ШТАММ БАКТЕРИЙ Brevibacillus laterosporus, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ ШИРОКИЙ СПЕКТР БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии, в частности производству и применению биологических средств борьбы с фитопатогенными грибами, патогенными бактериями и микроскопическими водорослями. В последние годы широко используются биологические пестициды, обеспечивающие экологически приемлемые условия ведения сельского хозяйства. Микроорганизмы продолжают оставаться наиболее востребованными продуцентами различных соединений, обладающих антибактериальным эффектом. Возрастает интерес к биологическим агентам, подавляющим развитие микроскопических водорослей. Среди микроорганизмов, продуцирующих биологически активные соединения различной направленности, в последние годы особое место занимают спорообразующие грамположительные бактерии Brevibacillus laterosporus. Интерес к этим бактериям обусловлен отсутствием у них токсичности для теплокровных животных.

Штаммы В. laterosporus обладают рядом биотехнологических преимуществ: легко культивируются на относительно дешевых питательных средах, не требуют специальных условий для культивирования, штаммы бацилл могут поддерживаться в лабораторных условиях в течение длительного времени. В настоящее время описаны штаммы В. laterosporus, которые синтезируют ряд биологически активных соединений, в том числе антибиотики, пестицидные факторы, ферменты, альгициды, нематоциды и т.д. Вышесказанное свидетельствует о высоком биотехнологическом потенциале штаммов Brevibacillus laterosporus как возможных продуцентов широкого спектра антибиотических факторов.

Ряд описанных штаммов В. laterosporus могут использоваться в медицине. Так, штаммы В. laterosporus продуцируют большое число антибиотиков различной химической структуры и механизмов действия. Водорастворимый антибиотик небелковой природы латероспорамин обладал слабой ингибирующей активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий [1]. Аналог антибиотика спергуалина, 15-дезоксиспергуалин, обладал противоопухолевой активностью и выраженным иммунодепрессивным действием на различные трансплантационные модели [2-3].

Группа циклических декапептидов тироцидинового семейства - лолоатины, обладающих высокой антибиотической активностью против патогенных грамположительных бактерий, была выделена из морского штамма В. laterosporus [4]. Циклический декапептид латероцидин был выделен в России [5]. Учитывая токсикологическую безопасность и способность к быстрой колонизации кишечника некоторые штаммы В. laterosporus могут быть использованы как эффективные пробиотики. Так, бактерии В. laterosporus BOD входит в состав препаратов-пробиотиков в гастроэнтерологии, использующихся для лечения заболеваний, связанных с нарушением микрофлоры кишечника человека, что свидетельствует об их безопасности. Данный штамм оказывал антигрибной и антибактериальной эффекты [6]. Описаны штаммы В. laterosporus, обладающие инсектицидным эффектом против домашней мухи, личинок комаров, кукурузного корневого червя [7-9]. Инсектицид на основе штамма В. laterosporus вызывал 100%-ную гибель личинок и взрослых особей домашних мух [10].

Имеются данные об антагонистической активности В. laterosporus против возбудителей болезней растений. Штамм В. laterosporus использован при создании биологического фунгицида для защиты картофеля от фитопатогенных грибов [11]. Исходя из ряда данных, некоторые исследователи предлагают включать культуру В. laterosporus, наряду с другими почвенными бактериями, в состав бактериальных смесей, использующихся для потенцирования эффективности действия химических гербицидов [12].

Показано, что штаммы В. laterosporus могут подавлять развитие грибов, поражающих человека и животных. Введение животному культуры В. laterosporus снижало за 7 дней рост Candida albicans на 95-99% [13].

Пептидный антибиотик с мол. массой 1608 Да, продуцируемый штаммом, выделен из морского осадка. Антибиотик обладал наряду с фунгицидной активностью против Candida albicans и Aspergillus fumigatus, также антибактериальной активностью против ряда грамположительных и грамотрицательных бактерий [14].

Штамм В. laterosporus BOD, входящий в состав широко используемого пробиотика «Flora Balance», за 28 дней снижал долю Candida albicans в кишечном тракте человека со 100% до 19% [6]. Таким образом, бактерии В. laterosporus BOD проявляли себя как экологически безвредные транзитные организмы, обеспечивающие развитие здоровой или полезной микрофлоры пищеварительной системы.

