СПОСОБ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО СИНТЕЗА Н-БУТАНОЛА

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам получения н-бутанола путем ферментации углеводсодержащего сырья бактериями рода Clostridium.

Н-бутанол (бутанол) - четырехуглеродный спирт, широко применяют при производстве красок, нитроэмалей, пластификаторов, бутилацетата. фенолформальдегидных смол и присадок к смазочным маслам, используют в качестве растворителя, экстрагента для жиров. Благодаря высокому содержанию энергии, низкой летучести, хорошей смешиваемости, высокому октановому числу, бутанол рассматривают как перспективное топливо для двигателей внутреннего сгорания.

В промышленности бутанол получают химическим синтезом из пропилена или ацетальдегида, а также путем ферментации углеводсодержащего сырья бактериями рода Clostridium.

В микробиологическом производстве смесь растворителей ацетона, бутанола и этанола по типовой технологии получают из смеси обдирной муки (20-60%) и мелассы. Ацетонобутанольное брожение осуществляют полунепрерывным способом в батарее последовательно соединенных биореакторов с использованием в качестве продуцента бутанола бактерии Clostridium acetobutylicum. При этом смесь растворителей содержит бутанола 55-60% (1, 2).

Известен способ получения смеси бутанола и ацетона на основе штамма Clostridium acetobutylicum ВКПМ В 5359 путем ферментации его на среде, содержащей свеклосахарную мелассу с минеральным солями. В этом случае содержание бутанола в составе конечной смеси растворителей составляет 70% [3].

Способ получения органического топлива с использованием комбинации культур Clostridium cellobioparum и Clostridium acetobutylicum, для конверсии целлюлозо- и пентозансодержащего сырья, позволяет получить конечный продукт с содержанием бутанола 14% [4].

В качестве ближайшего аналога заявляемого способа рассмотрим способ микробиологического синтеза н-бутанола путем непрерывной двухстадийной ферментации с использованием культур Clostridium acetobutylicum и Clostridium tyrobutiricum (5, 6).

Для ацетонобутанольного брожения в способе-аналоге используют ряд субстратов (6). Один из них состоит из следующих компонентов в мас.%: MgCl₂·6H₂O - 0,1; (NH₄)₂SO₄ - 0,15; KH₂PO₄ - 0,05; MnSO₄·7H₂ - 0,001; FeSO₄·7H₂O - 0,001; CaCl₂·2H₂O - 0,015; дрожжевой экстракт - 0,5; комплекс витаминов - 1; глюкоза - 2-5, вода - остальное. Другой субстрат Reinforced Clostridial Medium, его состав (мас.%): NaCl - 0,5; CHsCOONa - 0,3; растворимый крахмал - 0,1; пептон - 1,0; цистеин гидрохлорид - 0,05; дрожжевой экстракт - 0,3; вода остальное. В субстрат добавляют декстрозу 5,0-6,7 мас.% и масляную кислоту - 0,3-0,4 мас.%.

На первой стадии в первом биореакторе процесс ведут с использованием маслянокислых бактерий Clostridium tyrobutiricum (5). При этом расходуют основную часть питательного субстрата. После отделения биомассы получают культуральную жидкость, содержащую масляную кислоту. На второй стадии во втором биореакторе осуществляют процесс синтеза бутанола с использованием иммобилизованной культуры Clostridium acetobutylicum и питательного субстрата, включающего культуральную жидкость с первой ступени. Способ позволяет обеспечить продуктивность по бутанолу 8,0 г/лч. Сведений об относительном содержании бутанола в конечной смеси растворителей авторы не приводят.

Этот способ хотя и обеспечивает высокий выход бутанола. требует наличия оборудования для проведения маслянокислого брожения и отделения биомассы маслянокислых бактерий, а также осложнен необходимостью использования иммобилизованных культур, что делает его непригодным для использования в крупномасштабном производстве. В патенте не приводят экспериментальный материал, дают только теоретические расчеты.

