ВАКЦИНА ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАХЕИТА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА СОРБИРОВАННАЯ ИНАКТИВИРОВАННАЯ

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при разработке и изготовлении средств специфической профилактики инфекционного ринотрахеита (ИТР) крупного рогатого скота (КРС).

ИРТ - остро протекающая контагиозная болезнь КРС вирусной этиологии, наносящая значительный экономический ущерб скотоводству.

Вирус ИРТ вызывает заболевание КРС различных возрастных групп, проявляющееся пятью формами: поражением верхних дыхательных путей, вагинитами, энцефалитами, конъюнктивитами и артритами. Кроме того, у телят возможна пневмония.

Болезнь широко распространена во всем мире. В США в 1954-1956 г. она протекала как эпизоотия с большим экономическим ущербом. Частые случаи ИРТ отмечены в Канаде, Южной Африке, Новой Зеландии, Австралии, Англии, Германии, Франции, Швеции, Швейцарии, Австрии, Италии, Румынии и других странах. В нашей стране ИРТ был впервые диагностирован в 1968 г. и подтвержден вирусологически в 1969 г. в связи с ввозом различных пород КРС из некоторых вышеуказанных стран, неблагополучных по данной инфекции.

Экономический ущерб, наносимый ИРТ, слагается из снижения удоев в период болезни (до 50-60%), значительного увеличения сервис-периода и яловости коров, болевших вагинальной формой, слабого развития больного молодняка и значительным процентом гибели и выбраковки телят. При хронической серозно-гнойной пневмонии погибает до 20% молодняка.

Вакцинопрофилактика ИРТ занимает ведущее место в комплексе противоэпизоотических мер, направленных на борьбу с этим заболеванием. Для профилактики ИРТ применяют как живые, так и инактивированные вакцины, полученные из вируса, репродуцированного в различных культурах клеток (1, 2. 3).

Хотя преимущество живых вакцин из-за технологичности в производстве и простоты использования не вызывает сомнения, однако иммунная реакция у животных при их введении не всегда стабильна и в ряде случаев вызывает осложнения после вакцинации. По этой причине они не нашли широкого применения.

В настоящее время для специфической профилактики ИРТ КРС широко используют инактивированные вакцины как сорбированные, так и эмульсионные.

Известна вакцина против ИРТ КРС сорбированная инактивированная, содержащая антигенный материал из штамма вируса герпеса КРС серотипа 1, репродуцированного в чувствительной биологической системе и инактивированного сапонином, а из адъювантов - гидроокись алюминия в эффективном соотношении (4).

Наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вакцина против ИРТ КРС сорбированная инактивированная, содержащая антигенный материал из штамма №4016 вируса ИРТ КРС, репродуцированного в чувствительной биологической системе и инактивированного этиловым спиртом, а из адъювантов - гидроокись алюминия с сапонином в эффективном соотношении (5).

Основные недостатки вышеуказанных вакцин, в том числе и вакцины-прототипа, состоят в их низкой антигенной и иммуногенной активности по причине нестабильности при инактивации используемых штаммов вируса ИРТ КРС.

В связи с этим актуальной остается проблема разработки инактивированной сорбированной высокоиммуногенной и безвредной вакцины против ИРТ КРС на основе новых штаммов вируса ИРТ КРС, обладающих высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью и сохраняющих свои нативные иммунобиологические свойства после инактивации.

В задачу создания настоящего изобретения входило поиск, отбор и изучение эпизоотических изолятов вируса ИРТ КРС в целях получения новых производственных штаммов вируса ИРТ КРС, обладающих высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью и сохраняющих свои нативные иммунобиологические свойства после инактивации, и разработка на их основе высокоиммуногеннных, безвредных, инактивированных, сорбированных вакцинных препаратов, способных защитить поголовье КРС от эпизоотического возбудителя ИРТ КРС, циркулирующего на территории Российской Федерации.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в повышении антигенной и иммуногенной активности вакцины и ее безвредности, а также в расширении арсенала средств специфической профилактики ИРТ КРС.

