ГЕМОСТАТИЧЕСКОЕ ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО НА ОСНОВЕ СИНТЕТИЧЕСКОГО ТРИПЕПТИДНОГО ИНГИБИТОРА ПЛАЗМИНА

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, а именно к созданию лекарственного средства, обладающего гемостатическим действием, содержащего трипептидный ингибитор плазмина и предназначенного для остановки кровотечений, в том числе кровотечений из паренхиматозных органов при травмах и хирургических операциях. Использование разработанных фармацевтических средств позволяет существенно снизить объем кровопотери и уменьшить время остановки кровотечений.

Обеспечение эффективного гемостаза в хирургической, травматологической, отоларингологической, стоматологической и акушерско-гинекологической практике является важной проблемой современной медицины. Применение традиционных методов гемостаза (механический, термический гемостаз) могут приводить не только к отсутствию эффекта, но и к развитию серьезных осложнений, связанных с дополнительной травматизацией органов и тканей. Поэтому все более широкое распространение получают щадящие способы осуществления гемостаза с использованием препаратов как биологического происхождения (естественных компонентов крови человека и различных биополимеров), так и синтетических препаратов, способствующих остановке кровотечений и имеющих различные механизмы действия.

Гемостаз представляет собой комплекс реакций организма, направленных на остановку кровотечения. Различают сосудисто-тромбоцитарный гемостаз, играющий ведущую роль при травмах капилляров и мелких сосудов (до 100 мкм), и плазменный, обеспечивающий прекращение кровотечений в случае повреждений более крупных сосудов (В.М. Покровский, 2003). Плазменный гемостаз - это ферментный каскад, в котором проферменты, переходя в активное состояние, приобретают способность активировать другие факторы свертывания крови. Результатом является образование фибринового сгустка и его ретракция, которая обеспечивает уплотнение и закрепление тромба в поврежденном сосуде. Одновременно с ретракцией, но с меньшей скоростью, начинается процесс фибринолиза - разрушение сформировавшихся тромбов сериновой протеазой плазмином, который образуется из профермента плазминогена под действием различных активаторов, также представляющих собой сериновые протеазы. При повреждении паренхиматозных органов, богатых тканевыми активаторами, происходит их высвобождение и увеличение фибринолитической активности крови, что приводит к высокой интенсивности кровотечения и существенной кровопотере. Это происходит в случае травм, обширных ожогов или хирургических операций на некоторых органах (легких, печени, щитовидной, поджелудочной и предстательной железах), акушерских кровотечениях, при панкреатите и др. Ингибирование компонентов фибринолитической системы крови является наиболее безопасным и эффективным способом остановки кровотечений в хирургической, травматологической, отоларингологической, стоматологической и акушерско-гинекологической практике и достигается применением отдельной группы гемостатических препаратов - антифибринолитиков.

Антифибринолитические препараты представлены:

во-первых - синтетическими структурными аналогами лизина (ε-аминокапроновая, транексамовая и п-аминобензойная кислоты), действие которых основано на связывании со специфическими лизин-связывающими участками профермента плазминогена. Насыщение и блокирование активных участков плазминогена препятствует процессу превращения плазминогена в плазмин и приводит к торможению фибринолиза и остановке кровотечения.

Во-вторых - неспецифическими ингибиторами сериновых протеиназ (плазмина, калликреина плазмы и тканей) - представляющими собой белки, основным представителем которых является апротинин. Апротинин снижает фибринолитическую активность крови, тормозит фибринолиз и оказывает гемостатическое действие, однако имеет целый ряд нежелательных лекарственных реакций и обладает большой аллергенностью. Апротинин, входивший в состав гемостатической губки «Тахокомб», из-за аллергенности исключен из состава композиции.

Характерной особенностью антифибринолитиков является достижение гемостатического эффекта в месте кровотечения вне зависимости от способа введения препарата (перорального, парентерального и местного).

Актуальной проблемой является поиск специфических ингибиторов фибринолиза, которые будут действовать только на ферменты-мишени, не затрагивая остальные компоненты фибринолитической системы крови. Весьма перспективными с этой точки зрения являются низкомолекулярные пептидные соединения, которые должны обладать низкой токсичностью.

