ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS, ОБЛАДАЮЩИЙ ФУНГИЦИДНЫМ И БАКТЕРИЦИДНЫМ ДЕЙСТВИЕМ, И БИОЛОГИЧЕСКИЙ ПРЕПАРАТ НА ЕГО ОСНОВЕ ДЛЯ ЗАЩИТЫ ЗЕРНОВЫХ РАСТЕНИЙ ОТ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ВЫЗЫВАЕМЫХ ФИТОПАТОГЕННЫМИ ГРИБАМИ

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии, в частности к производству и применению биологических средств борьбы с возбудителями болезней растений грибного и бактериального происхождения. Защита сельскохозяйственных растений - овощных культур, картофеля, зерновых и фруктов - от болезней является серьезной экономической проблемой. Ежегодные потери сельского хозяйства достигают нескольких миллиардов рублей. К числу экономически значимых болезней растений относятся болезни, вызываемые микроскопическими грибами. Зерновые культуры (пшеница, рожь, ячмень, овес) подвержены болезням грибной этиологии, которые не только снижают на 20-30% уровень сельскохозяйственной продукции, но и снижают качество семенного материала (всхожесть, скорость роста). Фитопатогенные грибы продуцируют высокотоксичные и канцерогенные метаболиты, загрязняющие зерно и продукты его переработки. Используемые химические средства борьбы с грибными болезнями («Альто», «Раксил», «Фундазол», «Фоликур») недостаточно действенны (эффективность не более 50-60%), следовательно, требуется разработка новых экологически безопасных и эффективных фунгицидов для их защиты. Химические фунгициды индуцируют резистентность у возбудителей болезней, оказывают ряд побочных эффектов на окружающую среду, вызывают фитотоксический эффект, способны накапливаться в окружающей среде. После их применения имеется т.н. период ожидания, т.е. регламентировано время появления на обработанных участках людей и техники.

Серьезную опасность представляют химические фунгициды, применяемые для обработки готовой сельскохозяйственной продукции, поскольку известно отрицательное влияние химических препаратов на человека и животных. В качестве альтернативных средств защиты растений могут быть использованы биологические препараты, основу которых составляют метаболиты бактериального происхождения, оказывающие антагонистическую активность по отношению к различным возбудителям. В настоящее время описаны фунгициды пептидной природы, продуцируемые бактериями рода Bacillus - итурины, фенгицины, сурфактины [1-6]. Механизм фунгицидного действия пептидов обусловлен либо лизисом клеток, либо подавлением синтеза компонентов клеточных стенок. Ряд штаммов В.cereus продуцируют антибиотик звиттермицин, оказывающий ингибирующий эффект на фитопатогенные грибы [7].

Биологические препараты на основе микроорганизмов, продуцирующих антагонистические факторы, также могут быть использованы для борьбы с фитопатогенными грибами, инфицирующими семенной материал. Известен биологический препарат «Бактофит», созданный на основе штамма Bacillus subtilis ИПМ 215 [8]. Препарат рекомендован для защиты различных растений от болезней. Активное начало препарата «Бактофит», представляющее собой штамм В.subtilis ИПМ 215, рассмотрен в качестве ближайшего аналога заявляемого штамма.

Задача заявляемого изобретения:

- расширить арсенал штаммов бактерий, обладающих антагонистическим действием против ряда возбудителей болезней зерновых растений.

- разработать на его основе препарат для защиты зерновых растений от заболеваний, вызываемых фитопатогенными грибами.

Задача решена путем:

- получения штамма бактерий Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-11475, обладающего фунгицидным и бактерицидным действием и

- разработки биологического препарата для защиты зерновых растений, вызываемых фитопатогенными грибами, полученного путем смешивания активного начала в виде культуральной жидкости фунгицидного штамма бактерий Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-11475 с титром 2-3×10⁹ КОЕ/мл и носителя в виде мелкодисперсных гранул диатомита в соотношении по объему 1:3 с последующим высушиванием.

Заявляемый штамм получен в результате многоступенчатой селекции из природного штамма Bacillus amyloliquefaciens, выделенного из почвы, и депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-11475.

Заявляемый штамм Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-11475 имеет следующие характеристики:

1. Культурально-морфологические признаки.

Грамположительные подвижные палочки, перитрихи, размером 0,5-0,7×2,5-3,0 мкм, цепочек не образуют. Штамм Bac. amyloliquefaciens ВКПМ В-11475 гидролизует желатину и крахмал, утилизирует цитрат, редуцирует нитрат, образует каталазу, разрушает казеин, образует кислоту из глюкозы, манитола и арабинозы, лецитиназу не продуцирует, обладает протеазной и амилазной активностью и не обладает липазной активностью.