Указанный технический результат достигнут созданием вакцины против ИРТ КРС сорбированной инактивированной, охарактеризованной следующей совокупностью признаков:

1. Вакцина против ИРТ КРС сорбированная инактивированная.

2. Антигенный материал из возбудителя ИРТ КРС, репродуцированного в чувствительной биологической системе и подвергнутого инактивации, в эффективном количестве.

2.1. В качестве антигенного материала из возбудителя ИРТ КРС антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС.

2.2. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток и подвергнутого инактивации.

2.3. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и инактивированного аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ).

2.4. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³ и инактивированного АЭЭИ.

2.5. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³ и инактивированного АЭЭИ, в количестве 50,0-80,0 мас.%.

2.6. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток MDBK и инактивированного АЭЭИ.

2.7. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток MDBK с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³ и инактивированного АЭЭИ.

2.8. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток MDBK с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³ и инактивированного АЭЭИ, в количестве 50,0-80,0 мас.%.

2.9. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток 3КГ (перевиваемая культура клеток гонад 3-дневной козы, ВСКК(СХЖ) РАСХН №45; пат. РФ №2061753, МПК С 12 N 5/06, 7/00, 10.06.96 г.) и инактивированного АЭЭИ.

2.10. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток 3КГ с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³ и инактивированного АЭЭИ.

2.11. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток 3КГ с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³ и инактивированного АЭЭИ, в количестве 50,0-80,0 мас.%.

3. Адъювант.

3.1. Из адъювантов гидроокись алюминия (ГОА).

3.2. ГОА в виде 3-4% геля.

3.3. ГОА в количестве 19,5-49,5 мас.%.

3.4. Из адъювантов дополнительно сапонин.

3.5. Сапонин в виде 10% водного раствора.

3.6. Сапонин в количестве 0,4 мас.%.

4. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток, взятой из группы, состоящей из перевиваемой культуры клеток ВНК-21, перевиваемой культуры клеток MDBK и перевиваемой культуры клеток 3КГ, с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³ и инактивированного АЭЭИ, и адъюванты ГОА и сапонин в соотношении, мас.%:

Предлагаемое изобретение включает совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:

1. Вакцина против ИРТ КРС сорбированная инактивированная.

2. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в чувствительной биологической системе и подвергнутого инактивации, в эффективном количестве.

3. Адъювант.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:

1. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток и подвергнутого инактивации.

2. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и инактивированного АЭЭИ.

3. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³ и инактивированного АЭЭИ.

4. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³ и инактивированного АЭЭИ, в количестве 50,0-80,0 мас.%.

5. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток MDBK и инактивированного АЭЭИ.

6. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток MDBK с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³ инактивированного АЭЭИ.

7. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток MDBK с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³ и инактивированного АЭЭИ, в количестве 50,0-80,0 мас.%.

8. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток 3КГ и инактивированного АЭЭИ.

9. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток 3КГ с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ТЦЦ₅₀/см³ и инактивированного АЭЭИ.

10. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток 3КГ с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³ и инактивированного АЭЭИ, в количестве 50,0-80,0 мас.%.

11. Из адъювантов ГОА.

12. ГОА в виде 3-4% геля.

13. ГОА в количестве 19,6-49,6 мас.%.

14. Из адъювантов дополнительно сапонин.

15. Сапонин в виде 10% водного раствора.

16. Сапонин в количестве 0,4 мас.%.

20. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток, взятой из группы, состоящей из перевиваемой культуры клеток ВНК-21, перевиваемой культуры клеток MDBK и перевиваемой культуры клеток 3КГ, с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³ и инактивированного АЭЭИ, и адъюванты ГОА и сапонин в соотношении, мас.%:

Признаками изобретения, характеризующими предлагаемую вакцину и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:

1. Вакцина против ИРТ КРС сорбированная инактивированная.

2. Антигенный материал из возбудителя ИРТ КРС, репродуцированного в чувствительной биологической системе и подвергнутого инактивации.

