Результат интеллектуальной деятельности: ШТАММ "ВНИИЗЖ" КОРОНАВИРУСА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ, ВАКЦИННЫХ И ЛЕЧЕБНЫХ ПРЕПАРАТОВ

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при разработке и изготовлении средств диагностики, специфической профилактики и лечения коронавирусной инфекции крупного рогатого скота (КРС).

Коронавирусная инфекция КРС проявляется в виде коронавирусной диареи новорожденных телят и коронавирусной зимней дизентерии взрослого КРС.

Коронавирусная диарея новорожденных телят - остропротекающая контагиозная болезнь, характеризующаяся поражением желудочно-кишечного и респираторного трактов. Болезнь широко распространена во многих странах мира.

Зимняя дизентерия взрослого КРС - остропротекающая контагиозная болезнь, характеризующаяся угнетением организма, диареей и резким снижением молочной продуктивности.

Чрезвычайно широкое распространение, способность к длительной персистенции в организме животных-реконвалесцентов, относительная устойчивость возбудителя инфекции к воздействию разнообразных факторов вызывают энзоотическое течение болезни в хозяйствах с неблагополучными условиями содержания животных.

Известно, что коронавирусы КРС имеют тесную биологическую и антигенную связь с коронавирусами других видов животных и человека. В результате изучения антигенных взаимоотношений между коронавирусами человека и животных установлено, что, например, штамм ОС-43 коронавируса человека имеет антигенное родство с коронавирусом, вызывающим диарею новорожденных телят. Наличие общих антигенных детерминант установлено в РН, РСК и РТГА и подтверждено обнаружением сероконверсии у людей с коронавирусной инфекцией.

Хотя значение коронавирусов КРС как причины заболеваний человека в настоящее время точно не определено, однако потенциальная опасность этих вирусов для людей имеет важное эпидемиологическое значение, особенно в сельской местности.

В связи с этим важнейшими условиями успешной борьбы с этим заболеванием являются своевременная и правильная диагностика, проведение мер специфической профилактики и лечения, что в свою очередь предполагает получение в достаточном количестве активного вирусного антигена.

При этом важное значение придается потреблению телятами молозива с высоким содержанием специфических антител на протяжении не менее двух недель, так как только антитела, введенные телятам перорально, предохраняют их от заболевания. Это положение определяет стратегию разработки средств специфической профилактики. Специфическая защита новорожденных телят в первые дни жизни осуществляется путем активной иммунизации матерей с тем, чтобы стимулировать у них образование антител и обеспечить их передачу с молозивом. Для этого вакцинацию коров проводят во второй половине стельности.

Для специфической профилактики коронавирусной диареи новорожденных телят применяют живые и инактивированные вакцины, которыми прививают глубокостельных коров. Указанные вакцины готовят обычно из актуальных производственных штаммов возбудителя коронавирусной инфекции, антигенные свойства которых соответствуют антигенным свойствам эпизоотических штаммов возбудителя (1).

Известен штамм Mebus коронавируса КРС для изготовления вакцинных препаратов (2).

Известен штамм BCV-9 (CAPM V-280) коронавируса КРС для изготовления вакцинных препаратов (3, 4, 5).

Известен штамм ВГНКИ 8 (КП-83) коронавируса КРС для изготовления вакцинных препаратов (6).

Известен штамм 50-3 коронавируса КРС для изготовления вакцинных препаратов (7, 8).

Известны штаммы типов I, II и III коронавируса КРС для изготовления вакцинных препаратов (9).

Известен штамм "СМ-1" коронавируса КРС для изготовления вакцинных препаратов (10).

Известен штамм АТСС VR 874 коронавируса КРС для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (11).

Общим недостатком известных штаммов является низкая противоэпизоотическая эффективность изготовленных на их основе вакцинных препаратов, обусловленная недостаточной антигенной и иммуногенной активностью вследствие невысокого уровня накопления вируса в системе репродукции.

В связи с этим актуальной остается проблема поиска новых штаммов коронавируса КРС, пригодных для изготовления вакцинных и лечебных препаратов, а также средств диагностики.