В качестве твердых питательных сред использовали агаризованные среды NBY, ДПС, YM.

Состав среды NBY, мас.%:

Nutrient broth "Difco" (питательный бульон) - 0,8;

Yeast extract "Difco" (дрожжевой экстракт) - 0,3;

вода - остальное.

pH 6,8-7,2

Состав среды ДПС, мас.%:

Гидролизные дрожжи - 3,0;

кукурузная мука- 1,5;

вода - остальное.

pH 6,8-7,2

Состав среды YM, мас.%:

гидролизные дрожжи - 4,5;

вода - остальное.

pH 6,8-7,2

Для приготовления агаризованных питательных сред в жидкие среды дополнительно добавляли агар-агар (2,0 мас.%).

При культивировании на агаризованных средах NBY, ДПС и YM через 24-30 часов при температуре 28-30 С штамм образует белые матовые колонии диаметром 3-5 мм. Через 72 часа роста на указанных питательных средах штамм образует споры. Свободные споры имеют эллиптическую форму. Размер спор 0,5-0,6×0,9-1,5 мкм.

На основании морфологических, физиолого-биохимических признаков, а также по результатам анализа нуклеотидной последовательности вариабельных участков 16S рРНК заявляемый штамм ВКПМ В-11475 идентифицирован как Bacillus amyloliquefaciens.

2. Фунгицидные свойства штамма.

Штамм характеризуется широким спектром фунгицидной активности и подавляет развитие следующих фитопатогенных грибов: Alternaria tenius, Aspergillus niger, Fusarium graminearum, Fusarium solani, Fusarium culmorum, Fusarium avenaceum, Fusarium sporotrichioides, Microdochium nivale, Phomopsis helianthi, Phoma solanicola, Phytophtora infestans, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum.

3. Антагонистическая активность штамма.

Штамм Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-11475 синтезирует биологически активные вещества и проявляет антагонистическую активность по отношению к:

- грамположительным бактериям: Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Staphylococcus ssp., Streptococcus ssp.

- грамотрицательным бактериям: Pseudomonas aureofaciens, Pseudomonas corrugata, Pseudomonas marginata, Erwinia cnrysanthemi, Xanthomonas campestris.

Ближайший аналог заявляемого штамма - штамм B. subtilis ИПМ 215 и разработанный на его основе препарат «Бактофит» обладают значительно более узким спектром фунгицидного действия. «Бактофит» рекомендован для обработки клубней картофеля перед закладкой на хранение для защиты только от фузариозного увядания, фитофтороза и ризоктониоза. Заявляемый штамм Bacillus amyloliquefaciens В-11475, кроме возбудителей перечисленных заболеваний, подавляет также развитие фитопатогенных грибов-возбудителей фомоза (Phoma solanicola), альтернариоза (Alternaria tenius) и парши колоса (Fusarium graminearum).

В качестве преимущества заявляемого штамма Bacillus amyloliquefaciens В-11475 по сравнению с ближайшим аналогом-штаммом В. subtilis ИПМ 215 следует отметить его способность продуцировать поверхностно-активные вещества (ПАВ) в процессе культивирования, что является важной характеристикой заявляемого штамма, так как в дальнейшем при создании препаративной формы нет необходимости вводить дополнительные ПАВы. В сельском хозяйстве при защите растений ПАВы широко используют для образования эмульсий и в качестве прилипателей. ПАВы используют для повышения эффективности транспортировки фунгицидных компонентов к растениям, так как они влияют на проницаемость клеточных мембран, кроме того, ПАВы обладают ингибирующим действием на ферментативные системы фитопатогенных грибов.

Поддержание штамма Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-11475 проводят на косяках в стандартных пробирках с агаризованной средой NBY. Хранение штамма осуществляют в лиофилизированном состоянии. Для получения лиофилизированного материала вегетативную культуру клеток выращивают на агаризованной среде NBY до образования спор. Споры и оставшиеся клетки смывают защитной средой, содержащей стерилизованное обезжиренное молоко. Ампулы с суспензией клеток и спор выдерживают 15 мин при -70°C, а затем быстро переносят в камеру для сушки, соединенную с вакуумной системой лиофилизации (модель 75150 фирмы "Labkonko"). Время сушки 4 часа. Лиофилизированные образцы хранят в холодильнике при температуре +4°C.

