БАКТЕРИЯ, ПРИНАДЛЕЖАЩАЯ К РОДУ ESCHERICHIA, - ПРОДУЦЕНТ L-АРГИНИНА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА

Область техники

Настоящее изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способу получения L-аминокислоты с использованием бактерии, принадлежащей к семейству Enterobacteriaceae, в которой оперон nir, включающий в себя гены nirBDC-cysG, инактивирован.

Описание предшествующего уровня техники

В клетке Escherichia coli существует два биохимически различных фермента нитритредуктазы, кодируемые оперонами nfrABCDEFG и nirBDC (Cole, J., FEMS Microbiol. Lett. 136:1-11 (1996)). Базовый уровень экспрессии оперона nir примерно в 8 раз выше соответствующей активности оперона nir и возрастает в 21 раз при добавлении нитрата (Wang, Н. and Gunsalus, Н.Р., J. Bacteriol., 182, №20, р.5813-5822 (2000)). Транскрипция оперона nirBDC производится с одного промотора, и экспрессия активируется двумя типами сигналов, поступающих из окружающей среды: отсутствием кислорода и присутствием ионов нитритов или нитратов в среде культивирования (Jayaraman et al., J. Mol. Biol., 196,4:781-8 (1987); Page et al., Arch Microbiol., 154:4:349-54 (1990)). Также ген cysG транскрибируется совместно с опероном nirBDC, несмотря на то, что второй конститутивный промотор расположен менее чем за 100 п.о. от начала гена cysG (Peakman, Т. et al, Eur. J. Biochem., 191(2):325-331 (1990)).

Продукт гена cysG, сирогемсинтаза, катализирует синтез гема кофактора, сирогема, необходимый ферментам сульфитредуктазе и нитритредуктазе в процессе восстановления сульфата и нитрита. Сирогем-зависимое восстановление сульфита требуется для синтеза цистеина, метионина и других серосодержащих метаболитов, вне зависимости от того, что является источником серы - сульфат или сульфит (Becker, M.A. et al, J, Biol. Chem., 244:2418-2427 (1969); Becker, M.A. and Tomkins G.M., J. Biol. Chem., 244:6023-6030 (1969)).

Нитритредуктаза NirBD также является сирогем-содержащим ферментом, который использует NADH в качестве донора электрона для восстановления нитрита в цитоплазме (MacDonald, H. and Cole, J., Mol. Gen. Genet., 200:320-334 (1985); Peakman, Т. et al, Eur. J. Biochem., 191:315-323 (1990)). Мутанты Е.coli, дефективные по гену nirB, лишены NADH-зависимой активности нитритредуктазы и медленно восстанавливают нитрит в анаэробных условиях. Этим мутантам для роста требуется цистеин (Cole, J.A. et al, J. Gen. Microbiol. 120:475-483 (1980)).

Ауксотрофность по цистеину у мутантов cysG обусловлена неспособностью этих мутантов синтезировать сирогем, кофактор фермента CysIJ. Сирогем-зависимое восстановление сульфита необходимо для биосинтеза цистеина, метионина и других серо-содержащих метаболитов, вне зависимости от того, что является источником серы - сульфат или сульфит (Becker, M.A. et al, J. Biol. Chem., 244:2418-2427 (1969); Becker, M.A. and Tomkins, G.M., J. Biol. Chem., 244:6023-6030 (1969)). Поскольку сирогем также необходим для нитритредуктазы (NirB), мутанты cysG также не способны восстанавливать нитрит.

Промотор гена nir (P_nir) содержит сайт связывания FNR (позиция - 41.5); сайт связывания NarL/NarP (позиция - 69.5) (Jayaraman, P.S. et al, Nucleic Acids Res. 17:1 135-45 (1989); Tyson, K.L. et al, Mol. Microbiol., 7:1:151-7 (1993)); сайт связывания Fis (-142, +23); сайт связывания IHF (-88); и ассоциированный с нуклеоидом белок H-NS, связывающийся преимущественно с последовательностью перед промотором nir.

