Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ХЛАМИДИЙНОЙ ИНФЕКЦИИ ЧЕЛОВЕКА ИЛИ ОБЕЗЬЯН И НАБОР ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Изобретение относится к медицине и биологии и может быть использовано для диагностики хламидийной инфекции человека и обезьян.

Хламидии являются широко распространенной группой внутриклеточных облигатных паразитов, вызывающих заболевания человека и животных. Среди возбудителей хламидиозов в настоящее время особо важное значение для медицины представляет Chlamydia trachomatis, вызывающая различные инфекционные заболевания, в том числе инфекции урогенитального тракта, трахому, венерическую лимфогранулему, воспалительные заболевания лимфаденоидного кольца глотки, инфекционную патологию органов дыхания и конъюнктивы новорожденных, и Chlamydophila pneumoniae особенно как этиологический фактор пневмоний и патологии сердечно-сосудистой системы.

Для эффективного исследования клиники, патогенеза и лечения хламидийных инфекций необходимо использование оптимальной экспериментальной модели. Такой моделью могут быть обезьяны как более близкие к человеку животные по эволюционной лестнице. Известно экспериментальное заражение данных животных хламидиями, выделенными от человека (Patton D.L., Cosgrove Y.T., Kuo Cho-Chou, Campbell L.A. Effects of quinolone analog CI-960 in a monkey model of Chlamydia trachomatis salpingitis // Antimicrobial agents and chemotherapy. - 1993. - Vol.37, N 1. - P.8-13). Однако до наших исследований не было известно о наличии у обезьян собственной хламидийной инфекции. В связи с этим для исключения ложных результатов экспериментального изучения хламидийной инфекции, вызванной Chlamydia trachomatis и Chlamydophila pneumoniae, мы провели исследования по выявлению у видов обезьян, перспективных для использования в качестве модели для изучения хламидиоза, собственной хламидийной инфекции, вызванной этими видами хламидий. В результате проведенных нами исследований было установлено, что у обезьян существуют собственные заболевания урогенитального тракта, органов дыхания и органов зрения, вызванные Chlamydia trachomatis и Chlamydophila pneumoniae в виде хламидийной моноинфекции или хламидийной микст-нфекции.

Поэтому нами был разработан способ на основе наиболее чувствительного метода выявления хламидий - полимеразной цепной реакции (ПЦР), обеспечивающий диагностику и у человека, и у обезьян хламидийной моноинфекции или хламидийной микст-инфекции, вызванной Chlamydia trachomatis и Chlamydophila pneumoniae.

Известен способ определения в мультиплексной ПЦР ДНК возбудителей хламидийных инфекций животных и птиц: Chlamydophila felis, Chlamydophila psittaci, Chlamydophila abortus, Chlamydophila pneumoniae и Chlamydia suis, на основе получения и детекции фрагментов генов главного белка мембраны (МОМР) с использованием 3 прямых и 6 обратных праймеров (UA 11834 U, 15.01.2006; А61К 39/118).

Основным недостатком известного способа определения в мультиплексной ПЦР ДНК возбудителей хламидийных инфекций является невозможность его использования для диагностики у человека и обезьян хламидийной моноинфекции, вызванной Chlamydia trachomatis, или хламидийной микст-нфекции, вызванной Chlamydia trachomatis и Chlamydophila pneumoniae, вследствие отсутствия праймеров к гену Chlamydia trachomatis и возможности детекции возбудителей хламидиоза, присущих только животным и птицам, которыми человек может инфицироваться сравнительно редко. Кроме того, недостатком известного способа является использование сравнительно большого числа обратных праймеров, что усложняет известный способ.

Наиболее близким аналогом заявляемого способа является использование для детекции Chlamydophila psittasi, Chlamydophila pecorum, Chlamydophila pneumoniae или Chlamydia trachomatis ПЦР с использованием праймеров, ориентированных на участки гена 16S рибосомальной РНК:

5'-TCTTGGGGCTCAACCCCAAGC-3'

5'-ACGACACGGATAGGGTTGAGACT-3'

5'-GAGAAGTTGGCTAATATCCAAC-3'

5'-GAAAGATAGTATTAGATGCCGA-3'

5'-CCTTTTGGTTAAGAGAAAGTCTG-3'

5'-GCCGACTTGAGGTTGAGCCT-3'

5'-AGACGGTTAATACCCGCTG-3'

5'-CCGATCTTGACAACTAACTTA-3'

5'-CCTTTCGGTTGAGGAAGAGTTTATGC-3'

5'-CTTGCGGAAAGCTGTATTTCTACAGTT-3'

5'-CAGATTGAACGCTGGCGGCGTGGATG-3'

5'-AGTCATCAGCCTCACCTTGGGCGCCT-3'

5'-CGGATCCTGAGAATTTGATC-3'

5'-TGTCGACAAAGGAGGTGATCCA-3'

(JP 10262679, 10.06.1998; C12N 15/00, 15/09, C07H 21/02, C12N 1/21, C12Q 1/04, 1/68).