В ряде публикаций и патентов описаны синтетические ингибиторы фибринолитической активности, представляющие собой органические соединения (WO 2012/047156, US 8569313), короткие пептиды (Midura-Nowaczer K., et al., 2006; 2008 и RU 2017749) и пептидомиметики (WO 2013/004845). Для некоторых из них проведены исследования специфической активности in vivo при различных способах применения.

Известно, что пептидная последовательность -Ala-Phe-Lys- эффективно связывается с активным центром плазмина (RU2121690), именно эта последовательность послужила основой для синтеза обладающих гемостатической активностью пептидных ингибиторов плазмина, в патенте (RU 2341532) запатентованы соединения H-Ala-Phe-Lys-Pip, H-Ala-Phe-Lys-Mf, For-Ala-Phe-Lys-Pip, For-Ala-Phe-Lys-Mf и их фармацевтически приемлемые соли (For - формил, Pip - пиперидин-4-ил, Mf - морфолин-ил)

Ближайший аналог соединения, на основе которого разработано заявляемое лекарственное средство - ингибитор For-Ala-Phe-Lys-Pip - имеет целый ряд недостатков технологического характера, обусловленных входящей в его состав формильной группой. Эта группа склонна к окислению перекисными соединениями, которые могут присутствовать в растворителях, используемых в ходе синтеза, что приводит к необходимости дополнительной очистки на каждой стадии. Для улучшения растворимости гидрофильных формилпептидов при масштабировании синтеза требуется многократное увеличение объемов стандартных или введение более эффективных, но более токсичных растворителей. Было обнаружено, что описанные в указанных патентах формилпептиды гигроскопичны и термически нестойки. Эти недостатки ближайшего аналога затрудняют проведение технологических операций при получении готовых лекарственных форм на его основе.

Задачей настоящего изобретения является расширение арсенала гемостатических лекарственных средств, предназначенных для остановки кровотечений, в том числе кровотечений из паренхиматозных органов при травмах и хирургических операциях.

Поставленная задача решена путем получения гемостатического лекарственного средства, на основе синтетического трипептида Ac-Ala-Phe-Lys-Pip·AcOH или его фармацевтически приемлемых солей.

В синтетическом трипептиде Ac-Ala-Phe-Lys-Pip·AcOH в качестве защитной группы использована ацетильная, которая обеспечивает большую стабильность трипептида и не имеет недостатков формильной группы, используемой в ближайшем аналоге.

Заявляемое лекарственное средство выполнено в различных лекарственных формах:

- водный раствор,

- гель на основе карбоксиметилцеллюлозы натриевой соли,

- пленка на основе карбоксиметилцеллюлозы натриевой соли и глицерина,

- губка на основе смешанного альгината натрия и кальция.

Все указанные лекарственные формы могут дополнительно содержать антисептики и стабилизаторы.

Изобретение проиллюстрировано следующими примерами.

Пример 1. Получение трипептида Ac-Ala-Phe-Lys-Pip-AcOH

Пептид (Ac - ацетил, Pip - пиперидин-4-ил) получают последовательным наращиванием пептидной цепи, начиная с замещенного амида лизина.

Замещенный амид лизина HCl·H-Lys(Z)-Pip получают реакцией Boc-Lys(Z)-OH (20 г) с Ν,Ν′-дициклогексилкарбодиимидом (10,9 г) и N-гидроксисукцинимидом (6,3 г) и пиперидином (10 мл) в хлористом метилене (Maxim E. Sergeev, Tatiana L. Voyushina. Convenient synthesis of novel natural amino acid cyclic amides for use as building blocks for proteinase inhibitors. Letters in Organic Chemistry, 2006, №3, 857). Boc-защитную группу с Boc-Lys(Z)-Pip удаляют стандартным методом путем обработки 4 M раствором хлористого водорода в диоксане (А.А. Гершкович, В.К. Кибирев. Синтез пептидов. Реагенты и методы. Киев, Наукова Думка, 1987, стр. 123). Выход HCl·H-Lys(Z)-Pip 18,77 г (93%).