Промотор nir репрессируется тремя белками, связывающимися с ДНК: Fis, IHF и H-NS. Активация экспрессии промотора nir зависит как от белка FNR (включающийся в анаэробных условиях активатор транскрипции), так и от белков NarL или NarP (активаторы транскрипции, регулирующиеся нитритом и нитратом). В анаэробных условиях FNR связывается с позицией -41.5, активируя транскрипцию оперона nir. Вместе с этим промотор nir регулируется присутствием в среде культивирования ионов нитрита или нитрата. Такая регуляция осуществляется за счет двух очень схожих белков респонс-регуляторного (response-regulator) семейства транскрипционных факторов, NarL и NarP (обзор Darwin, A.J. et al, Mol. MicrobioL, 20:3:621-32 (1996)). В ответ на присутствие в среде нитритов или нитратов NarL и NarP фосфорилируются связанными с мембраной сенсорными белками-киназами NarX и NarQ. Затем фосфорилированные NarL и NarP связываются со специфическими гептамерными последовательностями в целевых промоторах и либо усиливают, либо ослабляют инициацию транскрипции с этих промоторов (для примеров смотри Tyson, K.L. et al., Mol. MicrobioL, 13:6:1045-55 (1994); Darwin, A.J. et al., Mol. MicrobioL, 25:3:583-95 (1997)).

Ассоциация промотора nir с белками Fis, IHF и H-NS предполагает, что ДНК промотора nir образует высокоупорядоченную нуклео-протеиновую структуру, которая репрессирует FNR-зависимую активацию транскрипции. Белки NarL и NarP способны облегчить репрессию посредством как IHF-, так и Fis-белка, но не могут влиять на репрессию посредством H-NS-белка (Browning D.F. et al, Molecular Microbiology, 37(5), 1258-1269 (2000)).

Повышенная концентрация нитрита, необходимая для индукции nirB, соответствует предполагаемой роли белка NirB в детоксикации клетки (Fazzio, Т.G., and Roth, J.R., J. Bacteriol. 178:6952-6959 (1996)). Вторая возможная роль белка NirB - он утилизирует NADH, окисляя его, в условиях, когда в клетке существует избыток восстанавливающих эквивалентов. Такие условия складываются в клетке, когда за счет азотзависимого дыхания через NarG-нитратредуктазный комплекс вырабатывается значительное количество энергии. Таким образом, использование белка NirB позволяет клетке эффективно разделять катаболизм углерода и пути азотного дыхания с помощью непродуктивной рециклизации NADH-NAD (Wang, Н. and Gunsalus, R.P., J. Bacteriol., 182, №20, p.5813-5822 (2000)).

Но в настоящее время нет сообщений об инактивации оперона nir, используемой для продукции L-аминокислот.

Описание изобретения

Целью настоящего изобретения является увеличение продуктивности штаммов - продуцентов L-аминокислот и предоставление способа получения L-аминокислот с использованием указанных штаммов.

Указанная цель была достигнута путем установления того факта, что инактивация оперона nir может повысить продукцию L-аминокислоты, такой как L-аргинин. Таким образом было осуществлено настоящее изобретение. К настоящему изобретению относятся:

1). Бактерия, принадлежащая к семейству Enterobacteriaceae - продуцент L-аминокислоты, которая модифицирована таким образом, что в ней инактивирован оперон nir.

2). Бактерия - продуцент L-аминокислоты в соответствии с пунктом 1, в которой оперон nir включает в себя гены nirBDC и cysG.

3). Бактерия - продуцент L-аминокислоты в соответствии с пунктом 2, где бактерия принадлежит к роду Escherichia.

4). Бактерия - продуцент L-аминокислоты в соответствии с пунктами с 1 по 3, где L-аминокислотой является L-аргинин.

5). Способ получения L-аминокислоты, включающий стадии:

- выращивания бактерии в соответствии с любым из пунктов 1-4 в питательной среде с целью продукции и накопления L-аминокислоты и

- выделения L-аминокислоты из культуральной жидкости.

6). Способ в соответствии с пунктом 5, в котором L-аминокислотой является L-аргинин.

7). Способ в соответствии с пунктом 6, в котором указанная бактерия модифицирована таким образом, что экспрессия оперона биосинтеза L-аргинина повышена.

Настоящее изобретение более детально будет описано ниже.

1. Бактерия согласно настоящему изобретению

Бактерией согласно настоящему изобретению является бактерия, принадлежащая к семейству Enterobacteriaceae, - продуцент L-аминокислоты, которая модифицирована с целью инактивации оперона nir.