В задачу создания настоящего изобретения входило получение нового производственного штамма коронавируса КРС, обладающего высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью. Эти свойства в значительной степени обеспечиваются подбором эффективной системы репродукции вируса и оптимизацией способа культивирования.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала производственных штаммов коронавирусов КРС, обладающих высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью, сохраняющих свои нативные иммунобиологические свойства после инактивации и пригодных для изготовления высокочувствительных и специфичных диагностикумов, высокоиммуногенных, безвредных и ареактогенных вакцинных и лечебных препаратов, способных защитить поголовье КРС от эпизоотического возбудителя коронавирусной инфекции, циркулирующего на территории России.

Указанный технический результат достигнут получением штамма "ВНИИЗЖ" (авторское наименование) коронавируса КРС. Штамм "ВНИИЗЖ" коронавируса КРС является новым, ранее не известным.

Исходный возбудитель для получения штамма "ВНИИЗЖ" выделен из фекалий новорожденного теленка с нарушением функции желудочно-кишечного тракта.

Производственный штамм "ВНИИЗЖ" коронавируса КРС получен путем адаптации к перевиваемой культуре клеток почек теленка MDVK.

Полученный штамм депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, ФГУ ВГНКИ МСХ РФ 12 марта 2001 года под регистрационным наименованием "ВНИИЗЖ-ДЕП".

Штамм "ВНИИЗЖ-ДЕП" коронавируса КРС обладает высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью и сохраняет свои нативные иммунобиологические свойства после инактивации.

Экспериментально подтверждена возможность его использования для изготовления средств диагностики, специфической профилактики и лечения коронавирусной инфекции КРС.

Штамм "ВНИИЗЖ-ДЕП" коронавируса КРС характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические свойства

Штамм "ВНИИЗЖ - ДЕП" коронавируса КРС относится к семейству Coronaviridae, роду Coronavirus и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя коронавирусной инфекции КРС: сферический или плеоморфный вирион диаметром 80-100 нм состоит из нуклеокапсида спиральной симметрии и липопротеидной оболочки, на поверхности которой имеются булавовидные выступы длиной 12-24 нм, образующие подобие солнечной короны. Плавучая плотность вирионов в сахарозе 1,15-1,18 г/см³.

В составе вирионов обнаружены три структурные белка: пепломерный гликопротеин Е2 (180-200 кД); нуклеокапсидный фосфопротеин N (50-60 кД) и матриксный гликопротеин Е1 (23-30 кД).

Антигенные свойства

Антиген коронавируса КРС штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" индуцирует в организме морских свинок и кроликов образование вирусспецифических антител, выявляемых в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) в титрах от 5 до 6 log₂, и от 6 до 7 log₂ соответственно.

В сыворотках крови глубокостельных коров через 26 дней после ревакцинации антитела к коронавирусу в РТГА выявляли в титрах от 5 до 8 log₂, а в молозиве - до 10 log₂. Своевременное скармливание такого молозива обеспечивает высокий уровень колостральных антител (до 8 log₂) в организме новорожденных телят.

Биотехнологическая характеристика

Штамм "ВНИИЗЖ-ДЕП" коронавируса КРС предназначен для изготовления инактивированных вакцин против коронавирусной инфекции КРС, диагностических антигенов и сывороток, а также препаратов антител, используемых для лечения больных телят.

Штамм "ВНИИЗЖ-ДЕП" коронавируса КРС проявляет высокую биологическую, антигенную и иммуногенную активность как в нативном виде, так и после инактивации.

Коронавирус штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" репродуцируется в перевиваемых культурах клеток почки теленка (MDVK, Таурус), коронарных сосудов теленка (КСТ) и в гетерологичной культуре клеток обезьян (Vero). При 37°С в течение 3-4 суток инкубирования вирус накапливается в количестве до 10⁸ частиц/см³ (данные электронно-микроскопического исследования).

Штамм "ВНИИЗЖ-ДЕП" коронавируса КРС обладает способностью в культуре клеток MDVK репродуцироваться с такой же степенью накопления при 34°С. Срок репродукции при этой температуре увеличивается почти на сутки, однако позволяет получать двойной урожай вируса путем смены поддерживающей среды. "Слив" обладает высокой биологической, иммуногенной и антигенной активностью.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм "ВНИИЗЖ-ДЕП" коронавируса КРС проявляет максимальную устойчивость в диапазоне рН от 6,0 до 7,2. Кислая (3,0) и щелочная (11,0) среды оказывают на вирус инактивирующее действие. Возбудитель устойчив к воздействию трипсина. Вирус разрушается жирорастворителями: хлороформом, метиленхлоридом, эфиром, твином и тритоном Х-100.