Обработка почвы бактериями В. laterosporus увеличивала рост растений и повышала урожайность зерновых культур почти на 30% по сравнению с необработанной почвой [9]. Предварительная обработка почвы бактериями В. laterosporus снижала количество аэробных бактерий кишечной группы, что обеспечивало фиксацию щелочной среды почвы. Обработка целевых растений бактериями данного вида ингибировала развитие фитопатогенных бактерий и микроскопических грибов, что повышало урожайность растений [15].

К весьма интересным биологически активным соединениям следует отнести щелочную протеиназу с молекулярной массой около 30 кДа, являющуюся фактором патогенности для нематод [16]. О широком разнообразии биологически активных соединений, продуцируемых В. laterosporus, свидетельствует антагонистическая активность против белых червей [17]. В России описан циклический декапептид латероцидин, проявляющий антагонистическую активность против различных видов организмов, в том числе против простейших [5].

В настоящее время проводится интенсивный поиск новых штаммов бацилл, в том числе среди бактерий В. laterosporus, продуцентов липопептидов и циклопептидов, как потенциальных продуцентов антибиотиков широкого спектра действия. В этом плане, представляет интерес обнаруженная у некоторых штаммов В. laterosporus способность угнетать рост микроскопических водорослей - альгипидный эффект [18-19]. Проблема борьбы с микроводорослями в последние годы становится актуальной. Поступление промышленных, хозяйственно-бытовых и сельскохозяйственных сточных вод приводит к загрязнению водоемов, выражающемся в «цветении» воды за счет развития различных типов микроскопических водорослей, и, прежде всего, сине-зеленых водорослей (цианобактерий). Рост микроводорослей приводит к «цветению» водоемов и, в дальнейшем, сопровождается отмиранием их избыточной биомассы, выделением токсинов, нарушением кислородного режима, органолептическими проявлениями гниения. «Цветение воды» приводит к ухудшению качества воды, нежелательному для бытового, рекреационного, рыбо-хозяйственного, энергетического использования, вызывает ряд серьезных социальных и экономических последствий, что предопределяет необходимость борьбы с сине-зелеными бактериями и продуктами их метаболизма. Учитывая, что микроводоросли развиваются также в рисовых чеках, представляется актуальным поиск штаммов, обладающих альгицидным действием.

Задача заявляемого изобретения:

получить штамм бактерий, обладающих широким спектром антагонистической активности и совмещающих альгицидную, фунгицидную и антибактериальную активности.

Задача решена путем получения штамма бактерий Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-10531.

Заявляемый штамм получен в результате многоступенчатой селекции из природного штамма Brevibacillus laterosporus 16-336, выделенного из природных источников, и депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-10531.

В качестве ближайшего аналога заявляемого объекта рассмотрен штамм Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-9405, обладающий альгицидным действием. Штамм Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-10531 отличается от ближайшего аналога Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-9405 широким спектром антагонистической активности - альгицидной, фунгицидной и антибактериальной.

1. Культивирование штамма.

В качестве питательных сред использовали NBY, ASC, SG, YM следующего состава (мас.%):

среда NBY:

среда ASC:

среда SG:

среда YM:

Для приготовления агаризованных питательных сред в жидкие среды дополнительно добавляли агар-агар (2,0 мас.%).

2. Культурально-морфологические признаки.

Грамположительные подвижные палочки, перитрихи, размером 0,5-0,7×3,3-5,0 мкм, цепочек не образуют. Хорошо спорулирует в жидкой и на твердой питательной среде NBY.

При культивировании на агаризованной среде NBY через 48 часов при температуре 28-30°С штамм образует округлые колонии диаметром 3-5 мм светлого кремового цвета с гладкой поверхностью и неровным краем. Через 72-96 часа роста на питательной среде NBY штамм образует споры. В процессе споруляции образуется характерная каноэвидная структура, примыкающая к споре с одной из сторон. Свободные споры имеют эллиптическую форму. Размер спор 0,8-1,2×1,4-1,7 мкм.

3. Физиолого-биохимические свойства.