Согласно настоящему изобретению «бактерия - продуцент L-аминокислоты» означает бактерию, обладающую способностью к накоплению L-аминокислоты в питательной среде, в условиях, когда бактерия согласно настоящему изобретению выращивается в указанной питательной среде. Способность к продукции L-аминокислоты может быть придана или улучшена путем селекции. Термин «бактерия - продуцент L-аминокислоты», использованный здесь, также означает бактерию, обладающую способностью к продукции и накоплению L-аминокислоты в питательной среде в количестве большем, чем родительский штамм или штамм дикого типа Е.coli, такой как штамм Е.coli К-12.

Семейство Enterobacteriaceae включает в себя бактерии, принадлежащие к родам Escherichia, Erwinia, Providencia и Serratia. Род Escherichia предпочтителен.

Термин «бактерия, принадлежащая к роду Escherichia», означает, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, использованного в настоящем изобретении, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (E.coli).

Круг бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, не ограничен каким-либо образом, однако, например, бактерии, описанные в Neidhardt, F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Таблица 1) могут быть упомянуты.

Термин «оперон nir инактивирован» означает, что указанный целевой оперон модифицирован таким образом, что модифицированный ген оперона кодирует мутантный белок с пониженньм уровнем активности, или такой ген кодирует абсолютно неактивный белок. Также возможно, что модифицированный участок ДНК не способен к естественной экспрессии оперона вследствие делеции части указанного оперона, сдвига рамки считывания гена (генов) оперона или модификации участка ДНК, примыкающего к оперону, включая последовательности, контролирующие экспрессию оперона, такие как промотор(ы), энхансер(ы), аттенуатор(ы) и так далее. Поскольку экспрессия оперона nir осуществляется с единственного промотора, расположенного перед геном nirB, a базовый уровень конститутивной экспрессии гена cysE, осуществляемого с собственного слабого промотора, недостаточен для синтеза сирогема, то возможно инактавировать только ген nirB таким образом, чтобы дальнейшая экспрессия генов оперона, расположенных за геном nirB, стала невозможной. Роль нитритредуктазы, кодируемой геном nirB, в продукции L-аргинина клеткой остается неясной. Возможное объяснение заключается в том, что инактивация гена nirB блокирует транскрипцию гена cysG с промотора nirB, а транскрипции гена cysG со своего собственного слабого промотора недостаточно для синтеза сирогема. Это ведет к дефициту синтеза цистеина, метионина и других серосодержащих метаболитов в клетке, индуцирующих путь биосинтеза L-аргинина. Таким образом, возможная реализация настоящего изобретения включает в себя инактивацию и разрушение гена cysG.

Оперон nir из E.coli включает в себя следующие последовательно расположенные гены: nirB, nirD, nirC и cysG. Гены nirB и nirD кодируют нитритредуктазу. Ген nirC кодирует транспортер нитрита. Ген cysG кодирует сирогемсинтазу. Ген nirB (gi:16131244; номера нуклеотидов с 3491648 по 3494191 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в базе данных GenBank), ген nirD (gi:16131245; номера нуклеотидов с 3494188 по 3494514 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в базе данных GenBank), ген nirC (gi:16132233; номера нуклеотидов с 3494640 по 3495446 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в базе данных GenBank) и ген cysG (gi:16131246; номера нуклеотидов с 3495465 по 3496838 в последовательности с инвентарньм номером NC_000913.1 в базе данных GenBank) расположены между открытыми рамками считывания yhfC и yhfL в хромосоме штамма Е.coli К-12.

Инактивация указанного гена может быть осуществлена традиционными методами, такими как мутагенез с использованием УФ-излучения или обработка нитрозогуанидином (N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин), сайт-направленный мутагенез, разрушение гена с использованием гомологичной рекомбинации и/или инсерционно-делеционный мутагенез (Datsenko K.A. and Warmer B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12:6640-45), также называемый «Red-driven integration» (интеграция с использованием Red-системы).

Бактерия - продуцент L-аргинина.

В качестве бактерии согласно настоящему изобретению, которая должна быть модифицирована с целью инактивации гена nirB, могут быть использованы бактерии - продуценты L-аргинина.

Примерами бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, которые обладают способностью к продукции L-аргинина, являются штамм Е.coli 237 (ВКПМ В-7925) и его производные, содержащие мутантную N-ацетилглутаматсинтетазу (Российская патентная заявка №2001112869), штамм-продуцент аргинина, в который введен ген argA, кодирующий N-ацетилглутаматсинтетазу (Выложенная патентная заявка Японии №57-5693) и подобные им.