Инактивированный коронавирус штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" устойчив в процессе хранения при 4°С как в нативном состоянии, так и в составе инактивированных вакцин.

Дополнительные признаки и свойства

Антигенная активность - обладает антигенностью в составе инактивированной вакцины и препарата для гипериммунизации доноров диагностических и лечебных сывороток.

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Стабильность - сохраняет исходные биологические (антигенные) свойства при пассировании в культуре клеток MDVK в течение 30 пассажей (срок наблюдения).

Патогенность - выражена.

Вирулентность - выражена.

Контагиозность - выражена.

Онкогенность - отсутствует.

Свободен от контаминации бактериями, микоплазмами и другими гемагглютинирующими вирусами.

Исходя из полученных данных можно утверждать, что штамм "ВНИИЗЖ-ДЕП" по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным, в таксономическом отношении, новым ранее не известным штаммом.

Использование диагностических и вакцинных препаратов из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" обеспечивает высокую эффективность мер борьбы с коронавирусной инфекцией КРС.

По мнению заявителя предлагаемый штамм соответствует условиям патентоспособности "новизна" и "изобретательский уровень".

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования.

Пример 1

Получение штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" в культуре клеток MDVK

Штамм "ВНИИЗЖ" коронавируса КРС изолирован из пробы фекалий от новорожденного теленка с нарушением функции желудочно-кишечного тракта. При изоляции возбудителя был использован комплекс вирусологических методов, изложенных в "Руководстве по индикации возбудителей особо опасных болезней сельскохозяйственных животных в объектах ветнадзора", утвержденном ГУВ ГА ПК СССР 15 марта 1990 г.

С этой целью суспензию фекалий пропускали через фильтр ФПП-15-1,5. Сорбированный коронавирус элюировали раствором Хенкса. Объем элюата составлял 1/100-1/200 объема суспензии фекалий. В очищенный элюат добавляли антибиотики, выдерживали при 37°С 2-4 часа. К суспензии добавляли трипсин до концентрации 15-20 мкг/см³ и термостатировали при 37°С в течение 30 минут. Перед заражением культуру клеток MDVK дважды отмывали от ростовой сыворотки раствором Хенкса. После заражения в культуру клеток MDVK вносили поддерживающую питательную среду, содержащую трипсин в концентрации 10-15 мкг/см³. Сосуды инкубировали при 37°С до появления изменений в клетках. Полученную вируссодержащую суспензию замораживали-оттаивали и использовали для последующих пассажей. После 8 пассажей в культуре клеток MDVK штамм "ВНИИЗЖ-ДЕП" коронавируса КРС обладал следующими характеристиками: титр в реакции гемагглютинации с эритроцитами мыши 7-10 log₂, накопление вируса в культуре клеток 10^7,5-9 частиц/см³ (данные электронной микроскопии).

Пример 2

Изучение адаптационных свойств штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" коронавируса КРС

Применение трипсина в процессе культивирования штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" коронавируса КРС позволило значительно расширить круг чувствительных к нему перевиваемых культур клеток, в том числе и гетерологичных. Заражение культур клеток проводили вируссодержащей суспензией из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" коронавируса КРС 8 пассажа в культуре клеток MDVK. Результаты исследований приведены в таблице 1.

Пример 3

Получение и испытание диагностических антигенов и сывороток из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" коронавируса КРС

Для получения антигена исходную вируссодержащую суспензию трижды замораживали-оттаивали. Вируссодержащую жидкость осветляли низкоскоростным центрифугированием в течение 30 минут. Инактивацию вирусной суспензии проводили аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ) до конечной концентрации 0,1-0,15% при 37°С в течение 24 часов. Полученный препарат проверяли на активность и специфичность в РГА. Титры антигенов колебались от 6 до 11 log₂. Гипериммунизацию доноров проводили эмульсией, изготовленной смешиванием инактивированного антигена и минерального или синтетического масла с соответствующим эмульгатором.

Кроликам (масса 2,0-3,0 кг) эмульсию антигена водили три раза: в мякиши задних конечностей, в подколенные лимфоузлы и внутримышечно. Цикл иммунизации составлял 30-40 дней. В таблице 2 приведены результаты исследований полученных сывороток кроликов в РТГА с мышиными эритроцитами.

