Результат интеллектуальной деятельности: ПРОДУЦЕНТ ЭКЗОПОЛИСАХАРИДА

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается новой культуры микроорганизмов, продуцирующих высоковязкий экзополисахарид (ЭПС), который может быть использован, в частности, в нефтедобывающей промышленности.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается новой культуры микроорганизмов, продуцирующих высоковязкий полисахарид (ЭПС), который может быть использован, в частности, в нефтедобывающей промышленности.

Известен штамм Acinetobacter sp. ВКПМ-3243, являющийся продуцентом полисахарида [1], но с использованием дефицитного сырья, такого как дикарбоновые кислоты.

Известна возможность получения экзополисахарида путем культивирования штамма Bacillus polymyxa ВКПМ-3015 [2]. Экзополисахарид, полученный с его помощью, имеет низкие гелеобразующие свойства.

Известен штамм Paenibacillus ehimensis IB 739, продуцирующий экзополисахариды [3]. Недостатком известного штамма, принятого за прототип, является низкий выход экзополисахарида и высокая продолжительность культивирования.

Технической задачей предлагаемого изобретения является расширение ассортимента экзополисахаридов.

Поставленная задача решается применением в качестве продуцента экзополисахарида штамма бактерий Paenibacillus sp. ИБ-1, выделенного из образца пахотной почвы Республики Башкортостан. Штамм депонирован во Всероссийскую коллекцию микроорганизмов с регистрационным номером ВКМ В - 2823D.

1. Культурально-морфологические признаки.

1.1. На агаризованной питательной среде, имеющей состав, г/л: KH₂PO₄ - 0,3; CaHPO₄ - 0,2; MgSO₄ - 0,3; K₂SO₄ - 0,2; NaCl - 0,5; FeCl₃ - 0,01; CaCO₃ - 5,0; сахароза - 20 г; агар - 1,5%; смесь микроэлементов - 1 мл; дистиллированная вода до 1000 мл, pH 6,8-7,2 культура образует круглые колонии диаметром 3-4 мм, с гладкой блестящей поверхностью, выпуклые, прозрачные, с гладкими краями, мягкой тягучей консистенции. На 24 часу роста клетки - мелкие палочки 0,5×1,5 мкм, подвижные.

1.2. На питательной агаризованной среде Берка, имеющей состав, г/л: K₂HPO₄ - 0,8; KH₂PO₄ - 0,2; MgSO₄ - 0,3; NaCl - 0,2; CaSO₄ - 0,1; Fe₂(MoO₄) - 0,01; глюкоза - 10 г; дистиллированная вода до 1000 мл; агар-агар - 1,5%; pH 6,8-7,0, культура образует круглые колонии диаметром 2-3 мм, с гладкой блестящей поверхностью, выпуклые, прозрачные, бесцветные, с гладкими ровными краями, однородной структуры.

1.3. На жидкой питательной среде Федорова с мелассой, имеющей состав, г/л: K₂HPO₄ - 0,3; CaHPO₄ - 0,2; MgSO₄ - 0,3; K₂SO₄ - 0,2; NaCl - 0,5; FeCl₃ - 0,01; CaCO₃ - 5,0; меласса - 40 г; смесь микроэлементов - 1 мл; pH 6,8-7,0, выращивание при температуре 28°C и режиме аэрации-перемешивания 180 об/мин в течение 36 часов. Круглые колонии диаметром 0,5 см, выпуклые с ровными краями, слизистой консистенции.

1.4. На питательной среде КГА колонии круглые диаметром 6 мм, выпуклые, белого полупрозрачного цвета, консистенция тягучая мягкая. Пигмента не образуют. На 24 часу роста - мелкие подвижные палочки.

1.5. На питательной среде Эшби с маннитом в качестве источника углерода колонии слизистые прозрачные диаметром 3 мм, консистенция тянущаяся. На 24-36 часу роста клетки - длинные тонкие палочки 6 мкм, подвижные.

2. Физиолого-биохимические признаки.

Штамм является аэробным микроорганизмом, оптимальная температура роста 28°C.

Отношение к источникам углерода: очень хорошо усваивает глюкозу, сахарозу; хорошо усваивает маннит, мальтозу, ксилозу, сорбит, рамнозу, лактозу, декстрин, галактозу, маннозу, глицерин, фруктозу, этанол; слабо усваивает арабинозу, мезоинозитол.