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем инактивации оперона nir в бактерии, уже обладающей способностью к продукции L-аминокислот. Другой способ получения бактерии согласно настоящему изобретению состоит в придании бактерии с уже инактивированным опероном nir способности к продукции L-аминокислот.

Методы получения плазмидных ДНК, расщепления и лигирования ДНК, трансформации, подбора олигонуклеотидов в качестве затравок и подобные им являются традиционными методами, хорошо известными специалисту в данной области. Эти методы описаны, например, в Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, Т., «Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition», Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

2. Способ согласно настоящему изобретению

Способом согласно настоящему изобретению является способ получения L-аминокислот, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления L-аминокислоты в питательной среде и выделения L-аминокислоты из культуральной жидкости. В частности, способом согласно настоящему изобретению является способ получения L-аргинина, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления L-аргинина в питательной среде и выделения L-аргинина из культуральной жидкости.

В настоящем изобретении выращивание, выделение и очистка L-аминокислоты из культуральной или подобной ей жидкости может быть осуществлена способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых аминокислота продуцируется с использованием бактерии.

Питательная среда, используемая для выращивания, может быть как синтетической, так и натуральной, при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и, если необходимо, соответствующее количество питательных добавок, необходимых для роста бактерий. К источникам углерода относятся различные углеводы, такие как глюкоза и сахароза, а также различные органические кислоты. В зависимости от характера ассимиляции используемого микроорганизма могут использоваться спирты, такие как этанол и глицерин. В качестве источника азота могут использоваться различные неорганические соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов, ферментолизат микроорганизмов. В качестве минеральных добавок могут использоваться фосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные им соединения. В качестве витаминов могут использоваться тиамин и дрожжевой экстракт.

Выращивание осуществляется предпочтительно в аэробных условиях, таких как перемешивание культуральной жидкости на качалке, взбалтывание с аэрацией, при температуре в пределах от 20 до 40°С, предпочтительно в пределах от 30 до 38°С. рН среды поддерживают в пределах от 5 до 9, предпочтительно от 6.5 до 7.2. рН среды может регулироваться аммиаком, карбонатом кальция, различными кислотами, основаниями и буферными растворами. Обычно выращивание в течение от 1 до 5 дней приводит к накоплению целевой L-аминокислоты в культуральной жидкости.

После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрацией через мембрану, а затем L-аминокислота может быть выделена и очищена методами ионообменной хроматографии, концентрирования и кристаллизации.

На Фиг.1 показаны относительные положения затравок nirBL и nirBR на плазмиде pACYC184, использованных для амплификации гена cat.

На Фиг.2 показана конструкция хромосомного фрагмента, содержащего инактивированный оперон nir.

Наилучший способ осуществления изобретения

Более детально настоящее изобретение будет разъяснено ниже со ссылкой на примеры.

Пример 1. Конструирование штамма с инактивированным опероном nir.

1. Делеция в гене nirB.

Делеция в гене nirB была получена с использованием метода, впервые разработанного Datsenko и Wanner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12), 6640-6645), также называемого интеграцией с использованием Red-системы. Для этого были сконструированы затравки для ПЦР nirBL (SEQ ID NO:1) и nirBR (SEQ ID NO:2), гомологичные как участкам, прилегающим к гену nirB, так и участкам гена, придающему устойчивость к антибиотику и находящемуся на плазмиде, использованной в качестве матрицы для ПЦР. Плазмида pACYC148 (NBL Gene Sciences Ltd., UK) (инвентарный номер Х06403 в GenBank/EMBL) была использована в качестве матрицы для ПЦР. Условия ПЦР были следующими: денатурация 3 мин при 95°С; первые два цикла: 1 мин при 95°С, 30 сек при 50°С, 40 сек при 72°С; следующие двадцать пять циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 54°С, 40 сек при 72°С; последняя стадия 5 мин при 72°С.

