×
09.05.2019
219.017.5026

СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ КИШЕЧНЫХ ВИРУСОВ В ВОДЕ

Вид РИД

Изобретение

Юридическая информация Свернуть Развернуть
Краткое описание РИД Свернуть Развернуть
Аннотация: Изобретение относится к области медицины, а именно к вирусологии, и может быть использовано для выявления кишечных вирусов из воды. Для этого концентрирование кишечных вирусов осуществляют путем внесения в исследуемый образец воды сорбента на основе магнитных микрочастиц, покрытых полимером диоксида кремния с аминопропильными группами, в соотношении 1:1000-3000 от объема образца воды. Инкубируют при постоянном перемешивании в течение 1-2 часов. Собирают сорбент с использованием магнита, удаляют супернатант и получают комплекс сорбента с кишечными вирусами. При этом элюцию кишечных вирусов осуществляют раствором 0,5М NaCl и 0,05М Трис (рН-10,5). Идентификацию кишечных вирусов проводят иммунохимическими, культуральными или молекулярными методами. Изобретение обеспечивает высокую степень концентрирования вирусов в элюате, уменьшение объема элюирующего раствора. 2 пр.
Реферат Свернуть Развернуть

Изобретение относится к области медицины, эпидемиологического надзора и вирусологии, и может быть использовано для выявления кишечных вирусов в водопроводной воде, в воде открытых водоемов, пресной и морской, в воде из подземных источников, в питьевой бутилированной воде, в воде плавательных бассейнов и в сточной воде.

Уровень техники.

В настоящее время для выявления кишечных вирусов в воде в Российской Федерации известны различные способы, каждый из которых применяется для определенного типа или объема воды. Это способ с использованием фильтрующих мембран, с использованием ионообменных смол, двухэтапный способ (сорбция на ионообменной смоле и осаждение с помощью сульфата аммония), способ двухфазного разделения, способ с помощью флизелиновых пакетов с макропористьм стеклом и с использованием набора для сбора и концентрирования вирусов из питьевой воды с помощью ловушечного устройства [Методические указания №4.2.2029-05 «Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Санитарно-вирусологический контроль водных объектов»].

Известны также способы, предложенные зарубежными авторами. Это концентрирование вирусов на мембранах с лигандами [патент США US 20080014625], на отрицательно заряженных мембранах [Katayama H., Shimasaki A., Ohgaki S. Development of a virus concentration method and its application to detection of enterovirus and Norwalk virus from coastal seawater. Appl. Environ. Microbiol., 2002, 68: 1033-1039].

Наиболее близким к заявленному способу является способ выявления кишечных вирусов, включающий концентрирование вирусов с помощью флизелиновых пакетов с макропористым стеклом [Конторович В.Б., Иванова О.Е., Еремеева Т.П., Ширман Г.А., Казанцева В.А. Метод концентрирования вирусов в водных объектах окружающей среды. Вопр. вирусол., 1996, 1: 40-42]. В указанном способе время концентрирования вирусов из воды поверхностных водоемов и сточной воды составляет 3-7 суток. Для повышения сорбционных свойств макропористого стекла, представляющего собой белый порошок, его обрабатывают следующим образом: один объем стекла заливают в колбе одним объемом смеси (1:1) 3% раствора H2O2 и 6М раствора соляной кислоты и кипятят в вытяжном шкафу в течение 1 ч без пробки, соблюдая меры предосторожности. Отмывают большим количеством дистиллированной воды до нейтрального значения рН и высушивают при 100°С. В пакет из флизелина размером 5×7 см помещают 3,0 см3 подготовленного сорбента. Пакет с сорбентом закрепляют с помощью лески за неподвижный предмет так, чтобы он оказался в токе воды. После экспозиции в течение 3-7 суток пакет вынимают, помещают в отдельный новый полиэтиленовый мешочек или стерильный флакон и доставляют в лабораторию в сумке-холодильнике в максимально короткий срок (не более 6 ч). Каждую пробу маркируют с указанием точки отбора, датой установки и времени экспозиции пакета. До обработки пробы можно хранить не более суток при 4°С. Пакет с сорбентом извлекают из транспортировочной емкости и помещают в стерильную чашку Петри. Обрезают край пакета, вымывают стекло дистиллированной водой (5 мл) с помощью пипетки в эту же чашку Петри и переносят пипеткой или через воронку в колонку объемом 5-10 мл. Вирусы элюируют ступенчато тремя растворами по 3 мл каждый, собирая фракции в отдельные пенициллиновые флаконы. Исследованию подвергают каждую фракцию в отдельности (всего 3 фракции). В качестве элюирующих растворов используют: 1) 0,05 М трис-HCl рН 9,1; 2) 0,05 М трис-HCl рН 9,1 и 0,5 М NaCl; 3) 3% мясной экстракт на 0,05 М трис-HCl рН 9,1. Для выявления вирусов в элюате выбирают культуральные, иммунохимические или молекулярные методы.

