Результат интеллектуальной деятельности: БАКТЕРИЯ, ПРИНАДЛЕЖАЩАЯ К РОДУ Escherichia,- ПРОДУЦЕНТ L-ГИСТИДИНА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ГИСТИДИНА

Область техники.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения L-аминокислоты, такой как L-гистидин, методом ферментации, и более конкретно к гену, полученному из бактерии Escherichia coli. Этот ген является полезным для улучшения продукции L-гистидина.

Предшествующий уровень техники

Традиционно L-аминокислоты в промышленном масштабе могут быть получены методом ферментации с использованием штаммов микроорганизмов, полученных из природных источников, или их мутантов, специально модифицированных для того, чтобы увеличить продукцию L-аминокислот.

Описано множество методов увеличения продукции L-аминокислот, например, путем трансформации микроорганизма рекомбинантной ДНК (см., например, патент США 4278765). Указанные методы основаны на повышении активности ферментов, вовлеченных в биосинтез аминокислот, и/или уменьшении чувствительности целевого фермента к ингибированию продуцируемой L-аминокислотой по принципу обратной связи (см., например, выложенную патентную заявку Японии №56-18596 (1981), WO 95/16042 или патенты США 5661012 и 6040160).

В пути биосинтеза L-гистидина фермент имидазолглицеролфосфатсинтаза, кодируемая генами hisH и hisF, катализирует реакцию, в ходе которой высвобождается промежуточное соединение, 5'-фосфорибозил-4-карбоксамид-5-аминоимидазол (AICAR). В то же время первая реакция пути биосинтеза L-гистидина катализируется белком HisG и представляет собой замену С-1 фосфорибозилпирофосфата (PRPP) на N-1 пуринового кольца аденозинтрифосфата (АТФ). Но AICAR является не только побочным продуктом пути биосинтеза гистидина, но также и предшественником в пути биосинтеза пуринов и, следовательно, пуриновых нуклеозидов и нуклеотидов, таких как АМФ и АТФ. Таким образом, превращение AICAR в АМР представляет собой важный процесс для продукции L-гистидина.

Ген purH кодирует бифункциональный белок с активностью AICAR трансформилазы (5'-фосфорибозил-4-карбоксамид-5-аминоимидазол трансформилаза) [ЕС 2.1.2,3] и IMP циклогидролазы [ЕС 3.5.4.10], катализирующий предпоследний и последний этапы синтеза de novo инозинмонофосфата (IMP), соответственно (Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C.Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996).

Но в настоящее время нет данных, описывающих влияние повышения активности AICAR трансформилазы-IMP циклогидролазы, кодируемой геном purH, для улучшения продукции L-гистидина с использованием штаммов семейства Enterobacteriaceae.

Описание изобретения

Целью настоящего изобретения является увеличение продуктивности штаммов, продуцирующих L-гистидин, и предоставление способа получения L-гистидина с использованием указанных штаммов.

Данная цель была достигнута путем обнаружения того факта, что ген purH, кодирующий AICAR трансформилазу (5'-фосфорибозил-4-карбоксамид-5-аминоимидазол трансформилаза) [ЕС 2.1.2.3] и IMP циклогидролазу [ЕС 3.5.4.10], не вовлеченную в путь биосинтеза целевой L-аминокислоты, увеличивает продукцию L-гистидина в случае, когда дополнительные копии указанного гена введены в клетки соответствующего штамма - продуцента. Таким образом, было совершено настоящее изобретение.

Настоящее изобретение включает в себя следующее.

1. Бактерия - продуцент L-гистидина, принадлежащая к семейству Enterobactericiceae, обладающая повышенной активностью любого из ферментов, участвующих в превращении 5'-фосфорибозил-4-карбоксамид-5-аминоимидазола (AICAR) в инозин-5'-монофосфат (IMP).

2. Бактерия в соответствии с п.1, где указанная бактерия обладает повышенной активностью AICAR трансформилазы - IMP циклогидролазы.

3. Бактерия в соответствии с п.2, где указанная бактерия принадлежит к роду Escherichia.

4. Бактерия в соответствии с п.3, в которой активность AICAR трансформилазы - IMP циклогидролазы, повышена путем увеличения экспрессии гена, кодирующего AICAR трансформилазу - IMP циклогидролазу.