3. По меньшей мере, один адъювант.

По сравнению с вакциной-прототипом существенным отличительным признаком предлагаемой вакцины является то, что в качестве антигенного материала из возбудителя ИРТ КРС она содержит антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:

1. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток и подвергнутого инактивации.

2. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и инактивированного АЭЭИ.

3. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³ и инактивированного АЭЭИ.

4. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³ и инактивированного АЭЭИ, в количестве 50,0-80,0 мас.%.

5. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток MDBK и инактивированного АЭЭИ.

6. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток MDBK с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³ и инактивированного АЭЭИ.

7. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток MDBK с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³ и инактивированного АЭЭИ, в количестве 50,0-80,0 мас.%.

8. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток 3КГ и инактивированного АЭЭИ.

9. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток 3КГ с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³ и инактивированного АЭЭИ.

10. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток 3КГ с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³, и инактивированного АЭЭИ, в количестве 50,0-80,0 мас.%.

11. Из адъювантов ГОА.

12. ГОА в виде 3-4% геля.

13. ГОА в количестве 19,6-49,6 мас.%.

14. Из адъювантов дополнительно сапонин.

15. Сапонин в виде 10% водного раствора.

16. Сапонин в количестве 0,4 мас.%.

17. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток, взятой из группы, состоящей из перевиваемой культуры клеток ВНК-21, перевиваемой культуры клеток MDBK и перевиваемой культуры клеток 3КГ, с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³ и инактивированного АЭЭИ, и адъюванты ГОА и сапонин в соотношении, мас.%:

По сравнению с вакциной-прототипом предлагаемая вакцина обладает более высокой антигенной и иммуногенной активностью и безвредностью и расширяет арсенал средств специфической профилактики ИРТ КРС.

Достижение технического результата от использования предлагаемого изобретения объясняется тем, что в состав предлагаемой вакцины введен антигенный материал из нового штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" ИРТ КРС, обладающего высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации и обеспечивающего получение вакцины, создающей напряженный и длительный иммунитет у привитых животных.

Штамм "ВНИИЗЖ-ДЕП" является новым, ранее неизвестным.

Исходный вирус для получения штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" выделен из патологического материала телят, павших с клиникой ИРТ КРС, во время вспышки заболевания в СПК "Миневское" Нижегородской области в 1998 году.

Производственный штамм "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС получен путем многократных последовательных пассажей на чувствительных биологических системах.

Полученный штамм депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Всероссийского научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) МСХ РФ 12 марта 2001 года под регистрационным шифром "ВНИИЗЖ-ДЕП".

Штамм "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС обладает высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации.

Экспериментально подтверждена его возможность использования для приготовления инактивированной сорбированной вакцины против ИРТ КРС. Штамм "ВНИИЗЖ-ДЕП" обеспечивает получение инактивированной вакцины против ИРТ КРС, создающей эффективную защиту КРС против указанного возбудителя заболевания.

Штамм "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические свойства

Штамм "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ относится к семейству Herpesviridae, подсемейству Alphaherpesviridae, роду Varicellavirus, группе HPV-1, обладает морфологическими признаками, характерными для данного семейства.

Штамм "ВНИИЗЖ-ДЕП" состоит из линейной 2-нитчатой ДНК с молекулярной массой 92-102 кД, вирионы - частицы округлой формы состоят из 4-х структурных компонентов: нуклеотида, капсида диаметром 120-150 нм, окруженного содержащей липиды оболочкой, мембраны (тегумента) и наружной оболочки.

Плавучая плотность вирионов в градиенте CsCl 1,27-1,29 г/см³. Нуклеотид тороидальной формы содержит ДНК и окружен икосаэдрическим капсидом диаметром 100-110 нм, содержащим 162 частично полых капсомера. Капсид окружает ядро вириона, состоящее из ДНК, покрытой белком. Мембрана из глобулярного материала окружает капсид. В составе вириона определено до 32 белков с молекулярной массой до 290 кД. Вирионы имеют сложную организацию, включая не менее 4 компонентов: core, капсид, суперкапсидную структуру и оболочку. Наружная оболочка вирионов имеет типичное строение и содержит многочисленные выступы (шипы) длиной около 8 нм. Вирусы формируют характерные внутриядерные включения. Вирионы при прохождении через внутренний листок ядерной мембраны в эндоплазматический ретикулум покрываются дополнительной оболочкой, содержащей гликопротеины и липиды.