Основными недостатками данного аналога являются: во-первых, то, что он не предназначен для диагностики у человека и обезьян хламидийной моноинфекции, вызванной Chlamydia trachomatis или Chlamydophila pneumoniae, или хламидийной микст-инфекции, вызванной Chlamydia trachomatis и Chlamydophila pneumoniae, и, во-вторых, использование сравнительно большого числа праймеров, усложняющее диагностику хламидийной инфекции.

В основу изобретения положена задача обеспечения расширения возможности использования ПЦР для идентификации наиболее распространенных возбудителей хламидийной инфекции, а именно возможности применения ее для диагностики и у человека, и обезьян как хламидийной моноинфекции, так и хламидийной микст-инфекции, вызванной Chlamydia trachomatis и Chlamydophila pneumoniae, при упрощении способа диагностики.

Задача решена тем, что при диагностике хламидийной моноинфекции или хламидийной микст-инфекции человека или обезьян после выделения ДНК из клинического материала или культуры клеток, зараженной хламидиями, выделенными из клинического материала, проводят мультиплексную ПЦР с использованием только трех праймеров: Ctr 5'-TGGCGATATTTGGGCATCC-3', Cpn 5'-CGGAATAATGACTTCGGTTG-3' и R 5'-CTTCTTTACCTGGTACGCTC-3', и затем электрофоретический анализ продуктов амплификации и диагностируют: хламидийную моноинфекцию человека или обезьян, вызванную Chlamydia trachomatis, при положительной ПЦР с праймерами Ctr 5'-TGGCGATATTTGGGC АТСС-3' и R 5'-CTTCTTTACCTGGTACGCTC-3'; хламидийную моноинфекцию человека или обезьян, вызванную Chlamydophila pneumoniae, при положительной ПЦР с праймерами Cpn 5'-CGGAATAATGACTTCGGTTG-3' и R 5'-CTTCTTTACCTGGTACGCTC-3'; хламидийную микст-инфекцию человека или обезьян, вызванную Chlamydia trachomatis и Chlamydophila pneumoniae, при положительной ПЦР с праймерами Ctr 5'-TGGCGATATTTGGGCATCC-3', Cpn 5'-CGGAATAATGACTTCGGTTG-3' и R 5'-CTTCTTTACCTGGTACGCTC-3'. Набор для осуществления заявляемого способа содержит праймеры Ctr 5'-TGGCGATATTTGGGCATCC-3', Cpn 5'-CGGAATAATGACTTCGGTTG-31 и R 5'-CTTCTTTACCTGGTACGCTC-3', термостабильный фермент Tag-полимеразу, буфер для постановки реакции, смесь четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, положительный контроль, отрицательный контроль, воск и масло для проведения ПЦР.

Проведенные нами исследования позволили разработать сочетание трех праймеров: двух новых прямых праймеров (Ctr и Cpn соответственно для Chlamydia trachomatis и Chlamydophila pneumoniae) и одного нового обратного праймера, для обоих видов хламидий, пригодных для использования в мультиплексной ПЦР, что обеспечивает расширение возможности использования ПЦР для идентификации наиболее распространенных возбудителей хламидийной инфекции, а именно возможности применения ее для диагностики и у человека, и обезьян как хламидийной моноинфекции, так и хламидийной микст-инфекции, вызванной Chlamydia trachomatis и Chlamydophila pneumoniae, при упрощении способа диагностики.

Заявляемый способ диагностики хламидийной инфекции является новым и в литературе не описан.

Техническим результатом заявляемого изобретения является обеспечение расширения возможности использования ПЦР для идентификации наиболее распространенных возбудителей хламидийной инфекции при упрощении способа диагностики за счет сочетания двух новых прямых праймеров (Ctr и Cpn соответственно для Chlamydia trachomatis и Chlamydophila pneumoniae) и одного нового обратного праймера для обоих видов хламидий, пригодных для использования в мультиплексной ПЦР.