5. Бактерия в соответствии с п.4, в которой активность AICAR трансформилазы - IMP циклогидролазы увеличена путем увеличения количества копий гена, кодирующего AICAR трансформилазу - IMP циклогидролазу, или путем изменения последовательности для регуляции экспрессии указанного гена таким образом, что происходит повышение экспрессии указанного гена.

6. Бактерия в соответствии с п.5, в которой количество копий указанного гена увеличено путем трансформации вышеупомянутой бактерии многокопийным вектором, содержащим ген, кодирующий AICAR трансформилазу - IMP циклогидролазу.

7. Бактерия, в соответствии с п.6, в которой количество копий указанного гена увеличено путем интеграции дополнительных копий гена, кодирующего AICAR трансформилазу - IMP циклогидролазу, в хромосому указанной бактерии.

8. Бактерия в соответствии с любым из п.п. с 2 по 7, в которой ген, кодирующий AICAR трансформилазу - IMP циклогидролазу, получен из бактерии, принадлежащей роду Escherichia.

9. Бактерия в соответствии с п.8, в которой ген, кодирующий AICAR трансформилазу - IMP циклогидролазу, кодирует следующий белок (А) или (Б):

(A) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, приведенной в списке последовательностей под номером SEQ ID NO:2;

(B) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в аминокислотную последовательность, приведенную в списке последовательностей под номером SEQ ID NO:2, и который обладает активностью AICAR трансформилазы - IMP циклогидролазы.

(здесь и далее, белки, описанные в вышеупомянутых пунктах (А) или (В), упоминаются как "белки согласно настоящему изобретению")

10. Бактерия, в соответствии с п.8, в которой ген, кодирующий AICAR трансформилазу - IMP циклогидролазу, представлен следующей последовательностью ДНК (а) или (б):

(а) ДНК, содержащая последовательность нуклеотидов с 1 по 1590 в списке последовательностей под номером SEQ ID NO:1; или

(б) ДНК, которая гибридизуется с нуклеотидной последовательностью 1-1590 в последовательности SEQ ID NO:1 или пробой, которая может быть приготовлена из указанной нуклеотидной последовательности, в жестких условиях, и кодирует белок, обладающий активностью AICAR трансформилазы - IMP циклогидролазы.

11. Бактерия в соответствии с п.10, где жесткими условиями являются условия, при которых отмывка производится при 60°С, а концентрация солей соответствует 1×SSC и 0,1% SDS, а время отмывки составляет 15 минут.

12. Способ получения L-гистидина, включающий стадии выращивания бактерии в соответствии с пунктами с 1 по 11, в питательной среде с целью продукции и накопления L-гистидина, и выделения L-гистидина из культуральной жидкости.

13. Способ в соответствии с п.12, в котором у указанной бактерии повышена экспрессия генов биосинтеза L-гистидина.

Настоящее изобретение более детально будет описано ниже.

Бактерией, согласно настоящему изобретению, является бактерия - продуцент L-гистидина, принадлежащая к семейству Enterobacteriaceae, в которой увеличена активность любого из белков, участвующих в превращении 5'-фосфорибозил-4-карбоксамид-5-аминоимидазола (AICAR) в инозин-5'-монофосфат (IMP). Конкретно, бактерией, согласно настоящему изобретению является бактерия - продуцент L-гистидина, принадлежащая к роду Escherichia, в которой продукция L-гистидина указанной бактерией увеличена за счет повышения в клетке бактерии активности белка согласно настоящему изобретению, а именно AICAR трансформилазы - IMP циклогидролазы. Более конкретно, бактерия согласно настоящему изобретению, содержит ДНК, в которой повышена экспрессия гена purH на хромосоме или на плазмиде в бактерии, и обладает повышенной способностью к продукции L-гистидина.

Термин «бактерия, обладающая способностью к продукции L-гистидина» означает бактерию, способную накапливать L-гистидин в среде, когда такая бактерия согласно настоящему изобретению культивируется в питательной среде. Способность к продукции L-гистидина может быть придана или усилена селекцией. Используемый здесь термин «бактерия, обладающая способностью к продукции L-гистидина» также означает бактерию, способную производить и накапливать в культуральной среде L-гистидин в количествах, больших, чем природный или родительский штаммы, и, прежде всего, означает, что микроорганизм способен производить и накапливать в среде L-гистидин в концентрациях не меньше, чем 0,5 г/л, более предпочтительно, не меньше, чем 1,0 г/л.