Антигенные свойства

По своим антигенным свойствам штамм "ВНИИЗЖ-ДЕП" относится к группе 1 герпесвирусов КРС. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус обладает гемагглютинирующей активностью (ГА-активностью), реагируя с антителами переболевших или иммунизированных животных в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА). При вакцинации лабораторных и естественно-восприимчивых животных вирусный антиген индуцирует образование специфических антител, выявляемых в РНГА в разведении 1:16-1:256.

Биотехнологические характеристики

Штамм "ВНИИЗЖ-ДЕП" является вирулентным и обладает высокой биологической активностью в нативном виде, а также проявляет высокие антигенные и иммуногенные свойства после инактивации.

Штамм "ВНИИЗЖ-ДЕП" предназначен для изготовления инактивированной вакцины против ИРТ КРС. Штамм "ВНИИЗЖ-ДЕП" репродуцируется в перевиваемых культурах клеток ВНК-21, MDBK и 3КГ, вызывая цитопатическое действие (ЦПД), и в течение 48-96 часов инкубирования накапливается в титре 6,5-8,0 Ig ТЦД₅₀/см³. Штамм "ВНИИЗЖ-ДЕП" является стабильным и сохраняет свои свойства на протяжении 10 пассажей (срок наблюдения).

Хемо- и генотаксономическая характеристика

Выделено и охарактеризовано 9 структурных белков вируса ИРТ: VP 105, VP 90 (гемагглютинин), VP74, VP64, VP54, VP50, VP47, VP40, VP31.

Гликопротеины g¹, g^III, g^IV участвуют в формировании гуморального и клеточного иммунитета. Наиболее эффективным в этом отношении является g^IV.

По данным реакции нейтрализации наибольшей иммуногенностью обладают VP90 и VP74. Белок, маркированный как VP8, с мол. массой 96 кД является одним из главных белков герпесвируса - 1 КРС. Он участвует в модуляции экспрессии генов класса А. У телят он стимулирует пролиферацию Т-клеток и образование антител как после заражения, так и после иммунизации очищенным белком. За индукцию вируснейтрализующих антител герпесвируса-1 КРС ответственны 4-х оболочечные гликопротеины, главными из них являются g⁷⁰ и g⁹⁷. ГА-активность вируса связана с мажорным g⁹⁷, расположенным в шипиках вириона. В структуре g^IV вируса ИРТ идентифицированы 3 нейтрализующих домена.

Домен 1 содержит 2 перекрывающих эпитопа, домен 2 - один эпитоп. Домен 1 имеет отношение к проникновению вируса в клетки-мишени.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм "ВНИИЗЖ-ДЕП" устойчив к воздействию низких температур. При минус 60-70°С вирус выживает 7-9 месяцев, при 56°С инактивируется через 20 минут, при 37°С - через 4-10 суток, при 22°С - через 50 суток. При 4°С активность вируса снижается через 30-40 суток лишь на 1 Ig.

Растворы формалина 1:500 инактивируют вирус через 24 часа. Ацетон, эфир, хлороформ и этиловый спирт инактивируют его немедленно. В кислой среде вирус быстро теряет свою активность, но длительно (до 9 мес) сохраняется при рН 6-9 и в условиях 4°С.

Лиофилизация почти не влияет на его активность, однако многократное замораживание и оттаивание снижает вирулентность и иммуногенность вируса.

Дополнительные признаки и свойства

Иммуногенная активность - 100%

Патогенность - выражена

Вирулентность - выражена

Контагиозность - выражена

Онкогенность - отсутствует.