В качестве ближайшего аналога заявляемого способа по составу субстрата является синтетический питательный субстрат MSS (7,8) в мас.%: К₂НРO₄ - 0,08; KH₂PO₄ - 0,1; MgSO₄·7H₂O - 0,1; FeSO₄·7H₂O - 0,005; дрожжевой экстракт - 0,5; CH₃COONH₄ - 0,3; витамины, глюкоза - 2-6, вода - остальное (Р - 0.038 мас.%; Mg⁺² - 0.0098 мас.%; Fe⁺² - 0,001 мас.%; минеральный азот - 0,055 мас.%).

Задача заявляемого изобретения состоит в том, чтобы повысить уровень относительного содержания н-бутанола в составе смеси растворителей и общий выход растворителей при проведении процесса в батарее последовательно соединенных биореакторов.

Задача решена путем разработки способа микробиологического синтеза бутанола в процессе культивирования двух видов бактерий рода Clostridium с использованием питательного субстрата, содержащего источники углерода, азота, фосфора, а также макро- и микроэлементы и витамины путем одновременного совместного засева бактерий Clostridium acetobutylicum и маслянокислых бактерий рода Clostridium в соотношении от 1:1 до 1:11 и подачи питательного субстрата, содержащего (мас.%):

источники углерода в виде моно - и/или олигосахаридов - 4,4-6,0;

азот (общий) - 0,055-0,2;

фосфор - 0,038-0,064;

магний (Mg⁺²)- 0,0098-0,144;

железо (Fe⁺²) - 0,0008-0,0010.

Способ обеспечивает долю бутанола в составе смеси получаемых растворителей 62%-75% в зависимости от используемого вида сырья.

В заявляемом способе используют симбиотический консорциум двух бактерий рода Clostridium. Продуцентами масляной кислоты являются маслянокислые бактерии рода Clostridium (такие как Clostridium tyrobutyricum, Clostridium butyricum или др.), продукт метаболизма которых - масляная кислота служит субстратом для синтеза бутанола бактериями Clostridium acetobutylicum.

Вещества, образующиеся в процессе ацетонобутанольного брожения, не толерантны по отношению к микроорганизмам. Особенно токсична масляная кислота. Бактерии вида Clostridium acetobutylicum устойчивы к концентрации бутанола 1.2-1,5%, устойчивость их к концентрации масляной кислоты значительно ниже 0,2-0,4%. Бактерии маслянокислого брожения более устойчивы к присутствию масляной кислоты (0,8-1,0%) и менее устойчивы к присутствию бутанола (9). Совместное использование культур сопровождается двумя одновременными процессами: синтезом масляной кислоты и ее утилизацией в бутанол. Концентрация масляной кислоты в процессе осуществления заявляемого способа не превышает пределов допустимых концентраций, ингибирующих процесс синтеза бутанола культурой Clostridium acetobutylicum.

Совместное использование двух видов бактерий рода Clostridium возможно благодаря совпадению оптимальных параметров процесса ацетогенеза (процесса образования кислот) маслянокислого и ацетонобутанольного брожений: t=35-37°C, рН 5,2-6,5. Технологические параметры процесса сольвентогенеза (процесса образования растворителей) у данных культур также одинаковые. При снижении рН ниже 5,2 как Clostridium acetobutylicum, так и маслянокислые бактерии из масляной кислоты продуцируют бутанол.

Совместное использование двух видов бактерий рода Clostridium имеет преимущества, так как выход масляной кислоты при ацидогенезе выше у маслянокислых бактерий, а в процессе сольвентогенеза выход бутанола выше у Clostridium acetobutylicum. Совместное использование культур возможно, так как скорость брожения углеводов у Clostridium acetobutylicum выше, чем у маслянокислых бактерий.

Заявляемый способ пригоден для реализации как в батарее биореакторов полунепрерывным способом, так и в непрерывном процессе.