Приготовление заявляемого препарата

1. Получение активного начала - культуральной жидкости штамма Bacillus amyloliquefaciens В-11475

Штамм Bacillus amyloliquefaciens В-11475 культивируют в осветленной среде YM следующего состава (мас.%): гидролизные дрожжи - 4,5; вода - остальное в течение 72 часов при температуре 30°C с аэрацией на качалке при 260 об/мин. В результате получают культуральную жидкость, являющуюся активным началом заявляемого препарата.

2. Носитель для иммобилизации активного фактора в качестве носителя для иммобилизации активного начала - культуральной жидкости бактерий Bacillus amyloliquefaciens B-11475, выбран мелкодисперсный диатомит, который является натуральной осадочной горной породой, состоящей преимущественно из останков диатомовых водорослей. Природный диатомит - обычно рыхлая или слабо сцементированная, светло-серого с желтоватым или розоватым оттенком порода. Химически диатомит более чем на 80% состоит из водного кремнезема. Легко стерилизуется (выдерживает температуру до 1400°C), представляет собой легкие пористые мельчайшие гранулы с размером частиц по фракциям - от 0.1 до 10.0 мм; эффективный диаметр пор - 50-100 нм, с насыпной плотностью не более 620 кг/м³ [9]. Является инертным материалом, не вступающим во взаимодействие с большинством агрессивных сред. Диатомит - природный материал, обладающий необходимыми потребительскими свойствами для создания биопрепарата: стерилен, химически инертен, легкий, сыпучий, не слеживается, негорючий, биологически стойкий и экологически чистый, не подвержен процессам гниения, воздухо- и водопроницаем, обладает высокими адсорбционными свойствами и может впитывать до 120% воды по массе. Благодаря высокопористой микроструктуре гранулы диатомита сберегают и продлевают действие вносимого биофунгицида не только при обработке зерна, но способны при внесении в почву предотвращать заражение зерновых культур в процессе всего вегетативного роста.

3. Состав и преимущества заявляемого препарата

Препарат состоит из культуральной жидкости штамма Bacillus amyloliquefaciens B-11475, содержащей комплекс спор, вегетативных клеток с титром КОЕ/мл (колоний образующих единиц) от 8×10⁸ до 2-3×10⁹ и продуктов метаболизма, иммобилизованных на высокопористых мелкодисперсных гранулах диатомита.

Преимуществом заявляемого препарата является то, что он хорошо хранится, удобен для транспортировки, дает стабильный объем, не слеживается, а фунгицидные свойства проявляет как при обработке семян зерновых растений, так и в почве в процессе вегетативного роста.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1. Культивирование штамма Bacillus amyloliquefaciens B-11475

Для культивирования штамма B-11475 используют стандартные стеклянные конические плоскодонные колбы Эрленмейера объемом 750 см³, которые заполняют 50 мл жидкой стерильной среды YM или NBY.

Осветленную среду YM готовят на водопроводной воде. Приготовленную среду кипятят 10 мин; остужают до комнатной температуры; декантируют и сливают надосадок, а осадок отбрасывают; доводят значение pH осветленной среды (надосадка) до 7,2. В колбы Эрленмейера объемом 750 мл разливают по 50 мл осветленной среды и стерилизуют в автоклаве под давлением 0,8 атм при температуре 121°C в течение 30 мин. После стерилизации колбы охлаждают до температуры +20°C и контролируют путем отбора проб на стерильность и pH среды.

В 50 мл стерильной осветленной среды YM добавляют 2 мл посевного материала, выращенного в среде NBY на качалке (260 об/мин) при температуре 28°C в течение 14 часов с титром - 1-2×10⁹ КОЕ/мл. Бактериальную культуру для получения биомассы выращивают в тех же условиях, что и посевной материал в течение 72 часов. Каждые сутки (после 24 часов роста) отбирают пробы для микробиологического контроля, который включает проверку состояния культуры и отсутствие посторонней микрофлоры. К 72 часам культивирования титр культуры штамма Bacillus amyloliquefaciens ВКПМВ-П475 составляет 2-3×10⁹ КОЕ/мл.

Пример 2. Оценка фунгицидной активности заявляемого штамма в лабораторных условиях

Штамм Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ B-11475 выращивают, как в примере 1. Для анализа фунгицидной активности используют культуральную жидкость, содержащую 2-3×10⁹ КОЕ/мл. Тестирование фунгицидной активности проводят методом лунок. Для этого штаммы фитопатогенных грибов (табл.1) высевают на чашки Петри с агаризованной картофельно-сахарозной средой. Картофельно-сахарозный агар-агар получают, добавляя к процеженному отвару картофеля сахарозу и агар-агар.