Культивирование штамма заявляемого штамма осуществляют в диапазоне температур 28-30°С при рН 6,8-7,2. Оптимальными являются температура для культивирования штамма В-10531 - 30°С и рН 7,0.

Штамм образует каталазу. Гидролизует казеин и желатину, не гидролизует крахмал. Мочевину не расщепляет. Не сбраживает сахарозу, арабинозу, ксилозу, лактозу. Сбраживает глюкозу, мальтозу, маннит, фруктозу. Глюкозу сбраживает без газа. Не образует ацетона. Образует лецитиназу, твин-эстеразу. Растет в присутствии лизопима.

На основании морфологических (наличие каноэвидной структуры, прикрепленной к споре) и физиолого-биохимических признаков штамм ВКПМ В-10531 отнесен к Brevibacillus laterosporus [20].

4. Антагонистическая активность.

Штамм проявляет антагонистическую активность по отношению к микроводорослям.

Штамм характеризуется широким спектром альгицидной активности и подавляет развитие следующих микроскопических водорослей (таблица 1).

Штамм проявляет также антагонистическую активность по отношению к фитопатогенным грибам: Fusarium solani, Fusarium graminearum, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Phomopsis helianthi, Phoma solanicola, Alternaria tenuis, Botrytis cinerea;

грамположительным бактериям: Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis;

грамотрицательным бактериям: Salmonella enteritidis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Культивирование штамма Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-10531 в средах ASC и SG.

Среды ASC и SG готовили на дистиллированной воде, доводили значение рН до 7,0, разливали в пробирки по 5-10 мл и стерилизовали в автоклаве при давлении 0,8 атм при температуре 120°С в течение 30 мин. Стерильность и рН контролировали путем отбора соответствующих проб. Затем в пробирки со средой ASC или SG вносили по 1 мл посевного материала, приготовленного следующим образом: в стандартную пробирку с 5 мл стерильной питательной среды NBY помещали бактериальную культуру, собранную петлей с твердой агаризованной среды NBY, и инкубировали в течение 16 часов при температуре 30°С со встряхиванием 250 об/мин. Содержимое пробирки, после светооптического контроля на отсутствие посторонней микрофлоры, использовали как посевной материал.

Заявляемый штамм культивировали в стандартных пробирках в 5 мл в жидких питательных средах ASC или SG в течение 72-96 часов при 28-30°С со встряхиванием при 250 об/мин. Методом световой микроскопии и высевом на питательный агар оценивали наличие бактериальных клеток и спор и отсутствие посторонней микрофлоры. К 96 часам культивирования наблюдали незначительное спорообразование - 5-10% спор, преимущественно - 90-95% вегетативных клеток. Микробиологическим методом оценивали титр колоний образующих единиц (КОЕ) штамма ВКПМ В-10531, который составлял ~1-2×10⁹/мл.

Пример 2.

Культивирование штамма Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-10531 в среде NBY.

Для культивирования заявляемого штамма В-10531 используют среду NBY [21]. Среду готовят на дистиллированной воде, доводят значение рН до 7,0; разливают в стандартные стеклянные конические плоскодонные колбы Эрленмейера объемом 750 см³ по 50 мл и стерилизуют при давлении 0,8 атм, температуре 120°С в течение 30 мин. После стерилизации колбы, с содержащейся в них средой, охлаждают до +20 С. Стерильность и рН среды контролируют путем отбора соответствующих проб. В качестве посевного материала используют 5 мл культуры ВКПМ В-10531, полученной при культивировании в среде NBY 16 часов при 30°С при встряхивании 250 об/мин. Отсутствие посторонней микрофлоры контролируют микроскопически. Продуктивность штамма определяют методом серийных разведений с последующим высевом на агаризованную среду. Наблюдается равномерный рост культуры по всему объему среды. К 96 часам культивирования наблюдается преимущественно 90-95% спор и 5-10% вегетативных клеток.

Микробиологическим методом оценивали титр КОЕ штамма ВКПМ В-10531, который составлял ~1×10⁹/мл.

Поддержание штамма ВКПМ В-10531 проводили на косяках в стандартных пробирках с агаризованной средой NBY.

