Результат интеллектуальной деятельности: АЛЛЕЛЬ SNP41 ГЕНА PDE4D, ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ИНДИВИДУАЛЬНОЙ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К ИНСУЛЬТУ В РУССКОЙ ПОПУЛЯЦИИ, ПРИМЕНЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАРКЕРА ИНДИВИДУАЛЬНОЙ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К ИНСУЛЬТУ И СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ИНДИВИДУАЛЬНОЙ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К ИНСУЛЬТУ

Изобретение относится к биотехнологии и касается аллеля гена PDE4D, а именно SNP41.

Сосудистые заболевания головного мозга и, в частности, инсульт, - одна из наиболее важных и актуальных медицинских проблем нашего общества. Широкое распространение инсульта, высокий процент смертности и тяжелой инвалидизации определяют приоритетность исследований в области изучения патогенеза развития этого заболевания.

Инсульт - это острое нарушение мозгового кровообращения, приводящее к повреждению ткани головного мозга и расстройству его функций. Согласно международным эпидемиологическим исследованиям в мире от инсульта ежегодно умирают 4,7 миллионов человек. В нашей стране инсульт занимает второе место в структуре общей смертности, уступая лишь кардиоваскулярной патологии. Ежегодная смертность от инсульта в России - одна из самых высоких в мире (175 человек на 100 000 населения). 80% из выживших после инсульта больных становятся инвалидами, у 50% наступает повторный инсульт в последующие 5 лет жизни.

В настоящее время в изучении генетической предрасположенности инсульта, равно как и других мультифакторных заболеваний, используется анализ генетических ассоциаций, с помощью которого проводится изучение кандидатных генов, участвующих в формировании основных факторов риска сосудистой патологии. В последние несколько лет анализ генетических ассоциаций используется и для изучения аспектов индивидуальной чувствительности мозга к ишемическому повреждению и возможному прогнозированию течения и исхода заболевания.

Ген PDE4D кодирует фософодиэстеразу 4Д, которая относится к PDE4-семейству суперсемейства фосфодиэстераз и участвует в избирательном гидролизе цАМФ и цГМФ. Известно, что уменьшение уровня цАМФ приводит к усилению пролиферации и миграции сосудистых гладкомышечных клеток in vitro. Такие процессы, как известно, приводят к образованию фиброзной бляшки [Fukumoto S. и соавт., 1999; Houslay M.D. и соавт., 2003; Pan X. и соавт., 1994; Palmer D. и соавт., 1998].

Кроме того, на модельных животных было показано, что применение антагонистов PDE4 ингибирует пролиферацию данного типа клеток [Indolfi С. и соавт., 1997; Indolfi С. и соавт., 2000]. Ген PDE4D также экспрессируется в активированных макрофагах и, следовательно, PDE4D может принимать участие в процессе воспаления в атеросклеротической бляшке. Таким образом, фосфодиэстераза 4D может быть вовлечена или в процесс атерогенеза или нестабильности атеросклеротичекой бляшки, или в оба процесса [Lusis A.J. и соавт., 2000; Libby P., 2002; Naghavi М. и соавт., 2003].

Ген PDE4D размером 1600 тпн состоит из 22 экзонов и имеет, по крайней мере, 7 промоторов. В результате альтернативного сплайсинга или использования определенных промоторов этот ген может экспрессировать как минимум 8 функционально различных изоформ белка: 2 короткие формы (PDE4D1 и PDE4D2) и 6 длинных (PDE4D3,4,5,7,8 и 9) [Munshi A., Kaul S. Stroke genetics - focus on PDE4D gene // Int. J. Stroke. 2008. V.3. № 3. P.188-192]. Все изоформы имеют одинаковый С-концевой каталитический домен и отличаются по структуре N-концевого домена. Разные варианты PDE4D экспрессируются во многих типах клеток и тканей различных органов, включая мозг, легкие, почки, моноциты, В и Т лимфоциты и сосудистые гладкомышечные клетки [Szpirer С. и соавт., 1995; Bevan S. и соавт., 2004].