Полученный продукт ПЦР длиной 945 п.о. (Фиг.1, SEQ ID NO:3) был очищен в агарозном геле и использован для электропорации штамма Е. coli MG1655, содержащего плазмиду pKD46 с термочувствительным репликоном. Плазмида pKD46 (Datsenko и Wanner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12), 6640-6645)) содержит фрагмент ДНК длиной 2154 нуклеотида (31088-33241) фага λ (инвентарный номер J02459 в GenBank), содержащий гены системы гомологичной рекомбинации λ Red (гены γ, β, ехо), находящихся под контролем промотора Р_агаВ, индуцируемого арабинозой. Плазмида pKD46 необходима для интеграции продукта ПЦР в хромосому штамма MG1655.

Электрокомпетентные клетки были приготовлены следующим образом: ночная культура штамма Е.coli MG1655, выросшая при 30°С в LB среде, содержащей ампициллин (100 мг/л), была разбавлена в 100 раз 5 мл среды SOB (Sambrook et al, «Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition», Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) с ампициллином и L-арабинозой (1 mM). Полученную культуру выращивали при аэрации при 30°С до достижения оптической плотности OD₆₀₀≈0.6 и затем делали электрокомпетентной путем концентрирования в 100 раз и тройной промывкой деионизованной водой, охлажденной во льду. Электропорацию осуществляли, используя 70 мкл клеток и 100 нг продукта ПЦР. После электропорации клетки инкубировали в 1 мл среды SOC (Sambrook et al, «Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition», Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) при 37°С в течение 2,5 часов, после этого высевали на L-агар и растили при 37°С для отбора Cm^R рекомбинантов. Затем для элиминирования плазмиды pKD46 осуществляли два пассажа на L-агаре с Cm при 42°С и полученные клоны проверяли на чувствительность к ампициллину.

2. Подтверждение наличия делеции в гене nirB методом ПЦР.

Мутанты, содержащие делецию в гене nirB и маркированные геном устойчивости к Cm, были проверены с помощью ПЦР. Для этого были использованы локус-специфические затравки nirBl (SEQ ID NO:4) и nirB2 (SEQ ID NO:5). Условия ПЦР были следующими: денатурация 3 мин при 94°С; тридцать циклов: 30 сек при 94°С, 30 сек при 54°С, 1 мин при 72°С; последняя стадия 7 мин при 72°С. Продукт ПЦР, полученный с использованием в качестве матрицы ДНК из клеток родительского nirB⁺ штамма MG1655, был длиной в 949 пар нуклеотидов. Продукт ПЦР, полученный с использованием в качестве матрицы ДНК из клеток мутантного штамма MG1655 ΔnirB::cat, был длиной в 1400 пар нуклеотидов (Фиг.2).

3. Конструирование штамма - продуцента L-аргинина с инактивированным геном nirB.

Штамм E.coli 237 (ВКПМ В-7925) - продуцент L-аргинина был подвергнут стандартной процедуре Р1 трансдукции для получения устойчивости к Cm (Sambrook et al, ″Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition″, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). В качестве донора использовали штамм MG1655 ΔnirB::cat. Полученный штамм 237 ΔnirB::cat был проверен с помощью ПЦР на наличие делеции ΔnirB::cat с использованием затравок nirB1 (SEQ ID NO:4) и nirB2 (SEQ ID NO:5).

Пример 2. Продукция L-аргинина штаммом с инактивированным геном nirB.

Оба штамма 237 и 237 ΔnirB::cat выращивали в течение ночи при 37°С на чашках с L-агаром, содержащим хлорамфеникол (20 мкг/мл). Затем по одной петле клеток переносили в пробирки 20×200 мм, содержащие 2 мл среды для ферментации. Клетки инкубировались при 32°С в течение 72 часов на роторной качалке при 250 об/мин.

После выращивания количество аргинина, накопленное в среде, определялось методом бумажной хроматографии. В качестве стандартов использовались растворы аргинина (1 и 2 г/л) и глутамата (1 и 2 г/л). Бумага экспонировалась с подвижной фазой следующего состава: н-бутанол: уксусная кислота: вода=4:1:1 (v/v). В качестве реагента для визуализации использовался 0,5% раствор нингидрина в ацетоне.

Результаты представлены в Таблице 1.

Состав среды для ферментации (г/л):

Глюкозу и сульфат магния стерилизовали отдельно. рН доводили до 7.2.

Как видно из Таблицы 1, инактивация оперона nir увеличивает накопление L-аргинина штаммом - продуцентом L-аргинина Е.coli 237.