Недостатками вышеописанного способа являются его длительность, большое количество и объем фракций элюата, маленькая площадь контакта сорбента с объемом воды.

Задача настоящего изобретения, на решение которой направлен технический результат, заключается в сокращении продолжительности заявленного способа и в его упрощении. Кроме того, обеспечивается высокая степень концентрирования вирусов, уменьшается объем элюирующего раствора и, как следствие, повышается выход вируса в элюате за счет использования в качестве сорбента магнитных микрочастиц, покрытых полимером диоксида кремния с аминопропильными группами.

Для достижения указанного технического результата в способе выявления кишечных вирусов, включающем концентрирование вирусов из образцов воды на сорбенте, элюцию кишечных вирусов с сорбента с их последующим выявлением иммунохимическими, культуральными или молекулярными методами, отличающегося тем, что концентрирование кишечных вирусов осуществляют путем внесения в исследуемый образец воды сорбента на основе магнитных микрочастиц, покрытых полимером диоксида кремния с аминопропильными группами, в соотношении 1:1000-3000 от объема образца воды, инкубации при постоянном перемешивании в течение 1-2 часов, сбора сорбента с использованием магнита, удаления супернатанта и получения комплекса сорбента с кишечными вирусами, причем элюцию кишечных вирусов осуществляют раствором 0,5M NaCl и 0,05М Трис (рН=10,5).

Признаками, отличающими настоящее изобретение от аналогов, являются:

- время инкубации сорбента MagSi+ с образцом - 1-2 часа;

- сорбент MagSi+ представлен суспензией, что увеличивает вероятность адсорбции вирусов за счет равномерного распределения сорбента по всему объему воды;

- магнитные свойства MagSi+ позволяют собирать сорбент с помощью магнита во флаконах или проточных системах;

- положительный заряд MagSi+ в воде позволяет адсорбировать вирусы не только за счет гидрофобных взаимодействий, но и за счет ионных;

- элюция вирусов с сорбента проводится небольшим объемом элюирующего раствора, что увеличивает концентрацию вирусов в элюате;

- состав и значение рН элюирующего раствора.

Раскрытие изобретения.

Способ выявления кишечных вирусов в воде заключается в их концентрировании из воды на магнитных микрочастицах, покрытых полимером диоксида кремния с аминопропильными группами, снятии вирионов с сорбента с использованием специального буфера для элюции и последующим выявлением кишечных вирусов в элюате с использованием молекулярных, иммунохимических или культуральных методов.

Сорбент MagSi+ получали согласно методике, описанной в патенте США US 20030148101 А1 с некоторыми изменениями. Покрытие магнетита проводилось в два этапа, где первый этап был идентичен описанному в патенте (полимеризация тетраэтоксисилана на поверхности частиц магнетита при значении рН 4,6 и температуре 90°С), а на втором этапе раствор тетраэтоксисилана был заменен 3-аминопропилтриметоксисиланом в той же концентрации. В результате реакции на поверхности магнетита образуются слои полимера диоксида кремния с аминопропильными группами, которые при рН ниже 7,0 имеют положительный заряд. Сорбент представляет собой частицы темно-бурого цвета размером 2-10 мкм, не склонные к образованию агрегатов, что обусловливается одноименным положительным зарядом частиц. Емкость сорбента MagSi+, оцененная по модельному белку БСА (бычий сывороточный альбумин), составляет 15-20 мг белка на 1 см3 сорбента. В модельных экспериментах по концентрированию вирусов из 1 л водопроводной воды эффективность концентрирования аденовирусов составила 76%, энтеровирусов - 81% и вируса гепатита А - 88%.