Семейство Enterobacteriaceae включает в себя бактерии, принадлежащие к родам Escherichia, Erwinia, Providencia и Serratia. Род Escherichia предпочтителен.

Термин «бактерия, принадлежащая к роду Escherichia» означает, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, использованного в настоящем изобретении, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (Е.coli).

Термин «фермент, участвующий в «превращении 5'-фосфорибозил-4-карбоксамид-5-аминоимидазола (AICAR) в инозин-5'-монофосфат (IMP)» включает в себя белки, обладающие активностью AICAR трансформилазы и IMP циклогидролазы. В общем, в природных организмах обе ферментативные активности представлены в одном «слитом» белке. Но случаи, когда указанные ферментативные активности представлены различными белками, также являются частью настоящего изобретения. Также частью настоящего изобретения является случай, когда активность одного из белков повышена, предпочтительно AICAR трансформилазы.

Термин «активность AICAR трансформилазы-IMP циклогидролазы» означает каталитическую активность реакции переноса остатка формила с 10-формилтетрагидрофолата на AICAR с последующим образованием пуринового кольца инозин-5'-монофосфата (IMP). Активность AICAR трансформилазы-IMP циклогидролазы может быть измерена с помощью метода, описанного, например у Ni, L. et al (Gene, 106(2): 197-205 (1991)) с использованием AICAR и (6-R)N10-формилтетрагидрофолата в качестве субстратов. Также активность AICAR трансформилазы-IMP циклогидролазы может быть показана путем комплементации мутаций (в качестве примера смотри Aiba, A. and Mizobuchi, К., J. Biol. Chem. 264(35): 21239-46 (1989)).

Термин «обладающая повышенной активностью фермента» означает, что удельная активность белка выше, чем это же значение у немодифицированного штамма, например природного. В качестве примера можно привести случай, когда увеличено количество молекул AICAR трансформилазы-IMP циклогидролазы на клетку, случай, когда повышена специфическая активность AICAR трансформилазы-IMP циклогидролазы в пересчете на одну молекулу AICAR трансформилазы-IMP циклогидролазы и так далее. Далее, в качестве природного штамма, служащего объектом для сравнения, может быть упомянута, например, Escherichia coli К-12. Как результат повышения уровня внутриклеточной активности AICAR трансформилазы-IMP циклогидролазы может рассматриваться эффект увеличения количества накапливаемого в питательной среде L-гистидина.

Повышение уровня активности AICAR трансформилазы-IMP циклогидролазы в бактериальной клетке может быть достигнуто путем увеличения уровня экспрессии гена, кодирующего AICAR трансформилазу-IMP циклогидролазу. В качестве гена, кодирующего AICAR трансформилазу-IMP циклогидролазу, могут быть использованы гены, полученные из бактерий семейства Enterobacteriaceae, и гены, полученные из других бактерий, таких как коринеподобные бактерии. Среди вышеуказанных генов предпочтительны гены, полученные из бактерии, принадлежащей к роду Escherichia.

Нуклеотидная последовательность гена, кодирующего AICAR трансформилазу-IMP циклогидролазу из Escherichia coli (EC номера 2.1.2.3 и 3.5.4.10 соответственно), purH, уже определена (нуклеотиды с 4203521 по 4205110 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1, gi:16127994 в базе данных GenBank). Таким образом, ген purH может быть получен с помощью ПЦР (полимеразная цепная реакция; по White, T.J. et aL, Trends Genet., 5,185 (1989)) с использованием затравок, синтезированных на основе нуклеотидной последовательности указанного гена. Гены из других микроорганизмов, кодирующие AICAR трансформилазу-IMP циклогидролазу, могут быть получены таким же образом.

Примером гена purH, полученного из Escherichia coli, является ДНК, кодирующая следующий белок (А) или (В):

(A) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, приведенной в списке последовательностей под номером SEQ ID NO:2;

(B) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в аминокислотную последовательность, приведенную в списке последовательностей под номером SEQ ID NO:2, и который обладает активностью AICAR трансформилазы-IMP циклогидролазы.