Сущность изобретения поясняется на следующих примерах, показывающих при использовании заявляемого способа диагностики и заявляемого набора для его осуществления обеспечение расширения возможности использования ПЦР для идентификации наиболее распространенных возбудителей хламидийной инфекции при упрощении способа диагностики.

Пример 1. Обезьяна вида Павиан анубис, самка, возраст 25 лет. Клинический диагноз - цервицит.

Первоначально выделяли ДНК из соскобного материала слизистой оболочки цервикального канала шейки матки животного. Затем проводили мультиплексную ПЦР с использованием набора для ПЦР-диагностики хламидийной инфекции, содержащего праймеры Ctr 5'-TGGCGATATTTGGGCATCC-3', Cpn 5'-CGGAATAATGACTTCGGTTG-3' и R 5'-CTTCTTTACCTGGTACGCTC-3', термостабильный фермент Tag-полимеразу, буфер для постановки реакции, смесь четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, положительный контроль, отрицательный контроль, воск и масло для проведения ПЦР, с последующим электрофоретическим анализом продуктов амплификации.

В результате проведенного исследования была установлена положительная ПЦР с праймерами Ctr 5'-TGGCGATATTTGGGCATCC-3' и R 5'-CTTCTTTACCTGGTACGCTC-3'.

На основании результатов ПЦР у обследуемой обезьяны была диагностирована хламидийная моноинфекция, вызванная Chlamydia trachomatis.

Пример 2. Пациентка М., возраст 56 лет. Клинический диагноз - назофарингит.

Первоначально выделяли ДНК из соскобного материала слизистой оболочки носоглотки пациентки. Затем проводили мультиплексную ПЦР с использованием набора для ПЦР-диагностики хламидийной инфекции, содержащего праймеры Ctr 5'-TGGCGATATTTGGGCATCC-3', Cpn 5'-CGGAATAATGACTTCGGTTG-3' и R 5'-CTTCTTTACCTGGTACGCTC-3', термостабильный фермент Tag-полимеразу, буфер для постановки реакции, смесь четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, положительный контроль, отрицательный контроль, воск и масло для проведения ПЦР, с последующим электрофоретическим анализом продуктов амплификации.

В результате проведенного исследования была установлена положительная ПЦР с праймерами Cpn 5'-CGGAATAATGACTTCGGTTG-3' и R 5'-CTTCTTTACCTGGTACGCTC-3'.

На основании результатов ПЦР у обследуемой пациентки была диагностирована хламидийная моноинфекция, вызванная Chlamydophila pneumoniae.

Пример 3. Погибшая обезьяна вида Макак резус, самка, возраст 5 месяцев. Патологоанатомический диагноз - пневмония.

Первоначально выделяли ДНК из культуры клеток McCoy, зараженной материалом от погибшего животного. Затем проводили мультиплексную ПЦР с использованием набора для ПЦР-диагностики хламидийной инфекции, содержащего праймеры Ctr 5'-TGGCGATATTTGGGCATCC-3', Cpn 5'-CGGAATAATGACTTCGGTTG-3' и R 5'-CTTCTTTACCTGGTACGCTC-3', термостабильный фермент Tag-полимеразу, буфер для постановки реакции, смесь четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, положительный контроль, отрицательный контроль, воск и масло для проведения ПЦР, с последующим электрофоретическим анализом продуктов амплификации.

В результате проведенного исследования была установлена положительная ПЦР с праймерами Ctr 5'-TGGCGATATTTGGGCATCC-3', Cpn 5'-CGGAATAATGACTTCGGTTG-3' и R 5'-CTTCTTTACCTGGTACGCTC-3'.

На основании результатов ПЦР у погибшей обезьяны была диагностирована хламидийная микст-инфекция, вызванная Chlamydia trachomatis и Chlamydophila pneumoniae.

Пример 4. Пациент А., возраст 20 лет. Клинический диагноз - уретрит.

Первоначально выделяли ДНК из соскобного материала слизистой оболочки уретры. Затем проводили мультиплексную ПЦР с использованием набора для ПЦР-диагностики хламидийной инфекции, содержащего праймеры Ctr 5'-TGGCGATATTTGGGCATCC-3', Cpn 5'-CGGAATAATGACTTCGGTTG-3' и R 5'-CTTCTTTACCTGGTACGCTC-3', термостабильный фермент Tag-полимеразу, буфер для постановки реакции, смесь четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, положительный контроль, отрицательный контроль, воск и масло для проведения ПЦР, с последующим электрофоретическим анализом продуктов амплификации.