Активированные эфиры Boc-Phe-OSu и Boc-Ala-OSu получают стандартным методом путем реакций соответственно Boc-Phe-OH и Boc-Ala-OH с Ν,Ν′-дициклогексилкарбодиимидом и N-гидроксисукцинимидом в тетрагидрофуране с последующей кристаллизацией продуктов из изопропанола (А.А. Гершкович, В.К. Кибирев. Синтез пептидов. Реагенты и методы. Киев, Наукова Думка, 1987, стр. 60-61).

Дипептид HCl·H-Phe-Lys(Z)-Pip получают методом сукцинимидных эфиров из полученных на предыдущих стадиях HCl·H-Lys(Z)-Pip (22,1 г) и Boc-Phe-OSu (22,0 г) в 200 мл хлористого метилена в присутствии Ν,Ν-диизопропилэтиламина (12,5 мл). Реакционную смесь перемешивают в течение 3-х ч при комнатной температуре. Затем добавляют N-метилпиперазин (3 мл), перемешивают и упаривают на вакуумном роторном испарителе. Полученный маслообразный остаток растворяют в смеси этил ацетата (250 мл) и воды (200 мл). Переносят смесь в делительную воронку, этилацетатный слой промывают последовательно по 200 мл дважды 5% раствором H₂SO₄ 15% раствором Na₂SO₄, дважды 5% раствором NaHCO₃, 20% раствором NaCl. Собранный этилацетатный раствор сушат над безводным Na₂SO₄. Осушитель отфильтровывают, раствор упаривают на вакуумном роторном испарителе до состояния вязкого масла. Boc-защитную группу с Boc-Phe-Lys(Z)-Pip удаляют стандартным методом путем обработки 4 M раствором хлористого водорода в диоксане (А.А. Гершкович, В.К. Кибирев. Синтез пептидов. Реагенты и методы. Киев, Наукова Думка, 1987, стр. 123). Выход HCl·H-Phe-Lys(Z)-Pip 28,9 г (94%)

Трипептид HCl·H-Ala-Phe-Lys(Ζ)-Pip получают методом сукцинимидных эфиров из полученных на предыдущих стадиях HCl·H-Phe-Lys(Z)-Pip (26,0 г) и Boc-Ala-OSu (16,0 г) в 200 мл хлористого метилена в присутствии эквимолярных количеств Ν,Ν-диизопропилэтиламина (12 мл). Перемешивают в течение 3-х ч при комнатной температуре, затем добавляют N-метилпиперазин (3 мл) и упаривают на роторном испарителе. Полученный маслообразный остаток растворяют в смеси этилацетата (250 мл) и воды (250 мл). Переносят смесь в делительную воронку, этилацетатный слой промывают последовательно по 200 мл дважды 5% раствором H₂SO₄ 15% раствором Na₂SO₄, дважды 5% раствором NaHCO₃, 20% раствором NaCl. Собранный этилацетатный раствор сушат над безводным Na₂SO₄. Осушитель отфильтровывают, раствор упаривают на вакуумном роторном испарителе до состояния вязкого масла. Далее вещество сушат в вакууме до состояния затвердевшей пены. Boc-защитную группу с Boc-Ala-Phe-Lys(Z)-Pip удаляют стандартным методом путем обработки 4 M раствором хлористого водорода в диоксане (А.А. Гершкович, В.К. Кибирев. Синтез пептидов. Реагенты и методы. Киев, Наукова Думка, 1987, стр. 123). Выход HCl·H-Ala-Phe-Lys(Z)-Pip 26,8 г (91%).

Защищенный трипептид Ac-Ala-Phe-Lys(Z)-Pip получают ацетилированием HCl·H-Ala-Phe-Lys(Z)-Pip уксусным ангидридом по методике получения ацетилированных аминокислот (З.И. Куваева, Д.В. Лопатик, Т.А. Николаева, А.Н. Книжникова, В.Э. Найденов, М.М. Маркович. Химико-фармацевтический журнал. 2010. Т. 44, №6. С. 22).