ДНК, кодирующая вышеуказанные белки согласно настоящему изобретению, включает в себя ДНК, кодирующую белок, который может содержать делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в аминокислотную последовательность в одной или более позициях белка (А), при условии, что они не вызывают потерю активности указанного белка. Несмотря на то, что количество «нескольких» аминокислот различается в зависимости от положения и типа аминокислотного остатка в трехмерной структуре белка, оно может быть от 2 до 50, предпочтительно от 2 до 20, и более предпочтительно от 2 до 10 для белка (А). Это объясняется следующими фактами. Некоторые аминокислоты обладают высокой гомологией друг к другу и различия между такими аминокислотами не оказывает существенного влияния на трехмерную структуру белка и его активность. Таким образом, белком (В) может являться белок, имеющий гомологию не меньшую, чем от 30% до 50%, предпочтительно от 50% до 70% по отношению к общему количеству аминокислотных остатков, входящих в состав AICAR трансформилазы-IMP циклогидролазы, и обладающий активностью AICAR трансформилазы-IMP циклогидролазы.

Для оценки степени гомологии между ДНК возможно использование нескольких способов расчета, таких как BLAST search, FASTA search и CrustalW.

BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) это самообучающийся алгоритм поиска, используемый программами BLASTP, BLASTN, BLASTX, MEGABLAST, TBLASTN и TBLASTX; эти программы оценивают значимость найденных результатов с использованием статистических методов Karlin, Samuel и Stephen F. Altschul ("Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes". Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:2264-68; "Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences". Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90:5873-7). Способ поиска PASTA описан W. R. Pearson ("Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology, 1990 183:63-98). Способ ClustalW описан Thompson J.D., Higgins D.G. и Gibson T.J. ("CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice", Nucleic Acids Res. 1994, 22:4673-4680).

ДНК, кодирующая практически такой же белок, как белок, описанный в пункте (А), может быть получена, например, путем модификации нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, описанный в пункте (А), с использованием сайт-направленного мутагенеза таким образом, что один или несколько аминокислотных остатков будут удалены, заменены, введены или добавлены. Модифицированная подобным образом ДНК может быть получена традиционными методами, использующими обработку химическими реагентами и содержание в условиях, вызывающих мутации. К подобного рода обработкам относятся обработка ДНК, кодирующей белки согласно настоящему изобретению, с помощью гидроксиламина или обработка бактерии, содержащей ДНК, с помощью УФ-излучения или химического реагента, такого как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин или азотистая кислота.

К ДНК согласно настоящему изобретению относятся варианты, которые могут быть найдены в различных штаммах или вариантах бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, ввиду природного разнообразия. ДНК, кодирующая подобные варианты, может быть получена путем выделения ДНК, которая гибридизуется с геном purH или частью указанного гена в жестких условиях и которая кодирует белок, обладающий активностью AICAR трансформилазы-IMP циклогидролазы. Термин «жесткие условия», упомянутый здесь, означает условия, при которых образуются так называемые специфические гибриды, а неспецифические не образуются. Например, к жестким условиям относятся условия, при которых гибридизуются ДНК, обладающие высокой степенью гомологии, к примеру, ДНК, обладающие гомологией не менее 70% относительно друг друга. В качестве варианта примером жестких условий являются условия, соответствующие условиям отмывки при гибридизации по Саузерну, например, 60°С, 1×SSC, 0.1% SDS, предпочтительно 0,1×SSC, 0.1% SDS. В качестве зонда для ДНК, кодирующей варианты и гибридизующейся с геном purH, также может быть использована часть нуклеотидной последовательности под номером SEQ ID NO:1. Зонд подобного рода может быть получен в результате ПЦР с использованием в качестве затравок олигонуклеотидов, полученных на основе нуклеотидной последовательности под номером SEQ ID NO:1, и фрагмента ДНК, содержащего нуклеотидную последовательность под номером SEQ ID NO:1, в качестве матрицы. В случае, когда в качестве зонда используется фрагмент ДНК длиной около 300 пар оснований, условия отмывки при гибридизации соответствуют, например, 50°С, 2×SC и 0.1% SDS.