В результате проведенного исследования была установлена положительная ПЦР с праймерами Ctr 5'-TGGCGATATTTGGGCATCC-3' и R 5'-CTTCTTTACCTGGTACGCTC-3'.

На основании результатов ПЦР у обследуемого пациента была диагностирована хламидийная моноинфекция, вызванная Chlamydia trachomatis.

Пример 5. Погибшая обезьяна вида Макак лапундер, самец, возраст 2 недели. Патологоанатомический диагноз - пневмония.

Первоначально выделяли ДНК из материала от павшего животного. Затем проводили мультиплексную ПЦР с использованием набора для ПЦР-диагностики хламидийной инфекции, содержащего праймеры Ctr 5'-TGGCGATATTTGGGCATCC-3', Cpn 5'-CGGAATAATGACTTCGGTTG-3' и R 5'-CTTCTTTACCTGGTACGCTC-3', термостабильный фермент Tag-полимеразу, буфер для постановки реакции, смесь четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, положительный контроль, отрицательный контроль, воск и масло для проведения ПЦР, с последующим электрофоретическим анализом продуктов амплификации.

В результате проведенного исследования была установлена положительная ПЦР с праймерами Cpn 5'-CGGAATAATGACTTCGGTTG-3', R 5'-CTTCTTTACCTGGTACGCTC-3'.

На основании результатов ПЦР у погибшей обезьяны была диагностирована хламидийная моноинфекция, вызванная Chlamydophila pneumoniae.

Пример 6. Пациент К., возраст 12 лет. Клинический диагноз - конъюнктивит левого глаза.

Первоначально выделяли ДНК из культуры клеток McCoy, зараженной соскобным материалом со слизистой оболочки конъюнктивы глаза пациента. Затем проводили мультиплексную ПЦР с использованием набора для ПЦР-диагностики хламидийной инфекции, содержащего праймеры Ctr 5'-TGGCGATATTTGGGCATCC-3', Cpn 5'-CGGAATAATGACTTCGGTTG-3' и R 5'-CTTCTTTACCTGGTACGCTC-3', термостабильный фермент Tag-полимеразу, буфер для постановки реакции, смесь четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, положительный контроль, отрицательный контроль, воск и масло для проведения ПЦР, с последующим электрофоретическим анализом продуктов амплификации.

В результате проведенного исследования была установлена положительная ПЦР с праймерами Ctr 5'-TGGCGATATTTGGGCATCC-3', Cpn 5'-CGGAATAATGACTTCGGTTG-3' и R 5'-CTTCTTTACCTGGTACGCTC-3' На основании результатов ПЦР у обследуемого пациента была диагностирована хламидийная микст-инфекция, вызванная Chlamydia trachomatis и Chlamydophila pneumoniae.

В модельных проведенных экспериментах по оценке аналитической чувствительности заявляемого способа с использованием разведений хламидийной ДНК установлено, что нижний предел обнаружения и Chlamydia trachomatis, и Chlamydophila pneumoniae в присутствии избыточного количества ДНК человека и обезьян в образце (200 нг) составил от 5 до 10 геном-эквивалентов на реакцию. При этом неспецифическая амплификация не наблюдалась.

При сравнительной оценке клинической чувствительности и специфичности заявляемого способа с использованием заявляемого набора в сравнении с определением ДНК Chlamydia trachomatis с использованием ПЦР-тест-системы «Амплисенс Chlamydia trachomatis)) (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) в параллельном анализе 245 образцов клинического материала от человека и обезьян установлено, что из 245 образцов в 128 образцах совпали положительные результаты ПЦР, в 68 образцах совпали отрицательные результаты ПЦР. Сорок девять образцов не могли быть объективно проанализированы с помощью ПЦР-тест-системы «Амплисенс Chlamydia trachomatis)) в связи с наличием микст-инфекции, вызванной Chlamydia trachomatis и Chlamydophila pneumoniae.

Таким образом, приведенные примеры доказывают возможность применения заявляемого способа для диагностики и у человека, и обезьян как хламидийной моноинфекции, так и хламидийной микст-инфекции, вызванной наиболее распространенными возбудителями хламидийной инфекции Chlamydia trachomatis и Chlamydophila pneumoniae, при использовании только трех праймеров, что расширяет возможность использования ПЦР для диагностики хламидийной инфекции при упрощении способа.