Свободен от контаминации бактериями, микоплазмами и другими гемагглютинирующими вирусами.

На основании полученных данных можно утверждать, что штамм "ВНИИЗЖ-ДЕП" по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным изолятом вируса ИРТ КРС. Для снижения его эпизоотической опасности необходима своевременная профилактика вновь возникающих очагов болезни, а для этого необходима высокоактивная и безвредная вакцина.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источники, характеризующиеся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам предлагаемого изобретения.

Определение из перечня выявленных аналогов прототипа как наиболее близкого по совокупности существенных признаков аналога позволило установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков предлагаемой вакцины, изложенных в независимом пункте формулы изобретения.

Следовательно, заявляемое решение соответствует условию патентоспособности "новизна".

Для проверки соответствия предлагаемого решения условию патентоспособности "изобретательский уровень" проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительную часть независимого пункта формулы изобретения. Результаты поиска показали, что предлагаемое решение не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания (не выявлены решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемого изобретения), а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемого изобретения преобразований для достижения технического результата.

Следовательно, предлагаемая вакцина соответствует условию патентоспособности "изобретательский уровень".

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исполнения, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1.

Исходный вирус для получения штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" выделен из патологического материала (трахея, легкое, лимфатические узлы, селезенка) от телят, павших с клиникой ИРТ КРС, во время вспышки заболевания в СПК "Миневское" Нижегородской области в 1998 году. Вакцинный штамм получен во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты животных путем культивирования в перевиваемых культурах клеток ВНК-21, MDBK и 3КГ.

Из патологического материала готовили 20% суспензию в буферном растворе (50 мМ HCl, рН 8,0; 100 мМ NaCl; 1 мМ ЭДТА), которую осветляли низкоскоростным центрифугированием, надосадок концентрировали 7% ПЭГ, экстрагировали равным объемом буферного раствора и очищали ультрацентрифугированием в перформированном градиенте плотности CsCl-сахароза. Полученный вирус использовали для последующего пассирования.

Результаты исследований по адаптации вируса ИРТ КРС штамма "ВНИИЗЖ" к перевиваемым культурам клеток ВНК-21, MDBK и 3КГ представлены в таблицах 1, 2 и 3.

Полученный вирус был подвергнут всестороннему контролю в соответствии с руководством МЭБ по стандартным диагностическим методам и вакцинам (1996) и на уровне третьего пассажа заложен на хранение в качестве матровой расплодки. Вирус матровой расплодки с титром инфекционной активности 6,5-7,0 Ig ТЦД₅₀/см³ представлен в виде нативной суспензии культуральной жидкости и пораженного монослоя, хранится при температуре -40°С.

Полученному штамму вируса ИРТ КРС присвоено авторское наименование "ВНИИЗЖ".

Пример 2.

С целью определения биологической, антигенной и иммунологической активности вируса ИРТ КРС штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" осуществляли гипериммунизацию кроликов живой массой 2,5-3,0 кг.

Для получения антигена исходную вируссодержащую суспензию в виде 3-5 пассажа в культуре клеток MDBK троекратно замораживали-оттаивали. После этого вирусную жидкость осветляли низкоскоростным центрифугированием (2500-3000 об/мин) в течение 30 мин.

Инактивацию вирусной суспензии проводили рабочим раствором АЭЭИ, Во избежание изменения рН вирусной суспензии рабочий раствор АЭЭИ предварительно доводили 5М раствором уксусной кислоты до рН 7,8-8,2. Конечная концентрация инактиванта составила 0,1-0,15%. Смесь тщательно встряхивали и выдерживали при 37°С в течение 24 часов.

Концентрирование антигена проводили добавлением в суспензию инактивированного вируса 50% раствора ПЭГ М.м. 6000 до конечной концентрации 8-10% по сухому веществу. Смесь выдерживали в течение 16-18 часов при 4°С до формирования осадка. Осадок отделяли центрифугированием при 5000 об/мин в течение 30-40 мин и ресуспендировали в минимальном объеме раствора Хенкса (рН 7,2-7,4).