Способ в общем виде

Способ осуществляют следующим образом. Подготавливают посевной материал культур Clostridium tyrobutyricum и Clostridium acetobutylicum или Clostridium butyricum и Clostridium acetobutylicum.

Биомассу маслянокислых бактерий выращивают в течение 4-8 суток при температуре 36-37°С, используют питательный субстрат SOL следующего состава в мас.%: К₂НРO₄ - 0,07; КН₂РO₄ - 0,07; NaCl - 0,001; MgSO₄·7H₂O - 0,01; MnSO₄·H₂O - 0,002; FeSO₄·7H₂O - 0,0015; дрожжевой экстракт - 0,1; СН₃СООNН₄ - 0,3; цистеин - 0,05; комплекс витаминов - 1; глюкоза - 2, вода - остальное. Посевной материал засевают в промышленный биореактор в питательный субстрат в количестве 4-16 об.% по отношению к объему субстрата. В качестве источника углерода используют не только глюкозу, но и моно- и/или олигосахариды ферментативных гидролизатов целлюлозо-, пентозансодержащего растительного сырья. Для интенсификации маслянокислого брожения в питательный субстрат вводят мелассу, в качестве источника витаминов. Добавка ее в питательный субстрат составляет 1% по сахарозе.

Культуру Clostridium acetobutylicum адаптируют к культуральной жидкости, полученной после отделения маслянокислых бактерий, а затем выращивают при температуре 36-37°С на крахмалсодержащей среде (отруби или обдирная мука или картофель) с содержанием абсолютно сухих веществ (а.с.в.) 6-8 мас.% или на субстрате, который используют в промышленных биореакторах (см.ниже). Культуру засевают в питательный субстрат в количестве 1,4-5 об.% по отношению к объему субстрата.

При приготовлении посевного материала используют следующий технологический режим: t=35-37°C, pH 5,0-6,5. рН среды регулируют предпочтительно 25% раствором аммиачной воды.

В процессе ацетонобутанольного брожения применяют синтетический питательный субстрат MSS следующего состава в мас.%: К₂НРO₄ - 0,08; КН₂РO₄ - 0,1; MgSO₄·7H₂O - 0,1; FeSO₄·7H₂O - 0,005; дрожжевой экстракт - 0,5; CH₃COONH₄ - 0,3, витамины - 1, глюкозы -5-6, вода - остальное, что соответствует Р - 0,038 мас.%; Mg⁺² - 0,0098 мас.%; Fe⁺² - 0,001 мас.%; минеральный азот - 0,055 мас.%. Для устойчивости проведения процесса сольвентогенеза в питательный субстрат добавляют мальтозу в количестве 0,5-1 мас.%. Перед процессом ацетонобутанольного брожения субстрат продувают азотом.

При использовании синтетических прозрачных субстратов в них дополнительно вводят в качестве твердой фазы отруби в количестве 0,4-0,6 мас.%.

При проведении процесса ацетонобутанольного брожения в батарее промышленных биореакторов в составе питательного субстрата, в качестве источника углерода используют моно- и/или олигосахариды, в частности ферментативные гидролизаты целлюлозо-, пентозан-, крахмал-, сахарсодержащего растительного сырья, их смеси.

Содержание углеводов в питательном субстрате составляет 4,4-6,0 мас.%. При использовании крахмалсодержащего сырья дополнительных добавок минеральных солей и витаминов не требуется. В случае использования целлюлозо-, пентозансодержащего сырья требуется обогащение субстрата минеральными солями и витаминами в вышеуказанных количествах. По этой причине оптимальным субстратом для процесса ацетонобутанольного брожения является смешанный субстрат, полученный на основе целлюлозо-, пентозан-, крахмал- и сахарсодержащего сырья.

Процесс в батарее биореакторов осуществляют в соответствии с типовой технологией (1, 2).

Посевной материал культур совместно задают в питательный субстрат в ацидогенезный биореактор.

