ПРОДУЦЕНТ ЭКЗОПОЛИСАХАРИДА

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается новой культуры микроорганизмов, продуцирующих высоковязкий экзополисахарид (ЭПС), который может быть использован, в частности, в нефтедобывающей промышленности.

Известен штамм Acinetobacter sp.ВКПМ-3243, являющийся продуцентом полисахарида [1], но с использованием дефицитного сырья, такого как дикарбоновые кислоты.

Известна возможность получения экзополисахарида путем культивирования штамма Bacillus polymyxa ВКПМ-3015 [2]. Экзополисахарид, полученный с его помощью, имеет низкие гелеобразующие свойства.

Известен штамм Pseudomonas putida ИБ 17, продуцирующий экзополисахариды [3]. Недостатком известного штамма, принятого за прототип, является низкий выход экзополисахарида.

Технической задачей предлагаемого изобретения является расширение ассортимента экзополисахаридов.

Поставленная задача решается применением в качестве продуцента экзополисахарида штамма бактерий Paenibacillus ehimensis IB 739.

Указанный штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов под номером №В-2680Д и первоначально был описан [4] как штамм бактерий для получения препарата против грибковых заболеваний злаковых культур, штамм выделен из почвенного образца серой лесной среднегумусной почвы, отобранной в Бакалинском районе.

Культурно-морфологические признаки штамма. Клетки палочковидные, 0,5-0,8×2,0-4,0 мкм, подвижные, грамположительные. Споры эллиптические, расположены субтерминально, также обнаружено, что споры могут быть расположены терминально, спорангий раздувают.

На мясопептонном агаре (МПА) через сутки инкубации при 36-37°С образуют слизистые, выпуклые, непрозрачные колонии кремового цвета диаметром 2-3 мм. Через 5 суток колонии принимают складчатую форму с высоким бортиком по краю и достигают в диаметре 4-6 мм. Часть колоний (примерно 10%) остается гладкой, не увеличиваясь в размерах. На картофельном агаре (КА) через сутки инкубации при 36-37°С образуют мелкие слизистые, выпуклые и непрозрачные колонии диаметром 1-2 мм. На третьи сутки колонии трансформируются в складчатые, незначительно увеличиваясь в диаметре (до 3-4 мм).

На агаризованной среде, содержащей 1,0% крахмала; 0,1 - К₂НРО₄; 0,2% (NH₄)₂HPO₄; 0,3% полипептона; 0,3% дрожжевого автолизата; 0,3% кукурузного экстракта и 1,2% агар-агара в водопроводной воде, через сутки инкубации при 37°С образуются слизистые, поднимающиеся над агаром колонии диаметром 2-3 мм. На третьи сутки часть колоний покрывается глубокими морщинами, а часть остается гладкой. Через 7-10 суток морщинистость исчезает, колонии становятся уплощенными и приобретают темно-коричневую окраску. На жидкой картофельно-глюкозной среде образуется слизистый осадок. Аэроб. Хорошо растет в интервале температур 30-45°С. Усваивают глюкозу, сахарозу, арабинозу, маннит, глицерин, этанол. При сбраживании сахаров газ не образует. Гидролизует крахмал. В качестве источника азота усваивает как органические формы (пептоны, автолизаты, экстракты), так и минеральные (соли аммония, нитраты). На безазотистой среде Эшби рост слабый. При применении в качестве единственного источника азота KNO₃ или NaNO₃ в жидкой культуре выделяет большое количество полисахаридов, вплоть до гелеобразного состояния. На средах с крахмалом образует кристаллы циклодекстринов. Реакция Фогес-Проскауэра (образование ацетилметилкарбинола) положительная. Индол не образует. Растет при рН 5,0-8,5. Методом анализа нуклеотидной последовательности 16S РНК штамм идентифицирован как Paenibacillus ehimensis [5]

При ферментации указанного штамма бактерий на питательной среде Федорова [6], не содержащей минеральных источников азота, с добавлением мелассы наблюдается образование экзополисахаридов.

Состав питательной среды Федорова, г/л: K₂HPO₄ - 0,3; СаНРО₄ - 0,2; MgSO₄ - 0,3; K₂SO₄ - 0,2; NaCl - 0,5; FeCl₃ - 0,01; СаСО₃ - 5,0; меласса - 30; смесь микроэлементов - 1 мл; вода водопроводная до 1 л.