Для гипериммунизации кроликов использовали эмульсию инактивированного и концентрированного вируса ИРТ КРС штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП". Для изготовления эмульсии использовали минеральные или синтетические масла с соответствующими эмульгаторами. Стерильный адъювант в равных объемах смешивали с антигеном и гомогенизировали до получения стойкой водно-масляной эмульсии.

Животным вводили эмульсию инактивированного вируса ИРТ КРС штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" в объемной дозе 2 см³ с титром возбудителя до инактивации не ниже 6,5-7,0 Ig ТЦД₅₀/см³ в мякиши подушечек задних лапок. На 7 день инъекцию проводили в подколенные лимфоузлы, на 21 день - внутримышечно по 2 см³ эмульсии.

Через 10-15 дней после окончания гипериммунизации кроликов обескровливали, получали сыворотки крови индивидуально от каждого животного. Каждую сыворотку проверяли на активность и специфичность в РНГА. Результаты исследований представлены в таблице 4.

Приведенные в таблице 4 данные характеризуют высокую биологическую антигенную и иммунологическую активность штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТКРС при введении в организм лабораторных животных.

Пример 3.

Для получения сорбированной инактивированной вакцины против ИРТ КРС матровый вирус штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" репродуцируют заражением монослоя перевиваемой культуры клеток 3КГ или MDBK, или ВНК-21, выращенных в 1,5 дм³ матрасах или вращающихся сосудах объемом 3 дм³. Охлажденную при 4°С вируссодержащую суспензию, соблюдая стерильные условия, освобождают от клеточного детрита известным способом, используя низкоскоростное центрифугирование, и сливают в емкость. Освобожденная от детрита суспензия должна иметь вид прозрачной жидкости розового или вишневого цвета. Затем из емкости отбирают пробу для производственного контроля вирусного сырья. Производственная серия вируса ИРТ КРС должна иметь инфекционную активность не меньше 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³, активность в РДП не меньше 4,0 log₂.

Инактивацию вирусного сырья осуществляют с помощью 6% водного раствора АЭЭИ, вносимого в суспензию вируса ИРТ до конечной концентрации 0,1-0,2%. Для этого в суспензию, подогретую до 26-28°С, вносят при постоянном перемешивании раствор АЭЭИ и устанавливают рН суспензии в пределах 7,6-7,8 5М раствором уксусной кислоты или аммиака. Инактивацию вируса проводят при температуре 36-37°С в течение 24 часов с периодическим перемешиванием суспензии (по 3-5 мин через каждые 5-6 часов).

По окончании инактивации антигенный материал охлаждают до 2-8°С и отбирают пробы для проверки на остаточную инфекционность в культуре клеток MDBK.

Для нейтрализации АЭЭИ в суспензию антигенного материала добавляют 1М раствор тиосульфата натрия из расчета 10% к объему использованного АЭЭИ.

Полученный антигенный материал используют для изготовления сорбированной формы вакцины против ИРТ КРС.

В качестве адъюванта-сорбента в предлагаемой вакцине используют стерильный 3-4% гель ГОА.

Концентрацию и объем ГОА в конечном препарате и прививной дозе определяют по известной формуле в зависимости от титра вируса в исходной суспензии. Оптимальное количество ГОА в вакцине может составлять 19,6-49,6 мас.%. Смесь суспензии с ГОА перемешивают в течение 1 часа и оставляют для седиментации. Затем в полуфабрикат вакцины дополнительно добавляют 10% водный раствор адъюванта сапонина из расчета 2,0 мг на дозу вакцины, доводя концентрацию сапонина в объеме препарата до 0,04 мас.%. Смесь перед расфасовкой выдерживают при температуре 2-6°С в течение 120 часов при периодическом перемешивании.

Оптимальный компонентный состав (мас.%) полученной вакцины против ИРТ КРС приведен в таблице 5.

Содержание антигена в вакцине в указанных выше пределах является его эффективным количеством в препарате, обеспечивающим достижение технического результата.