Ранее в уровне техники на линиях EBV-трансформированных В-лимфоцитов было показано, что у больных инсультом значительно понижен уровень тотальной мРНК PDE4D по сравнению с контрольной группой. Эта разница возникала вследствие более низкой экспрессии мРНК изоформ PDE4D1, PDE4D2 и PDE4D5 [Gretarsdottir S., Thorleifsson G., Reynisdottir S.T. et al. The gene encoding phosphodiesterase 4D confers risk of ischemic stroke // Nature Genetics. 2003. V.35. № 2. P.131-138]. Пока не выяснено, как пониженный уровень определенных изоформ фермента фосфодиэстеразы 4D участвует в патогенезе инсульта. По одной из гипотез снижение уровня экспрессии одной или нескольких изоформ фосфодиэстеразы 4D или изменение их баланса в результате нарушения регуляции экспрессии или сплайсинга увеличивает риск развития ишемического инсульта [Bersano A., Ballabio E., Bresolin N. et al. Genetic polymorphisms for the study of multifactorial stroke // Hum. Mutat. 2008. V.29. № 6. P.776-795}.

В гене PDE4D было обнаружено 260 однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП). Gretarsdottir S. et al. определили 3 гаплоблока A, B и C, охватывающих первые 3 экзона гена PDE4D и прилежащие к ним участки: гаплоблок A (экзоны D7-3 и D7-2, 300 тпн, содержит 19 ОНП с MAF>20%), гаплоблок B (первый экзон D7-1, 200 тпн, содержит 22 ОНП с MAF>20%) и гаплоблок С (примыкает к гаплоблоку B, 60 тнп, содержит 25 ОНП с MAF>20%) [Gretarsdottir S., Thorleifsson G., Reynisdottir S.T. et al. The gene encoding phosphodiesterase 4D confers risk of ischemic stroke // Nature Genetics. 2003. V.35. № 2. P.131-138].

Положительные ассоциации между ОНП в гене PDE4D и инсультом были показаны на некоторых выборках из различных неевропейских стран, таких как США (для SNP56, гаплоблок B), Пакистан (для SNP83, гаплоблок A), Япония (для SNP83) и Австралия (для SNP83, SNP87 и SNP89, гаплоблок A). Эти результаты не удалось воспроизвести в Европе, где только van Rijn et al. сообщили о положительной ассоциации в небольшой популяции в Нидерландах (для SNP39 и SNP45, гаплоблок В) [Gulcher J.R., Gretarsdottir S., Helgadottir A. et al. Genes contributing to risk for common forms of stroke // Trends Mol. Med. 2005. V.11. № 5. P.217-224]. Gretarsdottir S. и др. показали, что SNP41 (гаплоблок B) и SNP87 (гаплоблок А) ассоциированы с кардиоэмболическим и атеросклеротическим инсультом в исландской популяции [Gretarsdottir S., Thorleifsson G., Reynisdottir S.T. et al. The gene encoding phosphodiesterase 4D confers risk of ischemic stroke // Nature Genetics. 2003. V.35. № 2. Р.131-138]. Кроме того, не было найдено ассоциаций между ОНП, входящих в состав гаплоблока C, с риском развития инсульта. Таким образом, имеются противоречивые данные об ассоциации гена PDE4D с риском развития данного заболевания.

В связи с этим представляет интерес анализ полиморфизма гена PDE4D у больных инсультом в остром периоде.

Задачей изобретения является идентификация аллеля гена PDE4D, который отвечает за предрасположенность к инсульту, и его применение для диагностики повышенного риска возникновения инсульта.

Для решения поставленной задачи проводили анализ двух однонуклеотидных полиморфизмов - SNP41 (rsl52312) и SNP87 (rs2910829), которые относятся к разным гаплогруппам (гаплоблок А и гаплоблок В соответственно) у больных с острым инсультом (n=577, средний возраст 67±12,6) г. Москвы и в контрольной выборке (n=270, средний возраст 51,7±9,1), соответствующей ей по полу и этнической принадлежности. Подбор и клиническое обследование пациентов проводили на кафедре фундаментальной и клинической неврологии РГМУ на базе ГКБ № 31 г.Москвы. Взятие крови производилось на вторые или третьи сутки от момента наступления инсульта.

Возможно экстраполировать результаты, полученные на московской субпопуляции на всю русскую популяцию, так как московская субпопуляция не является изолированной, а напротив, содержит в себе представителей всех русских субполуляций.