Данные таблицы 2 характеризуют высокую антигенную активность коронавируса КРС из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП", а полученные диагностические антигены и сыворотки позволяют диагностировать коронавирусную инфекцию КРС.

Пример 4

Изготовление вакцины

Для получения вакцины против коронавирусной инфекции КРС сорбированной инактивированной матровую расплодку вируса из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП", хранившуюся при -20°С, дважды оттаивали-замораживали. Перевиваемую культуру клеток MDVK с качественным монослоем перед заражением дважды отмывали от ростовой сыворотки раствором Хенкса, содержащим трипсин (15-20 мкг/см³). Множественность заражения составляла 0.1-1,0 ИЕ/клетку. После заражения культуральные сосуды инкубировали при 37°С в течение 1,5-2 часов, периодически покачивая. После контакта производили слив вируссодержащего материала и вносили поддерживающую среду, содержащую трипсин (10-15 мкг/см³). Сосуды инкубировали при 34°С или 37°С до появления ЦПД более чем в 90% клеток. После этого культуру дважды замораживали-оттаивали и охлажденную суспензию осветляли низкоскоростным центрифугированием. Инактивацию вирусной суспензии проводили АЭЭИ в концентрации 0,1-0,15% при 37°С в течение 24 часов. Инактивированный вирус проверяли на стерильность и авирулентность. В таблице 3 приведены данные по оптимальному компонентному составу сорбированной вакцины из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП". Полученный препарат контролируют на стерильность и антигенную активность.

В таблице 4 приведены результаты исследования в РТГА активности сывороток кроликов после введения инактивированной культуральной вакцины из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП". Данные таблицы 4 демонстрируют иммуногенную активность инактивированной вакцины, изготовленной из двойного урожая вируса, собранного при 34°С в культуре клеток MDVK.

В таблице 5 приведены результаты изучения активности сорбированной вакцины из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" на глубокостельных коровах. Доза введения составляет 3 см³.

Данные таблицы 5 свидетельствуют о том, что титр антител у коров после ревакцинации увеличился на 2 log₂. В результате этого у новорожденных телят титр колостральных антител составил почти 8 log₂, что вполне достаточно для защиты их от инфекции.

В таблице 6 приведены результаты изучения активности сывороток крови кроликов, привитых ассоциированной вакциной против рота- и коронавирусной инфекции КРС, одним из компонентов которой является антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" коронавируса КРС. Данные таблицы 6 свидетельствуют о том, что в составе ассоциированной вакцины как эмульсионной, так и сорбированной, антиген коронавируса из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" также индуцирует образование антител в высоких титрах.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности условий:

- штамм "ВНИИЗЖ-ДЕП" коронавируса КРС, воплощающий предлагаемое изобретение, предназначен для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии;

- для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в формуле изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов;

- штамм "ВНИИЗЖ-ДЕП", полученный в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой антигенной и иммуногенной активностью и пригоден для изготовления вакцинных, диагностических и лечебных препаратов против коронавирусной инфекции КРС.

Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности "промышленная применимость".

Источники информации

1. Сюрин В.Н. и соавт. Вирусные болезни животных. - М., ВНИТИБП, 1998, 162-165, 206-209.

2. Пат. США №3919413, 424-89, 11.11.75 г.

3. Авт. свид. ЧССР №249880; А 61 К 39/295, 39/108; 15.03.88 г.

4. Авт. свид. ЧССР №250849; А 61 К 39/295, 39/108; 15.03.88 г.

5. Авт. свид. ЧССР №250850; А 61 К 39/295, 39/108; 15.03.88 г.

6. Авт. свид. ЧССР №1748327; А 61 К 39/00, 39/215; С 12 N 7/00; 10.05.95 г.

7. Storz J. et al. Coronavirus isolation from nasal swap samples in cattle with signs of respiratory-tract disease after shipping. Journal of the American veterinary medical Association, 1966. V.208, N9, 1452-1455.

8. WO 98/40097; A 61 K 39/00, 39/215; C 12 N 7/02, 5/10; 17.09.98 г.

9. Пат. США №5916570, 424-222.1, 29.06.99 г.

10. Пат. РФ №2145236; A 61 К 39/295, 39/108, 39/215, 39/245, 39/12; С 12 N 7/00; 10.02.2000 г.

11. Пат. США №6514502, 424-221.1, 04.02.03 г.