Принцип адсорбции вирусов на сорбенте MagSi+ основан на двух типах взаимодействий: (1) гидрофобные взаимодействия капсидных белков вирусов с полисилоксановыми связями полимера диоксида кремния; (2) электростатические взаимодействия аминогрупп сорбента, которые в водных условиях (при рН ниже 7,0) имеют положительный заряд, с вирионами, отрицательно заряженными при значениях рН выше 5,0. Кроме того, одноименный положительный заряд частиц MagSi+ обеспечивает распределение сорбента по всему объему воды, увеличивая тем самым вероятность контакта вирионов с частицами сорбента и ускоряя процесс сорбции. Таким образом, для обеспечения эффективного концентрирования вирусов за счет электростатических взаимодействий необходимо, чтобы значения рН воды находились в диапазоне 5,0-7,0. Данный диапазон рН соответствует средним значениям рН воды.

Способ включает в себя следующие этапы.

1. Внесение сорбента в пробу воды. Суспензия сорбента MagSi+ в объеме 1 мл (1:1 по объему сорбент MagSi+ и 50 мМ раствор NaCl) добавляется к 1 л исследуемой воды.

2. Инкубация при постоянном перемешивании в течение 1-2 часов при комнатной температуре. Перемешивание осуществляется с помощью шейкера или верхнеприводной мешалки, при этом весь сорбент должен находиться во взвешенном состоянии.

3. Сбор сорбента MagSi+ с использованием магнита во флаконах, либо на специальных установках для проточного концентрирования магнитных микрочастиц. Удаление супернатанта, получение комплекса вирус + сорбент.

4. Элюция вирусов осуществляется раствором следующего состава - 0,5М NaCl, 0,05М Трис, рН=10,5, из расчета на 1 мл взвеси сорбента MagSi+ добавляется 1 мл элюирующего раствора.

5. Индикация и идентификация вирусов с использованием иммунохимических, культуральных или молекулярных методов. Для выявления ротавирусов А и вируса гепатита А применяется выявление вирусных антигенов методом иммуноферментного анализа. Культуральные методы, в частности реакцию нейтрализации, используют для выявления и типирования энтеровирусов (ECHO, Коксаки А и В, Полиовирусы и Энтеровирусы 68-71) и аденовирусов. Молекулярные методы, такие как обратная транскрипция с последующей ПЦР или ПЦР в режиме «реального времени», можно использовать для выявления всех известных кишечных вирусов [Svraka S et al. 2009, G. Shay Fout et al. 2003; Методические указания №4.2.2029-05].

Осуществление изобретения.

Пример 1.

Осуществляют концентрирование кишечных вирусов из проб сточной воды. К 1 л предварительно осветленной сточной воды добавляют 1 мл суспензии сорбента MagSi+. Инкубируют при постоянном перемешивании на шейкере или с использованием верхнеприводной мешалки в течение 1 ч. После экспозиции собирают сорбент с помощью редкоземельного магнита, переносят суспензию в 15-мл стерильную полипропиленовую пробирку. Удаляют супернатант, удерживая магнитом сорбент с адсорбированными вирусами на внутренней стенке пробирки, и проводят элюцию вирусов 1 мл раствора следующего состава - 0,5М NaCl, 0,05M Трис, рН=10,5. Интенсивно встряхивают пробирку на вортексе в течение 15 минут, при этом весь сорбент должен находиться во взвешенном состоянии. Осаждают сорбент центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 минут или с помощью магнита. Супернатант переносят в две 1,5-2,0-мл полипропиленовые пробирки с завинчивающейся крышкой. Индикацию и идентификацию вирусов или их структурных элементов (вирусных белков или нуклеиновых кислот) проводят с использованием иммунохимических, культуральных или молекулярных методов (различные модификации ПЦР).

Пример 2.