В ацидогенезном биореакторе поддерживают следующий технологический режим: t=35-37°C, рН 5,2-6,5. рН среды регулируют 25% раствором аммиачной воды.

Суспензию передают в сольвентогенезный биореактор. Сольвентогенезных биореакторов должно быть не менее 3. Два основных бродильных аппарата и третий дображиватель. Сольвентогенез ведут при t=35-37°C и рН 4,5-5,2. рН среды регулируют 25% раствором аммиачной воды.

Заявляемый способ подтвержден следующими примерами.

Пример 1

Подготавливают посевной материал штаммов Clostridium tyrobutyricum ВКПМ-9615 (АТСС 25755) и Clostridium acetobutylicum ВКПМ В-4786.

Для выращивания биомассы Clostridium tyrobutyricum используют питательный субстрат SOL. В субстрат добавляют мелассу в количестве 1% по сахарозе. Питательный субстрат стерилизуют при t=125°C в течение 1 час.

Суспензию биомассы культуры Clostridium tyrobutyricum после 120-240 ч брожения задают в биореактор с рабочим объемом 70 см³ в питательный субстрат в количестве 16 об.% по отношению к объему субстрата.

Культуру Clostridium acetobutylicum ВКПМ В-4786, адаптированную к культуральной жидкости маслянокислой бактерии, выращивают на крахмалсодержащей среде (ржаная мука, сумма полисахаридов 65%) с содержанием а.с.в. 6-8%. Питательный субстрат стерилизуют при t=130°С в течение 1 ч.

Суспензию с биомассой бактерии задают в биореактор в питательный субстрат в количестве 1,4 об.% по отношению к объему субстрата. Соотношение количеств посевных культур составляет 11:1.

При приготовлении посевного материала поддерживают следующий технологический режим: t=35-37°C, рН 5,0-6,5. рН среды регулируют 25% раствором аммиачной воды.

С целью проведения процесса ацетонобутанольного брожения используют синтетический субстрат MSS с содержанием глюкозы 6 мас.%. и добавкой 0,5 мас.% отрубей. Субстрат продувают азотом.

Результаты ацетонобутанольного брожения представлены в таблице.

Содержание бутанола в составе растворителей составляет 74,6%. Выход бутанола от потребленного условного крахмала - 25,5% и суммы растворителей - 34,1%.

Пример 2

В примере используют штаммы Clostridium butyricum ВКПМ В-9619 (АТСС 859) и Clostridium acetobutylicum ВКПМ В-4786 в соотношении 1:1.

Технологическая схема и субстраты для приготовления посевного материала культур аналогичны технологической схеме и субстратам, описанным в примере 1.

С целью проведения процесса ацетонобутанольного брожения применяют питательный субстрат с содержанием глюкозы 5 мас.% и добавкой фугата ферментативного гидролизата отрубей в количестве 0,75 мас.% по РВИ (редуцирующие вещества после инверсии), 0,5 мас.% отрубей, минеральные соли в соответствии со средой MSS. Субстрат продувают азотом.

Результаты представлены в таблице, из которой видно, что содержание бутанола в составе растворителей составляет 66,7%. Выход бутанола от сброженного условного крахмала - 24,2% и суммы растворителей - 36,3%.

Пример 3

В примере используют штаммы Clostridium butyricum ВКПМ В-9619 и Clostridium acetobutylicum №6 (коллекция Московского государственного университета им. Ломоносова) в соотношении 1:1.

Технологическая схема и субстраты аналогичны технологической схеме и субстратам, описанным в примере 1.

Из результатов ацетонобутанольного брожения, представленных в таблице, следует, что содержание бутанола в составе растворителей равно 63,2%. Выход бутанола от сброженного условного крахмала - 22,8% и суммы растворителей - 36,1%.

Пример 4.

В примере используют штаммы Clostridium tyrobutyricum ВКПМ В-9615 и Clostridium acetobutylicum №6 в соотношении 1,7:1.