Трансформация бактерии с помощью ДНК, кодирующей белок, означает введение указанной ДНК в клетку бактерии, например, с помощью традиционных методов для того, чтобы усилить экспрессию генов, кодирующих белок согласно настоящему изобретению, и повысить активность белка в клетке бактерии.

К бактерии согласно настоящему изобретению также относятся бактерии, в которых активности белков согласно настоящему изобретению повышены путем трансформации бактерии с помощью ДНК, кодирующей белки, описанные в пунктах (А) или (В), или путем изменения регуляции экспрессии последовательности указанной ДНК в хромосоме упомянутой бактерии.

Упомянутая ДНК, использующаяся для модификации бактерии согласно настоящему изобретению, кодирует, как предполагается, белок, обладающий активностью AICAR трансформилазы-IMP циклогидролазы. Более конкретно, такой ДНК является ген purH. Ген purH может быть получен, например, с помощью ПЦР с использованием затравок, полученных на основе нуклеотидной последовательности, приведенной под номером SEQ ID NO:1.

К методам увеличения экспрессии генов относятся методы увеличения числа копий гена. Введение гена в вектор, способный к функционированию в бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, увеличивает число копий указанного гена. Для подобных целей могут быть предпочтительно использованы многокопийные векторы. Примерами многокопийных векторов являются pBR322, pUC19, pBluescript KS^ pACYC177, pACYC184, pAYC32, pMW119, pET22b и подобные им. Кроме того, усиление экспрессии гена может быть достигнуто путем введения некоторого числа копий гена в бактериальную хромосому, например, методом гомологичной рекомбинации или подобным.

С другой стороны, усиление экспрессии генов может быть достигнуто помещением ДНК согласно настоящему изобретению под контроль сильного промотора взамен природного. Сила промотора определяется частотой акта инициации синтеза РНК. Методы оценки силы промотора и примеры сильных промоторов описаны у Deuschle, U., Kammerer, W., Gentz, R., Bujard, H. (Promoters in Escherichia coli: a hierarchy of in vivo strength indicates alternate structures. EMBO J. 1986, 5, 2987-2994). Например, P_R промотор известен как сильный конститутивный промотор. В качестве сильных промоторов известны P_L промотор, lac промотор, trp промотор, trc промотор и подобные им.

Усиление трансляции может быть достигнуто путем введения в ДНК согласно настоящему изобретению более эффективной последовательности Shine-Dalgarno (SD последовательности) вместо природной SD последовательности, где под SD последовательностью подразумевается область, находящейся на цепи перед старт кодоном мРНК, взаимодействующая с 16SPHK рибосомы (Shine J. and Dalgarno L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1974, 71, 4, 1342-6).

Использование сильного промотора может быть совмещено с увеличением числа копий гена.

Методы получения хромосомной ДНК, гибридизации, ПЦР, получения ДНК плазмид, расщепления и лидирования ДНК, трансформации, отбора олигонуклеотидов в качестве затравок и другие подобные методы являются обычными методами, хорошо известными для специалиста в указанной области техники. Перечисленные методы описаны в Sambrook, J., and Russell D., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Third Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) или подобных изданиях.

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем введения вышеуказанных ДНК в бактерию, уже обладающую способностью к продукции L-гистидина. С другой стороны, бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем придания бактерии, уже содержащей указанные ДНК, способности к продукции L-гистидина.

В качестве родительских штаммов, в которых активность белка согласно настоящему изобретению будет повышена, могут быть использованы бактерии, принадлежащие к роду Escherichia, - продуценты L-гистидина, такие как штамм Е.coli 24 (VKPM B-5945, патент РФ 2003677); штамм E.coli 80 (ВКПМ В-7270, патент РФ 2119536); штаммы E.coli NRRL В-12116-В12121 (патент США 4388405); штаммы E.coli H-9342 (FERM ВР-6675) и Н-9343 (PERM BP-6676) (патент США 6344347); штамм E.coli H-9341 (FERM BP-6674) (Европейская патентная заявка 1085087А2); штамм E.coli AI80/pFM201 (патент США 6258554) и подобные им.