Осуществляют концентрирование кишечных вирусов из водопроводной (питьевой) воды. К 10 л водопроводной (питьевой) воды добавляют 3 мл суспензии сорбента MagSi+. Инкубируют при постоянном перемешивании на шейкере или с использованием верхнеприводной мешалки 2 ч. После экспозиции в воду добавляют 100 мл раствора 5М NaCl и инкубируют при перемешивании еще 30 минут. Собирают сорбент с помощью редкоземельного магнита, переносят суспензию в 15-мл стерильную полипропиленовую пробирку. Удерживая сорбент магнитом, удаляют супернатант и проводят элюцию кишечных вирусов в 3 мл раствора следующего состава - 0,5М NaCl, 0,05М Трис, рН=10,5. Интенсивно встряхивают пробирку на вортексе в течение 15 минут, при этом весь сорбент должен находиться во взвешенном состоянии. Осаждают сорбент центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 минут или с помощью магнита. Супернатант по 1,5 мл переносят в две 1,5-2,0-мл полипропиленовые пробирки с завинчивающимися крышками. Индикацию и идентификацию кишечных вирусов или их структурных элементов (вирусных белков или нуклеиновых кислот) проводят с использованием иммунохимических, культуральных или молекулярных методов (различные модифиации ПЦР).

Способ выявления кишечных вирусов, включающий концентрирование вирусов из образцов воды на сорбенте, элюцию кишечных вирусов с сорбента с их последующим выявлением иммунохимическими, культуральными или молекулярными методами, отличающийся тем, что концентрирование кишечных вирусов осуществляют путем внесения в исследуемый образец воды сорбента на основе магнитных микрочастиц, покрытых полимером диоксида кремния с аминопропильными группами, в соотношении 1:1000-3000 от объема образца воды, инкубации при постоянном перемешивании в течение 1-2 ч, сбора сорбента с использованием магнита, удаления супернатанта и получения комплекса сорбента с кишечными вирусами, причем элюцию кишечных вирусов осуществляют раствором 0,5М NaCl и 0,05М Трис (рН 10,5).
Источник поступления информации: Роспатент

Показаны записи 1-3 из 3.
27.12.2014
№216.013.15ce

Рекомбинантная плазмидная днк ppa-oprfi, кодирующая гибридный рекомбинантный белок f-i наружной мембраны pseudomonas aeruginosa, штамм escherichia coli pa-oprfi-продуцент гибридного рекомбинантного белка f-i наружной мембраны pseudomonas aeruginosa и способ получения гибридного рекомбинантного белка f-i наружной мембраны pseudomonas aeruginosa

Изобретение относится к области биотехнологии и касается рекомбинантной плазмидной ДНК pPA-OPRFI, кодирующей гибридный рекомбинантный белок F-I наружной мембраны Pseudomonas aeruginosa, штамма бактерий E.coli PA-OPRFI, продуцента такого гибридного белка и способа получения указанного...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002537006
Дата охранного документа: 27.12.2014
09.05.2019
№219.017.50b3

Жидкая питательная среда для накопления высокоактивных метаболитов штаммом bacillus pumilus "пашков", обладающих ингибирующим действием в отношении бактерий, грибов и вирусов

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения высокоактивных метаболитов, обладающих бактерицидным действием в отношении условно-патогенных и патогенных бактерий, фунгистатическим действием в отношении дрожжевых грибов и противовирусным действием в отношении...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002460773
Дата охранного документа: 10.09.2012
18.05.2019
№219.017.5a2b

Свежевыделенный штамм бактерий bordetella pertussis - продуцент коклюшного токсина

Сущность изобретения: получен новый свежевыделенный от больного штамм бактерий Bordetella pertussis №162-01, который депонирован в ФГУН ГНИИ стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича под номером №287. Штамм адаптирован к синтетической среде...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002407788
Дата охранного документа: 27.12.2010
Показаны записи 1-10 из 16.
10.02.2014
№216.012.9ea1

Способ выявления кишечных вирусов в клинических образцах и воде методом мультиплексной пцр с детекцией в режиме реального времени и перечень последовательностей для его осуществления

Изобретение относится к области лабораторной диагностики, медицинской вирусологии, молекулярной биологии и эпидемиологии. Изобретение предназначено для выявления и идентификации в клинических образцах и элюатах, полученных в результате концентрирования из воды, одиннадцати групп кишечных...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002506317
Дата охранного документа: 10.02.2014
20.04.2014
№216.012.bb5c

Штамм вируса иммунодефицита человека 1-го типа ив710 субтипа а резистентный к антиретровирусным препаратам для диагностических и вакцинных препаратов