Полученная вакцина представляет собой жидкость розового цвета с рыхлым осадком сорбента, который при встряхивании легко разбивается в гомогенную взвесь.

Вакцину контролируют на авирулентность и стерильность, а затем фасуют в стерильные флаконы.

Стерильность вакцины определяют в соответствии с ГОСТ 28085-89. Авирулентность препарата определяют методом трехкратных последовательных пассажей инактивированного антигена в перевиваемой культуре клеток MDBK по отсутствию ЦПД.

Определение безвредности вакцины проводят на морских свинках или кроликах. Для этого препарат вводят подкожно в области спины в дозе 2,0 см³ десяти морским свинкам или трем кроликам в дозе 5 см³.

Вакцина считается безвредной, если лабораторные животные в течение 10 суток наблюдения остаются клинически здоровыми без каких-либо патологических изменений. На месте введения допускается местная тканевая реакция.

Антигенную активность каждой серии вакцины проверяют на кроликах. Для этого берут 6 кроликов массой 2,0-2,5 кг. Вакцину вводят четырем кроликам подкожно в область спины по 2 см³. Через 14 сут после двукратного введения вакцины с интервалом 20-25 сут у кроликов из ушной вены берут по 2-3 см³ крови, выдерживают при температуре 37°С, отделяют сыворотку и исследуют на наличие антител к вирусу ИРТ КРС в реакции нейтрализации (РН). Контрольных кроликов (2 головы) обескровливают одновременно с вакцинированными. Пробы сывороток крови иммунизированных и контрольных кроликов объединяют в серии и исследуют одновременно на наличие антител к вирусу ИРТ КРС.

Испытуемые сыворотки прогревают на водяной бане при 56°С в течение 30 мин. Готовят двукратные разведения исследуемых сывороток от 1:2 до 1:64 в объеме 0,5 см³ на питательной среде для культуры клеток с антибиотиками. Затем готовят необходимый объем вируса, содержащего 100 ТЦД_50/0,1 см³, и добавляют его в количестве 0,5 см³ в каждую пробирку с сывороткой соответствующего разведения. Смесь сыворотки и вируса встряхивают и выдерживают при 37°С в течение 1 ч. После этого в четыре пенициллиновых флакона с культурой клеток вносят по 0,2 см³ смеси сыворотки и вируса и по 0,8 см³ поддерживающей среды с антибиотиками. Контролем служат пять пенициллиновых флаконов с незараженной культурой клеток, в которых производят смену питательной среды. Результаты реакции учитывают по ЦПД вируса через 5-7 сут.

Для контроля 100 ТЦД вируса готовят его десятикратное разведение, начиная с исходного до 10^-3 (исходное разведение соответствует рабочему разведению вируса, взятого для постановки реакции). В пенициллиновые флаконы с культурой клеток вносят по 4 флакона на каждое разведение, разведение вируса по 0,1 см³ и по 0,9 см³ среды. Опытные и контрольные флаконы выдерживают при 37°С. Контроль дозы вируса проводят после проявления ЦПД вируса в контрольном ряду флаконов. ЦПД вируса должно отмечаться в разведениях - исходном, 10^-1, 10^-2 (не менее двух флаконов). В разведении 10^-3 ЦПД должно отсутствовать. Во флаконах с незараженной культурой клеток ЦПД не должно наблюдаться.

Титром сыворотки считают предельное ее разведение, задерживающее развитие ЦПД вируса в 50% зараженных культур клеток. Положительной считается сыворотка, нейтрализующая 100 ТЦД вируса в разведении 1:2 и выше.

Серию вакцины считают прошедшей контроль на антигенность, если титр вирусспецифических антител к вирусу ИРТ КРС в РН не ниже 3,0 log₂.

Пример 4.

Проведены испытания антигенной активности предлагаемой вакцины против ИРТ КРС, изготовленной так, как описано в примере 3, и содержащей, мас.%:

Антигенную активность полученного препарата определяли на морских свинках массой 0,45-0,50 кг.