Для получения целевого пептида Ac-Ala-Phe-Lys-Pip·AcOH защищенный Ac-Ala-Phe-Lys(Z)-Pip(24,3r) растворяют в метаноле (250 мл), содержащим 5 мл уксусной кислоты, и гидрируют в присутствии палладиевой черни по известной методике (Дж. Гринштейн, М. Винниц, Мир, 1965, стр. 695). После окончания реакции смесь фильтруют через бумажный фильтр, растворитель удаляют в вакууме, остаток растворяют в воде и лиофильно высушивают. Выход гидрата продукта составляет 22,57 г (96% в пересчете на безводное вещество).

Пример 2. Оценка стабильности трипептида Ac-Ala-Phe-Lys-Pip-AcOH

При сравнении свойств трипептида Ac-Ala-Phe-Lys-Pip·AcOH с ближайшим аналогом установлено, что при хранении в течение 6 месяцев Ac-Ala-Phe-Lys-Pip·AcOH остается кристаллическим, в то время как ближайший аналог за счет повышенной гигроскопичности превращается в масло. Согласно данным, полученным методом ВЭЖХс УФ-детектированием, заявляемый трипептид Ac-Ala-Phe-Lys-Pip·AcOH стабилен при инкубировании в течение 3 месяцев при 65°C, в то время как ближайший аналог в таких условиях разрушается на 15-20%.

Пример 3. Получение лекарственной формы заявляемого лекарственного средства - раствора

Водный раствор трипептида Ac-Ala-Phe-Lys-Pip-AcOH получают традиционным способом. Он имеет следующий состав:

Для получения лекарственной формы - 5% раствора 5 г Ac-Ala-Phe-Lys-Pip·AcOH помещают в мерный цилиндр и доводят объем до 100 мл водой.

Пример 4. Получение лекарственной формы заявляемого лекарственного средства - геля

Гель на основе трипептида Ac-Ala-Phe-Lys-Pip·AcOH имеет следующий состав:

Для получения лекарственной формы - 2,5% геля 100 мл раствора Ac-Ala-Phe-Lys-Pip·AcOH с концентрацией 2,5% наливают в стеклянную чашку диаметром 20 см. По поверхности раствора равномерно, распределяют 1 г карбоксиметилцеллюлозы в Na+ и оставляют на 1 час при комнатной температуре. После набухания полимера гель тщательно перемешивают и оставляют еще на несколько часов для удаления пузырьков воздуха.

Пример 5. Получение лекарственной формы заявляемого лекарственного средства - пленки

Для получения лекарственной формы пленки к 8,5 мл раствора Ac-Ala-Phe-Lys-Pip·AcOH с концентрацией 1% добавляют 1,5 мл глицерина, смесь тщательно перемешивают и наливают в стеклянную чашку диаметром 5 см По поверхности раствора равномерно, распределяют 0,1 г карбоксиметилцеллюлозы в Na+ и оставляют на 1 час при комнатной температуре. После набухания полимера гель тщательно перемешивают, переносят в пластиковую форму и сушат в термостате при 37°C в течение суток.

Пример 6. Получение лекарственной формы заявляемого лекарственного средства - губки

Для получения лекарственной формы - губки к 70 мл раствора Ac-Ala-Phe-Lys-Pip·AcOH с концентрацией 1% добавляют 0,35 г натриевой соли альгината натрия, смесь перемешивают при нагревании до 50°C до образования раствора, который затем лиофильно высушивают в металлических поддонах (12×12 см). Полученную губку обрабатывают 0,3 M раствором хлористого кальция и высушивают.

Эксперименты по изучению гемостатического действия лекарственных форм заявляемого средства проводили на крысах линии Wistar, на модели капиллярно-паренхематозного кровотечения органа (печени). Эффективность лекарственных форм оценивали по времени остановки кровотечения и по объему кровопотери, согласно «Руководству по доклиническому исследованию лекарственных средств» под редакцией Миронова А.Н.