Желательно, чтобы бактерия - продуцент L-гистидина в дальнейшем была модифицирована с целью усиления экспрессии биосинтеза L-гистидина. К ключевым генам биосинтеза L-гистидина относятся ген hisG и гены оперона hisBHAFI, предпочтительно ген hisG, кодирующий АТФ фосфорибозилтрансферазу, устойчивую к ингибированию по принципу обратной связи (патенты РФ 20003677 и 2119536).

К способам согласно настоящему изобретению относится способ продукции L-гистидина, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления L-гистидина в питательной среде и выделения L-гистидина из культуральной жидкости.

Согласно настоящему изобретению выращивание, выделение и очистка L-гистидина из культуральной или подобной ей жидкости может быть осуществлена способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых аминокислота продуцируется с использованием микроорганизма. Питательная среда, используемая для выращивания, может быть как синтетической, так и натуральной, при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и, если необходимо, соответствующее количество питательных добавок, которые требуются микроорганизму для роста. К источникам углерода относятся различные углеводы, такие как глюкоза и сахароза, и различные органические кислоты. В зависимости от степени ассимиляции используемого микроорганизма могут использоваться спирты, такие как этанол и глицерин. В качестве источника азота могут использоваться различные соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов и ферментолизат микроорганизмов. В качестве минеральных добавок используются монофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные соединения. Некоторые питательные добавки могут быть, при необходимости, добавлены в питательную среду. Например, если микроорганизму для роста необходим пролин (ауксотрофия по пролину), соответствующее количество пролина может быть добавлено в питательную среду для выращивания.

Выращивание осуществляется предпочтительно в аэробных условиях, таких как перемешивание, ферментация с аэрацией, при температуре от 20 до 42°С, предпочтительно от 37 до 40°С. рН питательной среды находится в пределах от 5 до 9, предпочтительно от 6.5 до 7.2. рН среды может регулироваться аммиаком, карбонатом кальция, различными кислотами, основаниями и буферами. Обычно выращивание в течение от 1 до 5 дней приводит к накоплению целевой L-аминокислоты в культуральной жидкости.

После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрацией через мембрану, а затем целевая L-аминокислота может быть собрана и очищена методами ионообменной хроматографии, концентрирования и кристаллизации.

Наилучший способ осуществления изобретения

Настоящее изобретение более детально описано со ссылкой на примеры. В указанных примерах аминокислоты являются аминокислотами L-конфигурации, если не указано иное.

Пример 1. Клонирование гена purH из E.coli.

Полная нуклеотидная последовательность штамма E.coli К-12 определена (Science, 277, 1453-1474, 1997). На основе приведенной нуклеотидной последовательности для амплификации гена purH были синтезированы затравки, приведенные под номерами 3 (затравка 1) и 4 (затравка 2) в Списке последовательностей. Затравка 1 содержит на 5'-конце сайт узнавания фермента рестрикции HindIII. Затравка 2 содержит на 5'-конце сайт узнавания фермента рестрикции XbaI.

Хромосомная ДНК штамма E.coli К.12, использованная в качестве матрицы для ПЦР, была получена стандартным методом. ПЦР осуществлялась на "Applied Biosystems GeneAmp PCR System 2400" в следующих условиях: начальная денатурация ДНК 5 минут при 95°С, затем 30 циклов денатурации 30 секунд при 95°С, отжиг 60 секунд при 55°С и наращивание фрагмента 120 секунд при 72°С; и финальная полимеризация в течение 7 минут при 72°С с использованием Taq-полимеразы (Fermentas, Литва). Полученный фрагмент ДНК, содержащий ген purH без промотора, был обработан рестриктазами HindIII и XbaI и подставлен под P_R промотор в вектор pMW119-P_R, предварительно обработанный теми же рестриктазами. Вектор pMW119-Р_R был сконструирован на основе коммерчески доступного вектора pMW119 путем введения промотора P_R из фага λ. Таким образом была получена плазмида pMW-P_R-purH.

Пример 2. Влияние усиления экспрессии гена purH на продукцию гистидина.