Картофельно-сахарозный агар, мас.%:

В агар-агаре с помощью бура вырезают лунки диаметром 8 мм, в которые вносят по 150 мкл культуральной жидкости заявляемого штамма. Эффективность фунгицидного действия заявляемого штамма определяют по диаметру зоны отсутствия роста тест-культур. Результаты представлены в таблице 1.

Как следует из таблицы 1, заявляемый штамм обладает широким спектром фунгицидной активности, которая локализована в культуральной жидкости.

Пример 3. Оценка бактерицидной активности заявляемого штамма

Оценку бактерицидной активности заявляемого штамма в лабораторных условиях проводят следующим образом. Штамм выращивают как в примере 1. Для анализа бактерицидной активности используют культуральную жидкость, содержащую 2-3×10⁹ КОЕ/мл. Тестирование бактерицидной активности проводят методом лунок. Для этого бактериальные тест-культуры (табл.2) высевают на чашки Петри с агаризованной средой NBY, затем в лунки диаметром 5 мм вносят по 50 мкл культуральной жидкости и инкубируют при 30°C 24-48 часов. Эффективность бактерицидного действия заявляемого штамма определяют по диаметру зоны отсутствия роста тест-культур. Результаты представлены в таблице 2.

Как следует из таблицы 2, заявляемый штамм обладает широким спектром бактерицидной активности, которая локализована в культуральной жидкости.

Пример 4. Определение поверхностно-активных свойств заявляемого штамма

Поверхностно-активные свойства штамма (способность образовывать ПАВ) оценивают по следующим критериям - пенообразующая активность, способность к эмульгированию и поверхностное натяжение. Штамм Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-11475 выращивают на осветленной среде YM на круговой качалке (260 об/мин) при 30°C в течение 120 часов.

Пенообразование определяют после снятия с качалки как отношение объема пены к объему культуральной жидкости, выраженное %.

Для определения эмульгирующей активности (Ез4) надосадок, полученный после отделения биомассы путем центрифугирования культуральной жидкости штамма при 10000 об/мин, смешивают с керосином в отношении 2:3, встряхивают при 300 об/мин на шейкере в течение 3 мин и оставляют при комнатной температуре на 24 часа.

Эмульгирующую активность (индекс эмульгирования) оценивают как отношение образовавшейся эмульсии к объему культуральной жидкости в %.

Поверхностное натяжение измеряют сталагмометрическим методом [10] в объеме 5 мл при 20°C.

Из результатов, представленных в таблице 3, следует, что заявляемый штамм способен продуцировать поверхностно-активные вещества (ПАВ), что позволяет при приготовлении на его основе препарата не добавлять дополнительных прилипателей, необходимых для иммобилизации активного начала на гранулах носителя.

Пример 5.

Оценка фунгицидной активности культуральной жидкости заявляемого штамма при искусственном инфицировании семян пшеницы фитопатогенными грибами Fusarium graminearum и Microdochium nivale

В модельных опытах семена пшеницы, предварительно обеззараженные обработкой 0,1%-ным раствором AgNO₃, замачивают в культуральной жидкости штамма в течение двух часов. Затем семена подсушивают на воздухе в течение 3 часов и заражают споровой суспензией (10⁵-10⁶ спор/мл) фитопатогенных грибов Fusarium graminearum и Microdochium nivale.

После заражения семена раскладывают в стерильные влажные камеры (чашки Петри со слоем ваты и фильтровальной бумаги, увлажненные в соответствии со стандартом стерильной водой). В каждую чашку помещают по 20 семян; повторность - 5-кратная. Чашки с семенами выдерживают при температуре 25-27°C в течение 10 суток. Оценивают всхожесть, начало прорастания и зараженность семян грибами (табл.4).

Как следует из таблицы 4, обработка семян пшеницы культуральной жидкостью заявляемого штамма приводит к увеличению всхожести семян, уменьшению их зараженности фитопатогенными грибами, не влияя на время начала прорастания.

Пример 6.

Определение эффективности заявляемого штамма на спорах различных фитопатогенных грибов.

