Результат интеллектуальной деятельности: ШТАММ БАКТЕРИЙ Pseudomonas plecoglossicida, ОСУЩЕСТВЛЯЮЩИЙ БИОДЕГРАДАЦИЮ ПЕРФТОРОКТАНСУЛЬФОНОВОЙ КИСЛОТЫ

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно биоочистки окружающей среды от загрязнения перфтороктансульфоновой кислотой (ПФОС) с помощью бактерий, и касается нового штамма, способного эффективно разлагать устойчивое токсичное соединение - ПФОС. Данное вещество внесено в Приложение В Стокгольмской конвенции по стойким органическим загрязняющим (СОЗ) веществам, что предусматривает принятие мер по минимизации и, по возможности, прекращению производства и использования с последующим уничтожением [1]. ПФОС будучи крайне устойчивой к разложению, к настоящему времени обнаруживается во многих объектах окружающей среды и живых организмах, являясь наиболее часто детектируемым загрязнителем [2, 3].

Известны способы разложения ПФОС - химическая переработка, сжигание при высокой температуре [4, 5], но они являются высокозатратными.

Наиболее экологически безопасно применение способа утилизации ПФОС, основанного на ее включении в естественный обмен веществ и энергии с участием микроорганизмов, способных к ее разложению, минимизируя отрицательное влияние на окружающую среду.

Известно лишь единичное количество штаммов бактерий, способных к трансформации перфторкарбоновых кислот.

Известен штамм Pseudomonas parafulva YAB1, обладающий способностью к биодеградации перфтороктановой кислоты [6].

Недостатком данного штамма является то, что он медленно и недостаточно полно утилизирует субстрат. Штамм Pseudomonas parafulva YAB1 утилизирует 32,2% перфтороктановой кислоты при ее начальной концентрации 500 мг/л.

Наиболее близким к предлагаемому штамму - прототипом является штамм бактерий Pseudomonas aeruginosa HJ4, способный к биологической деградации ПФОС [7].

Недостатком прототипа [7] является то, что штамм бактерий Pseudomonas aeruginosa HJ4 способен разрушать ПФОС при концентрации, не превышающей 2 мг/л. Это ограничивает возможность его использования для биоочистки в промышленных масштабах. А также штамм не способен к глубокой деградации ПФОС, уровень разложения которой не превышает 67%.

Целью изобретения является получение нового штамма микроорганизма, способного осуществлять эффективную биодеградацию ПФОС, расширение области применения биотехнологий для защиты окружающей среды.

Цели достигают применением штамма бактерий Pseudomonas plecoglossicida 2,4-D.

Штамм бактерий Pseudomonas plecoglossicida 2,4-D выделен из образца загрязненной отходами нефтехимического производства почвы с территории бывшего промышленного предприятия ОАО «Химпром» (г. Уфа, Республика Башкортостан, РФ) и хранится в Коллекции микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Уфимский Институт биологии Российской академии наук.

Полученный штамм микроорганизмов депонирован во Всероссийскую коллекцию микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук под регистрационным номером ВКМ B-3164D и характеризуется следующими признаками.

Характеристика штамма Pseudomonas plecoglossicida 2,4-D (ВКМ B-3164D):

Грамотрицательные подвижные палочки диаметром 1 мкм, длиной 2.5-3.0 мкм. При выращивании на МПА образует колонии бело-кремового цвета, круглые, выпуклые диаметром 4-5 мм. Метаболизм - дыхательный, штамм каталазоположителен, синтезирует оксидазу, не обладает способностью к денитрификации, не гидролизует казеин, желатин, лецитин и крахмал, не синтезирует липолитические ферменты: не способен к росту на среде с твин-80, тест на аргининдигидролазу - положителен. Оптимальная температура для роста находится в интервале 26-30°С, оптимальная величина рН 6.8-7.2. При концентрации NaCl 0-5% наблюдается интенсивный рост, при более высокой концентрации до 10% NaCl наблюдается слабый рост. Не использует в качестве единственного источника углерода: глюкозу, сахарозу, маннит, фруктозу, сорбит, инозит, мальтозу, арабинозу, ксилозу, маннозу, галактозу, лактозу, рамнозу, мезо-инозитол, крахмал, леван, калий виннокислый. В качестве источника углерода использует сукцинат, малат, цитрат, 2-кетоглюконат, этанол, н-бутанол, пропиленгликоль, L-лейцин, L-лизин, L-валин, L-аланин, L-аргинин, L-аспартат, L-гистидин. Клетки штамма синтезируют флуоресцентный пигмент. Не патогенен.

По нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК наиболее близок к штамму Pseudomonas plecoglossicida NBRC 103162 (уровень сходства 99.86%).

Предлагаемое изобретение поясняется следующими примерами применения штамма Pseudomonas plecoglossicida 2,4-D (ВКМ B-3164D) для биодеградации ПФОС, устойчивой к разрушению биологическими способами.

Пример 1. Бактерии штамма Pseudomonas plecoglossicida 2,4-D после ферментации на питательной среде Раймонда следующего состава, г/л: Na₂CO₃ - 0.1; MgSO₄ × 7 H₂O - 0.2; FeSO₄ × 7 H₂O - 0.02; CaCl₂ - 0.01; MnSO₄ × 7 H₂O - 0.02; K₂HPO₄ × 3 H₂O - 1.0; NaH₂PO₄ × 3 H₂O - 1.5; NH₄Cl - 3.0; вода дистиллированная - 1000 мл, содержащей в качестве единственного источника углерода ПФОС (1000 мг/л) оставались жизнеспособными, титр микроорганизмов составлял 5,5⋅10⁸ клеток/мл. Штамм по прототипу не способен к росту при такой концентрации ПФОС в среде.