Состав экзополисахарида определен методами ИК-, ¹Н, ¹³С - ЯМР-спектроскопии. Выделенный экзополисахарид представляет собой альгинат, содержащий в своем составе фрагменты β-D-маннуроновой (М) и α-L-гулуроновой (G) кислот, находящиеся в пиранозной форме и связанные в линейные цепи 1→4 гликозидными связями соотношение M/G - 0,64. Молекулярная масса, определенная при помощи эксклюзионной ВЭЖХ, составляет 320 кДа. Полученный полисахарид нерастворим в холодной воде, хорошо растворим в горячей воде (при температуре от 60°С и выше).

Изобретение характеризуется следующими примерами.

Пример 1. Штамм Paenibacillus ehimensis IB 739 продуцирует значительное количество экзополисахарида (25 г/л) при выращивании в течение 72 ч в ферментере объемом 10 литров при коэффициенте заполнения 0,7 на среде Федорова с добавлением мелассы в качестве источника углерода. При температуре процесса, составляющей 35°С, числе оборотов перемешивающего устройства 350 мин^-1, расходе воздуха 100 л/час образовывалась высоковязкая культуральная жидкость с кинематической вязкостью 30000 сСт. Далее экзополисахарид извлекают из культуральной жидкости осаждением изопропиловым спиртом в объемном соотношении 1:1. Далее определялют кинематическую вязкость 0,1% и 0,25% водных растворов ЭПС при помощи стеклянного капиллярного вискозиметра Оствальда при 20°С.

Для 0,1% и 0,25% водных растворов ЭПС штамма Paenibacillus ehimensis IB 739 кинематическая вязкость составила 1,90 сСт и 5,45 сСт соответственно. Для 0,1% и 0,25% растворов ЭПС штамма по прототипу кинематическая вязкость составила 1,15 сСт и 1,40 сСт соответственно. Таким образом, заявляемый штамм продуцирует экзополисахарид, который превосходит по реологическим характеристикам экзополисахарид по прототипу.

Пример 2. При использовании высоковязких экзополисахаридов в нефтедобывающей промышленности важной технологической характеристикой является их растворимость в высокоминерализованных нефтепромысловых пластовых водах. При этом расслоение геля при смешении с пластовой водой или образование осадка недопустимо с точки зрения повышения эффективности процесса добычи нефти при закачке экзополисахаридов в продуктивные пласты. Изучали растворимость культуральной жидкости предлагаемого штамма бактерий Paenibacillus ehimensis IB 739, полученной по примеру 1, и культуральной жидкости штамма по прототипу в нефтепромысловых пластовых водах. Для этого смешивали 0,1%-ный раствор культуральной жидкости предлагаемого штамма и штамма по прототипу в водопроводной воде с нефтепромысловой пластовой водой, имеющей степень минерализации 140 г/дм³ в различных соотношениях по объему - от 1:1 до 1:15. Результаты экспериментов, приведенные в табл.1, свидетельствуют о хорошей растворимости культуральной жидкости, полученной при ферментации предлагаемого штамма бактерий, в высокоминерализованных пластовых водах, не уступающей растворимости штамма по прототипу. Во всех вариантах эксперимента при смешении культуральной жидкости штамма Paenibacillus ehimensis IB 739, содержащей экзополисахарид, с пластовой водой мы получили однородный гель, который не проявлял тенденции к расслоению.

Таким образом, предлагаемый штамм Paenibacillus ehimensis IB 739 обладает высокой продуктивностью при секреции высоковязкого экзополисахарида в среду. Гель, полученный при этом, обладает хорошей растворимостью в минерализованных пластовых водах.

Список литературы

1. Авторское свидетельство СССР №1579049, кл. С12Р 19/04, 1990.

2. Авторское свидетельство СССР №1698293, кл. С12Р 19/04, 1991.

3. Патент РФ №2343193, кл. С12N 1/20, 2009.

4. Авторское свидетельство СССР №1743019, кл. С12N 1/20,1994.

5. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/FN582329.1?report=girevhist

6. Рубенчик Л.И. Азотобактер и его применение в сельском хозяйстве. - Киев: АН УССР, 1960. - 328 с.