Пример 7. Оценка гемостатического действия заявляемого лекарственного средства в форме 5% раствора Ac-Ala-Phe-Lys-Pip·AcOH

Остановку кровотечения выполняли при аппликации на раневую поверхность марлевой салфетки с нанесенным на нее 5% раствором Ac-Ala-Phe-Lys-Pip·AcOH.

В качестве контроля использована марлевая салфетка, содержащая 5% раствор эпсилон-аминокапроновой кислоты, обладающей гемостатическим действием. В качестве положительного контроля использовали марлевую салфетку, смоченную физиологическим раствором. Эффективность лекарственной формы оценивали по массе потерянной крови и времени остановки кровотечения.

Из результатов, приведенных в таблице 1, следует, что эффективность гемостатического действия 5% раствора на основе трипептида Ac-Ala-Phe-Lys-Pip·AcOH по объему кровопотери соответствует раствору эпсилон-аминокапроновой кислоты в той же концентрации, а по времени остановки кровотечения превосходит этот препарат сравнения.

Пример 8. Оценка гемостатического действия заявляемого лекарственного средства в форме 2,5% геля Ac-Ala-Phe-Lys-Pip·AcOH

Остановку кровотечения выполняли при аппликации на раневую поверхность марлевой салфетки с нанесенным на нее гелем, в количестве 0,5 г на 1,0 см².

В качестве контроля использованы Салфетка «Активтекс АКФ», содержащая эпсилон-аминокапроновую кислоту. В качестве положительного контроля использовали марлевую салфетку, смоченную физиологическим раствором. Эффективность лекарственной формы оценивали по массе потерянной крови и времени остановки кровотечения.

Из результатов, приведенных в таблице 2, следует, что эффективность гемостатического действия лекарственной формы - 2,5% геля на основе трипептида Ac-Ala-Phe-Lys-Pip·AcOH - по времени остановки кровотечения и объему кровопотери превосходит эффективность салфетки «Активтекс АКФ».

Таким образом, получено гемостатическое лекарственное средство на основе синтетического трипептида Ac-Ala-Phe-Lys-Pip·AcOH, превосходящего ближайший аналог по стабильности и не содержащего формильную группировку, осложняющую процессы получения пептидной субстанции и лекарственного средства на ее основе. Эффективность гемостатического действия лекарственных форм заявляемого средства сопоставима, а по некоторым характеристикам превосходит эффективность известных гемостатических средств: раствора эпсилон-аминокапроновой кислоты и салфетки «Активтекс АКФ».

Источники информации

1. Purwin M., Bruzdo M., Marcowska Α., Midura-Nowachek Κ. Short peptides containing L-lysine and ε-aminocaproic acid as potential plasmin inhibitors // Pharmacie, 2009, 64 (11), 765-7.

2. Marcowska Α., Bruzdo I., Surazynski A, Midura-Nowachek K. Tripeptides with non-code amino acids as potential serine proteases inhibitors // J Enzyme Inhib Med Chem. 2013 Jun; 28(3): 639-43.

3. Maxim E. Sergeev, Tatiana L. Voyushina. Convenient synthesis of novel natural amino acid cyclic amides for use as building blocks for proteinase inhibitors. Letters in Organic Chemistry, 2006, №3, 857.

4. А.А. Гершкович, В.К. Кибирев. Синтез пептидов. Реагенты и методы. Киев, Наукова Думка, 1987.

5. З.И. Куваева, Д.В. Лопатик, Т.А. Николаева, А.Н. Книжникова, В.Э. Найденов, М.М. Маркович. Получение и применение N-ацетил- α-аминокислот // Химико-фармацевтический журнал. 2010. Т. 44, №6. С. 22.

6. Дж. Гринштейн, М. Винниц. Химия аминокислот и пептидов // Мир, 1965.

7. «Руководство по доклиническому исследованию лекарственных средств» под редакцией Миронова А.Н. М., Гриф и К, 2012.

8. Физиология человека. Под ред В.М. Покровского и Г.Ф. Коротько. М., Медицина, 2003.