Хранение штамма осуществляли после его лиофилизации. Вегетативную культуру клеток выращивали на агаризованной среде NBY до образования спор. Споры и оставшиеся клетки смывали защитной средой, содержащей стерилизованное обезжиренное молоко. Ампулы с суспензией клеток и спор выдерживали 15 мин при -70°С, а затем быстро переносили в камеру для сушки, соединенную с вакуумной системой лиофилизации (модель 75150 фирмы "Labkonko"). Время сушки составляло 4 часа. Лиофилизированные образцы хранили в холодильнике при температуре +4°С.

Пример 3.

Культивирование микроскопических водорослей, используемых для выявления альгицидных свойств штамма.

Использовали штаммы азотфиксирующих нитчатых видов микроскопических водорослей цианобактерий: Anabaena sp. 5781 - получен с кафедры микробиологии ЛГУ; Nostoc sp. A-10 - получен из коллекции IMET, Йена, ГДР; штаммы азот не фиксирующих цианобактерий Microcystis aeroginosa 905 и 562 получены из Института гидробиологии Китайской Академии наук (провинции Хубей, г.Ухань); штаммы зеленых (Cosmarium, Chlorella, Chlamydomonas) и морских водорослей (Amphidinium, Prorocentrum, Thalassiosira) получены с кафедры гидробиологии Биологического факультета МГУ.

Штаммы цианобактерий Аnаbаеnа, Nostoc и зеленых водорослей Cosmarium выращивали в модифицированной среде BG-11[22]. Штамм Chlorella vulgaris выращивали в среде Тамийя [23]. Штамм Chlamydomonas reinhardy выращивали в среде TAPs [24]. Штаммы Microcystis aeruginosa выращивали в среде В-12 [25]. Культуральные среды для морских водорослей: диатомовых - Thalassiosira - weissflogii и динофициевых - Amphidinium carterae и Prorocentrum micans готовили на искусственной морской воде соленостью 30 °/_oo, которую перед внесением добавок трехкратно пастеризовали. Затем в эту воду вносили добавки согласно прописи среды f/2 [26].

Штаммы микроводорослей выращивали в соответствующих каждому виду средах в 50-100 мл в стеклянных плоскодонных колбах емкостью 250 мл при 25-30°С без аэрации при комнатной температуре и круглосуточном освещении. Использовали люминесцентные лампы дневного белого света СВЕ ЛБУ-30, которые обеспечивали освещенность 40 мкмоль квантов м^-2c^-1 в области ФАР. Культуры морских водорослей: диатомовых - Thalassiosira weissflogii и динофициевых - Amphidinium carterae и Prorocentrum micans выращивали в помещенных на шейкер 1 л колбах (объем клеточной суспензии 0,5 л) при температуре 20°С и освещенности 30 мкмоль квантов·м^-2·с^-1 в области ФАР, создаваемой люминесцентными лампами дневного света. Продолжительность светового периода составляла 14 часов в сутки.

Пример 4.

Определение альгицидной активности штамма ВКПМ В-10531.

Альгицидную активность штамма выявляли при совместном культивировании. Для количественной оценки альгицидного эффекта к жидкой культуре сине-зеленых (Nostoc, Anabaena, Microcystis) и зеленых водорослей (Cosmarium, Chlorella, Chlamydomonas) добавляли 96-часовую культуру бацилл в соотношении 5:1 и определяли остаточную оптическую плотность по формуле: (ОП_О), как (ОП_т/ОП_н)×100, где ОП_Н - начальная ОП, ОП_Т - ОП после инкубации в течение Т часов соответственно.

Измеряли оптическую плотность (при длине волны 590 нм) смеси в нулевой момент времени и после совместной инкубации.

Альгицидную активность заявляемого штамма оценивали по снижению оптической плотности через 24 часа инкубации. Снижение оптической плотности смеси с Nostoc и Anabaena составляло 10 раз, a Microcystis, Cosmarium, Chlorella в полтора - два раза, что свидетельствовало о его литическом действии на микроводоросли (таблица 2). Лизис клеток микроводорослей выявляли также при оптической микроскопии.