Были получены два штамма - продуцента L-гистидина. Один из штаммов содержал плазмиду с геном purH, другой штамм, будучи бесплазмидным, содержал дополнительную копию гена purH, интегрированную в бактериальную хромосому. Штамм E.coli 80 - продуцент гистидина был использован в качестве исходного штамма для трансформации плазмидой pMW-P_R-purH и для интеграции гена purH в бактериальную хромосому. Штамм 80 был описан в патенте РФ 2119536 и депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 113545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) под инвентарным номером ВКПМ В-7270.

Трансформация штамма 80 плазмидой pMW-P_R-purH производилась стандартными методами с получением штамма 80/pMW-P_R-purH.

Интеграция гена purH в хромосому штамма 80 осуществлялась в два этапа. Сначала штамм-продуцент гистидина 80 трансформировали плазмидой - хелпером, несущей репликон rep(р15А), ген транспозазы (гены cts62, ner, А, В из фага Mu-cts) и содержащей маркер Tet^R. Второй этап заключался в трансформации полученного штамма плазмидой pMW-P_R-purH. Для интеграции гена purH в бактериальную хромосому после теплового шока клетки были перенесены в 1 мл L-бульона, инкубировались в течение 20 минут при 44°С, затем 40 минут при 37°С, после чего были распределены по поверхности чашек с L-агаром, содержащих 10 мг/мл тетрациклина и 100 мг/мл ампициллина. Выросшие после инкубации в течение 48 часов при 30°С колонии были пересеяны в 1 мл L бульона и инкубировались еще в течение 72 часов при 42°С в пробирках. Около 10 колоний из каждой пробирки были проверены на устойчивость к ампициллину и тетрациклину. Колонии, чувствительные к обоим антибиотикам, были проверены на наличие в хромосоме дополнительных копий гена purH методом ПЦР с использованием затравки 1 (SEQ ID No 3) и затравки 3 (SEQ ID No 5). Затравка З содержит последовательность, комплементарную сайту attR фага Mu. Для приготовления матрицы для ПЦР свежевыращенную колонию ресуспендировали в 50 мкл воды и 1 мкл суспензии использовали для ПЦР. ПЦР производилась в следующих условиях: начальная денатурация ДНК 5 минут при 95°С, затем 30 циклов денатурации 30 секунд при 95°С, отжиг 60 секунд при 56°С и наращивание фрагмента 120 секунд при 72°С; и финальная полимеризация в течение 7 минут при 72°С. Несколько протестированных таким образом колоний, устойчивых к антибиотикам, содержали необходимый фрагмент ДНК 2000 п.о. Так был получен штамм 80::P_R-purH.

Штаммы 80, 80/pMW-P_R-purH и 80::P_R-purH выращивались при 29°С в течение 6 часов в питательном бульоне, содержащем 1 г/л стрептомицина. Затем 0.1 мл полученной культуры было перенесено в пробирки 20×200 мм с 2 мл питательной среды для ферментации и инкубировалось при 29°С в течение 65 часов на роторной качалке (350 об/мин). После выращивания количество гистидина, накопленное в среде, определялось методом бумажной хроматографии. Бумага экспонировалась с подвижной фазой следующего состава: н-бутанол:уксусная кислота:вода=4:1:1 (v/v). В качестве реагента для визуализации использовался 2% раствор нингидрина в ацетоне.

Состав среды для ферментации (рН 6.0) (г/л):

Глюкозу, пролин, бетаин и карбонат кальция стерилизовали отдельно. рН доводили до 6.0 до стерилизации.

Полученные данные представлены в Таблице 1.

Для ферментационного процесса (batch) в мини-ферментерах одна петля каждого из штаммов 80 и 80::Р_R-purH, выращенных на L-агаре, была перенесена в L-бульон и культивировалась при 30°С на роторной качалке (140 оборотов/минуту) до достижения культурой оптической плотности OD₅₄₀≈2.0. Затем 25 мл посевной культуры вносили в 250 мл среды для ферментации и выращивали при 29°С на роторной качалке (1500 оборотов/минуту). Продолжительность ферментации (batch) составляла примерно 35-40 часов. После культивации количество гистидина, накопленного в среде, определялось методом бумажной хроматографии, как указано выше.

Состав среды для ферментации (рН 6.0) (г/л):

Полученные данные представлены в Таблице 2.

Как видно из Таблиц 1 и 2, повышенная экспрессия гена purH увеличивает продукцию гистидина штаммом E.coli 80.