Отношение к источникам азота: растет на безазотистых средах, сохраняя высокую продуктивность не менее 8·10¹⁰ кл/мл.

Штамм не обладает фитопатогенной активностью, о чем свидетельствует отсутствие мацерации на ломтиках картофеля при нанесении на них уколом живых клеток штамма.

Штамм хранится на косяках со средой Федорова в холодильнике с пересевом на свежие косяки через 2-4 месяца, а также в лиофильновысушенном состоянии.

Штамм идентифицирован по определителю Bergey Manual of Determinative Bacteriology.

Процесс секреции экзополисахаридов в культуральную жидкость осуществляется при ферментации указанного штамма бактерий на питательной среде Федорова с мелассой.

Посредством гель-фильтрации показано, что продуцируемый штаммом полисахарид выходит из колонки одним асимметричным пиком, значение молекулярной массы которого составляет 300 кДа. В ИК-спектре полисахарида присутствуют сигналы, характерные для полос поглощения ацетильных групп 1730, 1250 см^-1, полосы поглощения валентных колебаний пиранозного кольца гулуроновой кислоты 1290 и 787 см^-1 и полосы поглощения валентных колебаний пиранозного кольца маннуроновой кислоты 1320 и 808 см^-1. Спектры ЯМР ¹H и ¹³C полисахарида типичны для спектров альгинатов. Таким образом, выделенный полисахарид построен из 1-4-связанных остатков β-D-маннуроновой и α-L-гулуроновой кислот (соотношение M/G составляет, в частности, 0,25) и является альгинатом кальция. Полученный полисахарид не растворим в холодной воде, хорошо растворим в горячей воде (при температуре от 60°C).

Изобретение характеризуется следующими примерами.

Пример 1. Штамм Paenibacillus sp. ИБ-1 продуцирует значительное количество экзополисахарида (27,5 г/л) при выращивании в течение 48 ч в ферментере объемом 10 литров при коэффициенте заполнения 0,7 на среде Федорова с добавлением мелассы в качестве источника углерода. При температуре процесса, составляющей 25°C, числе оборотов перемешивающего устройства 350 мин^-1, расходе воздуха 100 л/час образовывалась высоковязкая культуральная жидкость с кинематической вязкостью 30000 сСт. Далее экзополисахарид извлекают из культуральной жидкости осаждением изопропиловым спиртом в объемном соотношении 1:1.

Пример 2. При использовании высоковязких экзополисахаридов в нефтедобывающей промышленности важной технологической характеристикой является их растворимость в высокоминерализованных нефтепромысловых пластовых водах. При этом расслоение геля при смешении с пластовой водой или образование осадка недопустимо с точки зрения повышения эффективности процесса добычи нефти при закачке экзополисахаридов в продуктивные пласты. Изучали растворимость культуральной жидкости предлагаемого штамма бактерий Paenibacillus sp. ИБ-1, полученной по примеру 1, и культуральной жидкости штамма по прототипу в нефтепромысловых пластовых водах. Для этого смешивали 0,1%-ный раствор культуральной жидкости предлагаемого штамма и штамма по прототипу в водопроводной воде с нефтепромысловой пластовой водой, имеющей степень минерализации 140 г/дм³ в различных соотношениях по объему - от 1:1 до 1:15. Результаты экспериментов, приведенные в табл.1, свидетельствуют о хорошей растворимости культуральной жидкости, полученной при ферментации предлагаемого штамма бактерий, в высокоминерализованных пластовых водах, не уступающей растворимости штамма по прототипу. Во всех вариантах эксперимента при смешении культуральной жидкости штамма Paenibacillus sp. ИБ-1, содержащей экзополисахарид, с пластовой водой мы получили однородный гель, который не проявлял тенденции к расслоению.

Таким образом, предлагаемый штамм Paenibacillus sp. ИБ-1 обладает высокой продуктивностью и невысокой продолжительностью культивирования при секреции высоковязкого экзополисахарида в среду. Гель, полученный при этом, обладает хорошей растворимостью в минерализованных пластовых водах.

Список литературы

1. Авторское свидетельство СССР №1579049, кл. C12P 19/04, 1990.

2. Авторское свидетельство СССР №1698293, кл. C12P 19/04, 1991.

3. Патент РФ №2460780, кл. C12N 1/20, 2012.