Следует отметить значительную мутность инкубационных смесей Microcystis, Cosmarium, Chlorella, Chlamydomonas со штаммом ВКПМ В-10531. Однако при этом происходит обесцвечивание полученной смеси. Следует отметить, что цианобактерии Anabaena и Nostoc более чувствительны к воздействию культуральной жидкости изучаемого штамма и обесцвечивание клеток водорослей наступает уже к 1-2 часам совместного инкубирования. Микроскопически выявляли лизис вегетативных клеток всех видов микроводорослей.

Пример 5.

Определение спектра действия альгицидного фактора штамма ВКПМ В-10531.

Для оценки антагонистического (альгицидного) эффекта определяли изменение окраски инкубационных смесей планктонных форм микроводорослей и штамма ВКПМ В-10531. Микроводоросли синтезируют различные пигменты (хлорофилл, фикобилины, каротиноиды), которые и определяют их цвет. Во всех опытах наблюдали обесцвечивание инкубационных смесей микроводорослей со штаммом ВКПМ В-10531. Измерение оптической плотности смеси морских водорослей Amphidinium, Prorocentrum, Thalassiosira со штаммом ВКПМ В-10531 не представлялось возможным из-за физико-химических свойств - высокой мутности полученных суспензий.

Как следует из таблицы 3, все штаммы микроводорослей чувствительны к альгицидному действию штамма В-10531, но уровень их чувствительности различен в зависимости от времени воздействия. При оптической микроскопии выявляли лизис вегетативных клеток микроводорослей изученных таксономических типов.

Пример 6.

Определение фунгицидной активности штамма Brevibacitlus laterosporus ВКПМ В-10531.

Для выявления фунгицидной активности использовали культуральную жидкость штамма В-10531. Тестирование фунгицидной активности проводили методом лунок. Для этого тестируемые фитопатогенные грибы высевали в центр чашки Петри с картофельным агаром (мас.%: бакто-агар - 2,0; глюкоза - 1,5; картофельный отвар -до 1 л, рН - при 25°С - 7,2). В вырезанные в агаре лунки диаметром 10 мм вносили по 200 мкл 72-часовой культуральной жидкости штамма. Чашки инкубировали в темноте при комнатной температуре. Через 48 часов оценивали наличие или отсутствие зон подавления роста грибов. Эффективность фунгицидного действия определяли по диаметру зоны отсутствия роста фитопатогенных грибов.

Как следует из таблицы 4, заявляемый штамм подавлял рост мицелия исследованных фитопатогенных грибов.

Пример 7.

Определение спектра антибактериального действия штамма ВКПМ В-10531.

Антибактериальное действие культуры штамма В-10531 выявляли на грамположительных и грамотрицательных тест-бактериях. Тест-микроорганизмы культивировали при 37°С и 220 об/мин в течение 24 часов в бульоне Мюллера-Хинтона (Mueller Hinton Broth, HIMEDIA, India), мас.%: кислотный гидролизат казеина - 30,0; вытяжка из говядины - 1,75; растворимый крахмал - 0,15; рН - (при 25°С) - 7,4±0,2. Тестирование антибактериальной активности проводили методом лунок на плотной агаризованной среде. Для этого бактериальные тест-культуры с оптической плотностью 0,5 высевали на чашки Петри с 20 мл агаризованной среды Мюллера-Хинтона. Чашки оставляли при комнатной температуре на 30 мин, после чего в агаре вырезали лунки диаметром 4 мм, в которые вносили по 25 мкл образца культуральной жидкости (КЖ) штамма В-10531, культивируемого на средах NBY и ASC в течение 72 часов, а также фракций осадка и надосадка. Осадок отделяли центрифугированием на высокоскоростной центрифуге Eppendorf со скоростью 10000 об/мин в течение 15 мин при температуре 4°С. Осадок ресуспендировали в равном объеме стерильной дистиллированной воды. Чашки Петри с образцами фракций КЖ, осадка и надосадка инкубировали при 37°С. Антагонистическое действие штамма оценивали по наличию зоны задержки роста тест-бактерий через 24-48 часов и измерению зон ингибирования роста тест-микроорганизмов.

