромосоме дополнительные интегрированные копии генов prsA, prxDA или prsDS. Штамм Е. coli 80 - продуцент гистидина был использован в качестве исходного штамма для интеграции генов prsA, prsDA и prsDS в бактериальную хромосому. Штамм 80 был описан в Российском патенте 2119536 и депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 113545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) под инвентарным номером ВКПМ В-7270.

Интеграция генов в хромосому штамма 80 осуществлялась в два этапа. Сначала штамм-продуцент гистидина 80 трансформировали плазмидой - хелпером, несущей репликон rep (pl5A), ген транспозазы (гены cts62, ner, А, В из фага Mu-cts) и содержащей маркер Tet^R. Второй этап заключался в трансформации полученного штамма плазмидой pMW-P_R-prsA, pMW-P_R-prsDA или pMW-P_R-prsDS. Для интеграции гена в бактериальную хромосому, после теплового шока клетки были перенесены в 1 мл L-бульона, инкубировались в течение 20 минут при 44°С, затем 40 минут при 37°С, после чего были распределены по поверхности чашек с L-агаром, содержащих 10 мг/мл тетрациклина и 100 мг/мл ампициллина. Выросшие после инкубации в течение 48 часов при 30°С колонии были пересеяны в 1 мл L бульона и инкубировались еще в течение 72 часов при 42°С в пробирках. Около 10 колоний из каждой пробирки были проверены на устойчивость к ампициллину и тетрациклину. Колонии, чувствительные к обоим антибиотикам, были проверены на наличие в хромосоме дополнительных копий гена purH методом ПЦР с использованием праймера 1 (SEQ ID No 3) и праймера 5 (SEQ ID No 7). Затравка 5 содержит последовательность, комплементарную сайту attR фага Mu. Для приготовления матрицы для ПЦР свежевыращенную колонию ресуспендировали в 50 мкл воды и 1 мкл суспензии использовали для ПЦР. ПЦР производилась в следующих условиях: начальная денатурация ДНК 5 минут при 95°С, затем 30 циклов денатурации 30 секунд при 95°С, отжиг 60 секунд при 57°С, наращивание фрагмента 120 секунд при 72°С и финальная полимеризация в течение 7 минут при 72°С. Несколько протестированных таким образом колоний, устойчивых к антибиотикам, содержали необходимый фрагмент ДНК 1515 п.о. Так были получены штаммы 80::P_R-prsA 80::P_R-prsDA and 80::P_R-prsDS.

Для ферментации по истощению глюкозы (batch-fermentation) в мини-ферментерах по одной микробиологической петле каждого штамма, выращенного на L-агаре, было перенесено в L-бульон и выращивались при 30°С на роторной качалке (скорость вращения 140 об/мин) до достижения культурой оптической плотности OD₅₄₀≈2.0. После этого 25 мл посевной культуры вносили в 250 мл ферментационной среды и выращивали при 29°С на роторной качалке (1500 об/мин). Продолжительность ферментации составляла примерно 35-40 часов. После выращивания количество гистидина, накопленное в среде, определялось методом бумажной хроматографии. Бумага экспонировалась с подвижной фазой следующего состава: н-бутанол: уксусная кислота: вода=4:1:1 (v/v). В качестве реагента для визуализации использовался 2% раствор нингидрина в ацетоне.

Состав среды для ферментации (рН 6.0) (г/л):

Глюкоза 100.0

Мамено 0.2 суммарного азота

(NH₄)₂SO₄ 8.0

КН₂PO₄ 1.0

MgSO₄×7H₂O 0.4

FeSO₄×7H₂O 0.02

MnSO₄ 0.02

Тиамин 0.001

Бетаин 2.0

L-пролин 0.8

L-глутамат 3.0

L-аспартат 1.0

Аденозин 0.1

Полученные данные представлены в таблице.

Как видно из таблицы, использование мутантного гена prsA, кодирующего ФРПФ синтетазу, устойчивую к ингибированию пуриновыми нуклеотидами по принципу обратной связи, увеличивает продукцию гистидина штаммом Е. coli 80.