Изобретение относится к штамму вируса иммунодефицита человека, принадлежащему к субтипу А, и может быть использовано в вирусологии, медицине и биотехнологии. Представленный штамм вируса иммунодефицита человека I-го типа ИВ710 депонирован в Государственной коллекции вирусов ФГБУ НИИ вирусологии...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002513692
Дата охранного документа: 20.04.2014
20.04.2014
№216.012.bb5d

Штамм вируса иммунодефицита человека 1-го типа ив742 субтипа а для диагностических и вакцинных препаратов

Изобретение относится к штамму вируса иммунодефицита человека, принадлежащему к субтипу А, и может быть использовано в вирусологии, медицине и биотехнологии. Штамм вируса иммунодефицита человека I-го типа ИВ742 депонирован в Государственной коллекции вирусов ФГБУ НИИ вирусологии им....
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002513693
Дата охранного документа: 20.04.2014
27.06.2014
№216.012.d6fb

Штамм вируса иммунодефицита человека 1-го типа ив735 субтипа в для диагностических и вакцинных препаратов

Изобретение относится к штамму вируса иммунодефицита человека, принадлежащему к субтипу B, и может быть использовано в вирусологии, медицине и биотехнологии. Представленный штамм вируса иммунодефицита человека I-го типа ИВ735 субтипа В депонирован в Государственной коллекции вирусов ФГБУ НИИ...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002520813
Дата охранного документа: 27.06.2014
27.06.2014
№216.012.d6fc

Штамм вируса иммунодефицита человека 1-го типа ив741 субтипа ае для диагностических и вакцинных препаратов

Изобретение относится к области вирусологии и биотехнологии. Штамм вируса иммунодефицита человека I-типа ИВ741 выделен на территории РФ от больного не получавшего АРВ-терапию. Штамм депонирован в Государственную коллекцию вирусов ФГБУ НИИ им. Д.И. Ивановского Минздравсоцразвития России, номер...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002520814
Дата охранного документа: 27.06.2014
27.07.2014
№216.012.e5ce

Магнитоуправляемый сорбент для удаления билирубина из биологических жидкостей

Изобретение относится к медицине и используется для лечения эндогенной интоксикации, вызываемой высокой концентрацией билирубина в плазме крови при различных патологиях. Сущность способа: поверхность магнитоуправляемого сорбента покрывается гидрофобными лигандами или в виде метилового эфира...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002524620
Дата охранного документа: 27.07.2014
20.08.2014
№216.012.e9cd

Способ получения высокотитражной антимикробной сыворотки для оценки антигенной активности противостафилококковых вакцин

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения высокотитражной антимикробной сыворотки. Способ включает использование штамма S.aureus №1991, характеризующийся иммуногенностью ED=(50-100)×10 микробных клеток, слабой вирулентностью LD=(0,5-2,0)×10 микробных клеток. Его...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002525661
Дата охранного документа: 20.08.2014
25.08.2017
№217.015.bfb5

Способ получения амфифильных блок-сополимеров n,n-диметиламиноэтилметакрилата для доставки нуклеиновых кислот в живые клетки

Группа изобретений относится к области химии высокомолекулярных соединений и медицины, а именно к вариантам способа получения псевдоживой радикальной полимеризации амфифильных блок-сополимеров для трансфекции эукариотических клеток, включающих катионный блок –...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002617059
Дата охранного документа: 19.04.2017
29.12.2017
№217.015.f559

Способ получения живой культуральной аттенуированной вакцины для профилактики ветряной оспы

Группа изобретений относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть использована для получения моновакцины против ветряной оспы. Способ получения живой культуральной аттенуированной вакцины для профилактики ветряной оспы включает заражение вирусом ветряной оспы штаммом «ОКА»...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002637093
Дата охранного документа: 29.11.2017
11.03.2019
№219.016.ddde

Способ дифференциальной диагностики респираторных вирусных инфекций методом мультиплексной пцр с детекцией в режиме реального времени и перечень последовательностей для его осуществления

Изобретение относится к биотехнологии, медицинской вирусологии, молекулярной биологии и эпидемиологии. Описан способ дифференциальной диагностики респираторных вирусных инфекций методом мультиплексной обратной транскрипции и ПЦР с детекцией в режиме реального времени. Способ предусматривает...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002460803
Дата охранного документа: 10.09.2012
+ добавить свой РИД