Стадия спор является одной из фаз (покоящаяся стадия) жизненного цикла микроскопических грибов. Фитопатогенные грибы в стадии покоя представляют серьезную опасность для растений, поскольку при их прорастании растениям наносится серьезный ущерб. Для оценки действия штамма Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-11475 споры фитопатогенных грибов обрабатывают фильтратом культуральной жидкости и анализируют эффект через 24 часа инкубации. Штамм ВКПМ В-11475 действует на покоящиеся формы грибов во всех случаях, но различным образом, при этом не происходит образование ростовых трубок грибов и мицелий не формируется (табл.5).

Пример 7. Приготовление заявляемого препарата

Для приготовления препарата культуральную жидкость штамма ВКПМ В-11475, выращенного, как в примере 1, смешивают с мелкодисперсными гранулами диатомита в соотношении по объему от 1:3 и высушивают при 50°C в течение 15-20 часов. Полученный порошкообразный препарат хранят при комнатной температуре в таре, с плотно закрытой пробкой для предотвращения увлажнения. Фунгицидные свойства препарата оценивают непосредственно после высушивания.

Пример 8.

Оценка биологической активности заявляемого препарата в лабораторных условиях.

Фунгицидную активность заявляемого препарата определяют методом лунок на чашках, засеянных фитопатогенными грибами Fusarium solani, Fusarium graminearum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium avenaceum Fusarium culmorum. Сухой порошок препарата разводят следующим образом: 100 мг сухого порошка разводят в 9 мл стерильной дистиллированной воды (разведение в 10 раз). Раствор порошка оставляют на столе при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем методом последовательных разведений готовят рабочие растворы с кратностью 10:1/100 и 1/1000, как в примере 2. В качестве положительного контроля используют такие же разведения исходной культуральной жидкости, а в качестве отрицательного контроля - стерильную дистиллированную воду.

Фунгицидная активность разведений сухого порошка заявляемого препарата соответствует фунгицидной активности соответствующих разведении исходной культуральной жидкости (табл.6).

Пример 9.

Оценка биологической активности заявляемого препарата в полевых условиях.

Оценку биологической активности заявляемого препарата в полевых условиях проводят путем опрыскивания зараженной фитопатогенными грибами озимой пшеницы сорта "Безостая-1" на фазе цветения 1% водной суспензией заявляемого препарата. В качестве контролей используют зерна не обработанной пшеницы и зерна пшеницы, обработанной химическим фунгицидом «Фоликур» («Байер», Германия). Биологическую активность заявляемого препарата оценивают по урожайности и зараженности патогенными грибами собранного урожая озимой пшеницы.

Как следует из Таблицы 7, обработка зерна пшеницы заявляемым препаратом в полевых условиях приводит к повышению урожайности и уменьшению процента зараженности полученного урожая фитопатогенными грибами, а по фунгицидной активности заявляемый препарат не только не уступает эталонному химическому фунгициду "Фоликур", но и превосходит его на 4%.

Список литературы

1. Akra E., Jacques P., Wathelet B., Paquot M., Fuchs R., Budzikiewicz H., Thonart P. 2001.

2. Influence of culture conditions on lipopeptide production by Bacillus subtilis. Appl. Biochem. Bioctechnol. 91-93: 551-561.

3. Klich M.A., Lax A.R., Bland J.M. 1991. Inhibition of some mycotoxigenic fungi by iturin A, a peptidolipid produced by Bacillus subtilis. Mycopathology. 116:77-80.

4. Ahimou F., Jacques P., Dejeu M. 2000. Surfactin and iturin A effect on Bacillus subtilis surface hydrophobility. Enzyme Microb. Technol. 27:749-754.

5. Volpon L., Besson F., Lancelin J. 2000. NMR structure plipastatins A and В from Bacillus subtilis inhibitors ofphospholipase A2. FEMS Lett. 485: 76-80.

6. Volpon L., Besson F., Lancelin J. 1999. NMR structure of active and forms of the sterol-dependet antifungal antibiotic bacillomycin L. Eur. J. Biocem. 263:1-12.

7. Milner J.L., Raffel S.J., Lethbridge B.J., Handelsman J. 1995. Culture condition that influence accumulation ofzwittermicin A by Bacillus cereus UW85. Appl. Microbiol. Biotechnol. 43: 685-691.

8. Патент RU 2019966.

9. ТУ 9692-0003-59266087-05 "Материалы сорбционные и фильтрующие".

10. Остроумов С.А., Лазарева E.В. Поверхностное натяжение водных растворов додецилсульфата натрия в присутствии водных растений. - Вода: технология и экология. 2008, №3,с.57-60.