Как следует из таблицы 6, антибактериальная активность фракций штамма В-10531 различается в зависимости от среды культивирования как по спектру, так и по диаметру зоны задержки роста исследуемых тест-бактерий.

Список литературы

1. Shoji, J., Sakazaki, R., Wakisaka, Y., Koizumi, K., Mayama, M., Matsuura, S. and K.Matsumoto. J. Antibiotics. 1976, V.29, No.4, p.390-393.

2. Fudaba, Y., Fukuda, Y., Yamamoto, H., Ohdan, H., Shintaku, S., Shibata, S., Miyata, Y., Marubayashi, S, Asahara, Т., and Dohi, K. 1998 - Transplant. Proc., 1998, V.30, No.7, p.3582-3583.

3. Tanabe, K., Takahashi, K., Nemoto, K., Okada, M., Yasuo, M., Hayasaka, Y., Toma, H., and Ota, K.J.Urol. Vol., 1994, V.152, No.2, part 1, p.562-566.

4. Gerard J., Haden P., Kelly M., Andersen R. J. Nat. Prod., 1999, V.62 (1), p.80-85.

5. Патент РФ №2229520.

6. Huynh H., Le Hong Due, Cutting S. FEMS Microbiology Rev., 2005, V.29, p.813-835.

7. Кузнецова Н.И., Смирнова Т.А., Шамшина Т.Н., Ганушкина Л.А., Азизбекян P.P. Биотехнология, 1995, т.3-4, с.11-16.

8. Орлова М.В.. Smirnova Т.А., Ganushkina L.A., Yacubovich V.Y., Азизбекян P.P. Appl. Environ. Microbiol., 1998, v.64, N.7, p.2723-2728.

9. Aronson A., Dunn P. U.S. Patent No.5055293, 1993.

10. Ruiu L., Satta A., Floris I. Environ Entomol., 2008, V.37 (2), p.505-509.

11. Патент РФ 2242125.

12. Branly K., Atkins R. U.S. Patent No.6232270. 2001.

13. O′Donnell В. Patent U.S. No.5455028, 1995.

14. Ren Z.Z., Zheng Y., Sun M., Liu J.Z., Wang Y.J. Wei Sheng Wu Xue Bao., 2007, V.47 (6), p.997-1001.

15. O'Donnell В. Patent U.S. No.5702701. 1997.

16. Qiuhong N.. Xiaowei H., Baoyu Т., Jinkui Y., Jiang L., Lm Z., Keqin Z.. Appl Microbiol Biotechnol., 2007, V.74(2), p.372-380.

17. Chang S.F., Wan Y.L., Cui J.Y., Wang B.S. Acta Entomol. Sin., 1984, V.26, p.419-425.

18. Кузнецова Н.И., Азизбекян P.P., Конюхов И.В., Погосян С.И., Рубин А.Б. Доклады Академии наук, 2007, т.241, №2, с.262-266.

19. Патент РФ 2323968.

20. Shida O., Takagi H., Kadowaki K., Komagata K. 1996. Proposal for new genera, Brevibaciillus gen.nov. and Aneurinibacillus gen. nov. Int. J. Sysyt.Bacteriol., 45: 939-946.

21. Stanier, R.Y., Kunisawa, R., Mandel M., Cohen-Basire, G. Bacteriool. Rev. 1971, T.35 (2), 171-205.

22. Stanier, R.Y., Kunisawa, R., Mandel M., Cohen-Basire, G. Bacteriool. Rev. 1971, T.35 (2), 171-205.

23. Воншак А. Микроводоросли: технология лабораторного культивирования биомассы в установках на открытом воздухе. В кн. Фотосинтез и биопродуктивностъ: методы определения. М., Агропромиздат. 1989. С.310-328.

24. Harris E.H. 1989. The Chlamydomonas Sourcebook: A Comprehensive Guide to Biology and Laboratory Use. Academic Press, San Diego, p.780.

25. Nakagawa, M., Y. Takamura, and 0. Yagi. 1987. Isolation of the slime from a cyano-bacterium, Microcystis aeruginosa K-3A. Agric. Biol. Chem. 51:329-337.

26. Guillard R.R.L., Ryther J.H. // Can. J. Microbiol. 1962. V.8. 923-931.