Пример 2. Бактерии штамма Pseudomonas plecoglossicida 2,4-D культивировали на питательной среде Раймонда следующего состава, г/л: Na₂CO₃ - 0.1; MgSO₄ × 7 H₂O - 0.2; FeSO₄ × 7 H₂O - 0.02; CaCl₂ - 0.01; MnSO₄ × 7 H₂O - 0.02; K₂HPO₄ × 3 H₂O - 1.0; NaH₂PO₄ × 3 H₂O - 1.5; NH₄Cl - 3.0; вода дистиллированная - 1000 мл, содержащей в качестве единственного источника углерода ПФОС (1000 мг/л). Культивирование проводили при температуре 28°С в термостатируемой установке при 160 об/мин. Интенсивность роста культуры оценивали спектрофотометрически по оптической плотности клеточной суспензии при длине волны 590 нм (ОП₅₉₀).

Для выделения и идентификации продуктов биотрансформации ПФОС и оценки ее концентрации в среде бактериальные клетки отделяли от культуральной жидкости методом ультрафильтрации на установке "Vivaflow 50" ("Sartorius AG", Германия). Полученный ультрафильтрат (≤3 кДа) анализировали хромато-масс-спектрометрическим методом на жидкостном тандемном хромато-масс-спектрометре LCMS-IT-TOF ("Shimadzu", Япония) с системой ввода образца электроспрей, квадрупольной ионной ловушкой и времяпролетным детектором. Масс-спектры регистрировали в интервале масс m/z 200-800 а.е.м. в режиме регистрации отрицательных ионов, напряжение на детекторе составляло 3.5 кВ. Для хроматографического разделения использовали колонку Shim-pak XR-ODS (75×2.0 мм) ("Shimadzu", Япония) в изократическом режиме при соотношении растворителей 5 мМ ацетат аммония в воде : ацетонитрил - 56:44 со скоростью элюирования 0.2 мл/мин. Установление структуры полученных соединений проводили по совокупности данных анализа масс-спектров, основанных на распаде молекулярного иона и сравнении с данными литературы.

Концентрацию фторид-иона в среде измеряли при помощи фторид-селективного электрода с кристаллической мембраной ЭЛИС-131F (ООО "Измерительная техника", Россия).

Заявляемый штамм бактерий Pseudomonas plecoglossicida 2,4-D способен к использованию ПФОС в качестве единственного источника углерода и энергии с полной ее утилизацией при начальной концентрации 1000 мг/л за 6 сут. Штамм бактерий Pseudomonas plecoglossicida 2,4-D трансформирует ПФОС в перфторгептановую (перфторэнантовую) кислоту, высвобождая в среду свободные ионы фтора ( см. рисунок).

Предлагаемое изобретение удовлетворяет критериям новизны, так как среди известных микроорганизмов не обнаружен штамм, которому присущи признаки, идентичные всем признакам, перечисленным в формуле изобретения, включая характеристику назначения.

Заявляемый штамм имеет изобретательский уровень, поскольку не выявлены микроорганизмы, характеризующиеся одинаковой способностью осуществлять биодеградацию перфторорганических ксенобиотиков (на примере ПФОС).

Таким образом, штамм бактерий Pseudomonas plecoglossicida 2,4-D способен к полной биодеградации ПФОС в концентрации 1000 мг/л, является более активным деструктором, чем штамм-прототип, и может служить основой для получения биопрепаратов при разработке биотехнологий трансформации (утилизации) фторорганических соединений для защиты окружающей среды.

Список литературы

1. Report of the Conference of the Parties of the Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants on the work of its fourth meeting, 4-8 May // UNEP/POPS/COP.4/38. Geneva: Stockholm Convention Secretariat, 2009. P. 66-69.

2. Betts K. PFOS and PFOA in humans: new study links prenatal exposure to lower birth weight // Environmental Health Perspectives. - 2007. V. 115. - P. 550.

3. Yamashita N., Kannan K., Taniyasu S., Horii Yu., Petrick G., Gamo Т. A global survey of perfluorinated acids in oceans // Marine Pollution Bulletin. - 2005. V. 51. - P. 658-668.

4. Cheng J., Vecitis CD., Park H, Mader B.T., Hoffmann M.R. Sonochemical degradation of perfluorooctane sulfonate (PFOS) and perfluorooctanoate (PFOA) in landfill groundwater: environmental matrix effects // Environ. Sci. Technol. - 2008. V. 42. - P. 8057-8063.

5. Wang F., Shih K., Lu X., Liu C. Mineralization behavior of fluorine inperfluorooctanesulfonate (PFOS) during thermal treatment of lime-conditioned sludge // Environ. Sci. Technol. - 2013. V. 47. - P. 2621-2627.

6. Yi L.B., Chai L.Y., Xie Y., Peng Q.J., Peng Q.Z. Isolation, identification, and degradation performance of a PFOA-degrading strain // Genet. Mol. Res. 2016. V. 15. №2: gmr. 15028043.

7. Kwon B.G., Lim H.J., Na S.H., Choi B.I., Shin D.S., Chung S.Y. Biodegradation of perfluorooctanesulfonate (PFOS) as an emerging contaminant // Chemosphere. 2014. V. 109. P. 221-225.