Технологическая схема и субстраты для подготовки посевного материала культур аналогичны технологической схеме и субстратам, описанным в примере 1.

С целью проведения процесса ацетонобутанольного брожения используют синтетический субстрат MSS с содержанием глюкозы 5 мас.% и добавкой мальтозы 1 мас.%, 0,5 мас.% отрубей. Субстрат продувают азотом.

Результаты представлены в таблице.

Содержание бутанола в составе растворителей составляет 73,9%. Выход бутанола от сброженного условного крахмала - 29,9% и суммы растворителей - 40,5%.

Пример 5

В примере используют штаммы Clostridium tyrobutyricum ВКПМ В-9615 и Clostridium acetobutylicum ВКПМ В-4786 в соотношении 3,5:1.

Технологическая схема и используемые субстраты для получения посевного материала аналогичны технологической схеме и субстратам, описанным в примере 1.

С целью проведения процесса ацетонобутанольного брожения в биореакторе с рабочим объемом 50 см используют ферментативный гидролизат (ФГ) отрубей с добавкой мелассы. Концентрация отрубей (влажность 5%) в субстрате составляет 6 мас.% (6-0,54-0,95=3,08 мас.% РВИ). Мелассу добавляют в количестве 1,35 мас.% РВИ. Состав минеральных веществ субстрата (мас.%): Р - 0,064: Mg⁺² - 0,024: Fe⁺² - 0,0008: азот общий - 0,2.

Результаты представлены в таблице.

Содержание бутанола в составе растворителей составляет 62,3%. Выход бутанола от сброженного условного крахмала - 30% и суммы растворителей - 48,6%.

Использование в качестве углеводного источника ферментативного гидролизата отрубей снижает долю бутанола в составе растворителей. Введение крахмалсодержащего сырья в субстрат даже в небольшом количестве (пример 2) снижает количество бутанола в составе растворителей за счет увеличения концентрации ацетона.

Снижение концентрации углеводов в субстрате до 3,8 мас.% условного крахмала обеспечивают повышение выхода бутанола и растворителей до максимальных значений.

Наибольшее содержание бутанола в составе растворителей (73-75%) достигают при культивировании Clostridium acetobutylicum совместно с Clostridium tyrobutyricum на субстратах, содержащих в качестве углеродных источников питания глюкозу и мальтозу.

Таким образом, способ на основе двух видов бактерий рода Clostridium, когда продукты метаболизма одной культуры являются источником питания другой, позволяет:

- обеспечить высокий уровень относительного содержания н-бутанола в составе смеси растворителей;

- повысить общий выход растворителей, не меняя аппаратурного оформления процесса.

Источники информации

1. Логоткин И.С. Технология ацетонобутилового производства. Пищепромиздат. 1958.

2. Промышленный регламент на производство растворителей: ацетона, бутанола и этанола брожения. ПР 64-35-89, г.Ефремов, 1989.

3. Патент РФ 95103597.

4. Патент US 4326032.

5. Патент US 5753474.

6. David Ramey. Production of butyric Acid and Butanol from Biomassa// Final Report. - 2004.

7. Яроцкий С.В., Сушкова В.И., Березина О.В. Эффективность ацетонобутанольного брожения штаммами Clostridium acetobutylicum ВКПМ Y-4786 и №6// Сб. научных материалов ВятГУ. - Киров, 2009.

8. Березина О.В., Синеокий С.П., Великодворская Г.А. и др. Внеклеточная гликозилгидролазная активность клостридий, образующих ацетон, бутанол и этанол// Прикладная биохимия и микробиология. - 2008. - Т.44. - №1.

9. Яроцкий С.В., Сушкова В.И., Жуковский С.В. Эффективность продуцирования масляной кислоты штаммами Clostridium butyricum ВКПМ В-9619 (АТСС 859) и Clostridium tyrobutyricum ВКПМ В-9615 (АТСС 25755)// Сб. научных материалов ВятГУ. - Киров, 2009.