Результаты исследований представлены в таблице 6. Согласно данным таблицы 6 видно, что вакцина против ИРТ КРС сорбированная инактивированная из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" обладает высокой антигенной активностью.

Пример 5.

Проведены испытания антигенной активности предлагаемой вакцины против ИРТ КРС, изготовленной так, как описано в примере 3, и содержащей, мас.%:

Антигенную активность полученного препарата определяли на кроликах массой 2,0-2,5 кг.

Животным вводили по 1,0 см³ препарата внутримышечно в область бедра, через 21 день кроликов ревакцинировали в той же дозе. Перед первой вакцинацией и далее через каждые 7 дней у животных отбирали пробы крови и получали сыворотку. Последние исследовали на наличие специфических антител к вирусу ИРТ в РНГА. Титры антител выражали в виде log₂.

Результаты исследований представлены в таблице 7. Согласно данным таблицы 7 видно, что вакцина против ИРТ КРС сорбированная инактивированная из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" обладает высокой антигенной активностью.

Пример 6.

Проведены испытания иммуногенной активности предлагаемой вакцины против ИРТ КРС, изготовленной так, как описано в примере 3, и содержащей, мас.%:

Иммуногенную активность полученного препарата определяли на телятах 20-30-дневного возраста.

В результате проведенных исследований установлено, что у телят, привитых предлагаемой вакциной двукратно внутримышечно в дозе 5 см³, уже на 14 день после введения препарата индуцируется иммунный ответ, обеспечивающий 90-100% образование гуморальных антител и защиту животных от заболевания. Одна прививная доза предлагаемой вакцины в объеме 5 см³ содержит не менее 20 ИМД₅₀. Результаты исследований представлены в таблице 8.

Пример 7.

Проведены испытания эффективности предлагаемой вакцины против ИРТ КРС, изготовленной так, как описано в примере 3, и содержащей, мас.%:

Испытания проведены в колхозе "Арсений" Шуйского района Ивановской области в соответствии с Временным наставлением по применению предлагаемой вакцины. До вакцинации в хозяйстве отмечалось массовое заболевание коров, нетелей и молодняка старше 1,5-месячного возраста инфекционным пустулезным вульвагинитом с охватом 76% всего поголовья КРС.

Предлагаемой вакциной всего было привито 1216 голов КРС. В результате в хозяйстве был ликвидирован острый очаг инфекционного пустулезного вульвовагинита.

Таким образом, предлагаемая вакцина является безвредной и может быть использована для профилактики и борьбы с данным заболеванием.

Пример 8.

Проведены испытания эффективности предлагаемой вакцины против ИРТ КРС, изготовленной так, как описано в примере 3, и содержащей, мас.%:

Испытания препарата проведены в хозяйствах семи районов Кировской области в соответствии с Временным наставлением по применению предлагаемой вакцины. Было привито более 14000 голов молодняка КРС.

Результаты наблюдений за привитыми животными свидетельствуют о том, что предлагаемая вакцина не вызывает осложнений и индуцирует довольно хорошую устойчивость к заболеванию.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности условий:

- вакцина против ИРТ КРС сорбированная инактивированная, воплощающая предлагаемое изобретение, предназначена для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии;

- для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов;

- вакцина против ИРТ КРС сорбированная инактивированная, изготовленная из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой антигенной и иммуногенной активностью и является безвредной.

Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности "промышленная применимость".

Источники информации

1. Инфекционные болезни животных: Справочник. Под ред. Д.Ф.Осидзе. - М.: Агропромиздат. - 1987, 19-99.

2. Юров К.П. и Шуляк А.Ф. Герпесвирусы - возбудители массовых заболеваний крупного рогатого скота. Ветеринария, 1998, 11, 10-12.

3. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В. и Фомина Н.В. Вирусные болезни животных. - М., ВНИТИБП, 630-646.

4. Пат. Румынии №93947; А 61 К 39/12, 39/265; 30.05.88 г.

5. Авт. свид. СССР №980307, А 61 К 39/12, 1981 г. (прототип).