Для молекулярно-генетического анализа были использованы препараты ДНК, полученные из 3 мл венозной крови. ДНК выделяли при помощи AxyPrep™ Blood Genomic DNA Midiprep kit ("Axygen Biosciences", США). Полиморфные аллели гена PDE4D были исследованы методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (технология TaqMan). ПЦР проводили на амплификаторе Мх3000р фирмы "Stratagene". Смесь для амплификации объемом 25 мкл содержала 2,5 мкл 10-кратного ПЦР буфера ("Синтол", Россия); 2,5 мкл 25 мМ MgCl₂, 2,5 мкл 2,5 мМ раствора dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP); 10 пМ каждого праймера; 4 пМ каждого зонда; 1,25 ед. HotTaq-полимеразы ("Синтол", Россия); 0,1-0,2 мкг геномной ДНК и деионизированной воды до 25 мкл. Процесс амплификации проводился при следующих температурных условиях: 3 мин деконтаминация при 50°C, 10 мин денатурация при 95°C, а затем 40 циклов в режиме: 95°C - 15 сек, 58°C (для SNP87) или 56°C (для SNP41) - 50 сек. Последовательности праймеров и зондов приведены в [Hsieh M.-S., Yu S.-C., Chung W.-T. et al. Phosphodiesterase 4D (PDE4D) gene variants and risk of ischemic stroke in the Taiwanese population // Lab. Medicine. 2009. V.40. №2. P.87-90].

Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием программы GraphPad InStat (США) (http://www. graphpad. corn/), с помощью которой проверяли соответствие наблюдаемого распределения частот генотипов формуле Харди-Вайнберга и величину относительного риска (ОР). Достоверность различий частот аллелей и генотипов полиморфных локусов в сравниваемых группах определяли с помощью критерия χ². Сравнение частот генотипов проводили с использованием таблиц сопряжения 2×3, а частот аллелей и объединенных генотипов - с использованием таблиц сопряжения 2×2. Достоверным считали уровень значимости p<0,05.

Результаты генотипирования полиморфизмов SNP87 (С→Т) и SNP41 (G→A) представлены в табл.1. Распределение частот генотипов и аллелей в контрольной группе по обоим ОНП соответствует закону Харди-Вайнберга (χ²=0,73, 0,00; p=0,69, 1,00 соответственно).

Из табл.1 видно, что нет статистически достоверных различий между распределением частот генотипов и аллелей по полиморфизму SNP87 между исследуемыми группами. Частоты генотипа СС в группе больных острым инсультом и в контрольной выборке составляют 19,9% и 18,9% соответственно, генотипа СТ - 53,6% и 53,3% соответственно, генотипа ТТ - 26,5% и 28,1% соответственно. Так, частота минорного аллеля С составляет 46,7% и 45,4% в группе больных острым инсультом и контрольной выборке соответственно.

Частоты генотипа GG по полиморфизму SNP41 составляют 77,8% и 85,2% в группе больных с острым инсультом и контрольной выборке соответственно (p=0,04), т.е. в контрольной выборке частота генотипа GG на 7,4% выше, чем в группе больных с острым инсультом. В выборке больных с острым инсультом в 2,3 раза повышена частота генотипа АА. Частота аллеля G также выше в контрольной группе на 4,1% (p=0,014). В выборке больных с острым инсультом носители аллеля А (лица с генотипами GA и АА) встречаются с частотой 22,2%, тогда как в контрольной группе с частотой 14,8% (p=0,02).

Основываясь на полученных данных, можно утверждать, что аллель А SNP41 и генотипы, его содержащие, ассоциированы с повышенным риском развития острого инсульта в московской субпопуляции. Относительный риск развития инсульта у лиц с генотипами АА и GA повышен в 1,6 раза (OR=1,639; 95% ДИ от 1,1 до 2,4). Таким образом, полиморфизм SNP41 в гене PDE4D, обусловленный заменой G→A, ассоциирован с риском развития острого инсульта в русской популяции.

SNP41 расположен в некодирующей области гена PDE4D, фланкирующей экзон D7-1. Возможно, что не сам SNP41 вносит вклад в увеличение риска развития инсульта, а находится в неравновесии по сцеплению с аллелем риска, и значения неравновесия по сцеплению этих локусов могут различаться между популяциями.

Таким образом, представленные примеры достоверно демонстрируют возможность использования молекулярно-генетической диагностики по полиморфному варианту SNP41 гена PDE4D в качестве молекулярно-генетического маркера индивидуальной предрасположенности к инсульту в русской популяции с целью выявления группы риска и соответственно возможности использовать указанный ген в способе прогнозирования предрасположенности к инсульту.