Результат интеллектуальной деятельности: РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ ДРОЖЖЕЙ YARROWIA-LIPOLYTICA - ПРОДУЦЕНТ ЛИПАЗЫ

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и касается штамма дрожжей Yarrowia lipolytica - продуцента фермента липазы.

Липазы катализируют гидролиз триацилглицеридов с образованием жирных кислот и глицерина. Они находят применение в пищевой промышленности, бытовой химии, косметике. Специально очищенные препараты липаз применяют в медицине.

Значительный интерес к практическому использованию ферментов в медицине обусловлен важной ролью, которую они играют в биологических процессах, в частности, в процессах пищеварения у человека и животных.

Применение ферментных препаратов из различных источников для компенсации собственной недостаточности пищеварительных ферментов у человека получило название заместительной терапии.

Липазы из разных источников различаются по ряду параметров (позиционная, жирно-кислотная специфичность, стереоспецифичность, термостабильность и т.д.), поэтому при определении возможности использования конкретного фермента в заместительной терапии необходимо учитывать дополнительные критерии оценки.

Основные требования к липазам, используемым в практике заместительной терапии, сформулированы (Pancreas, 1992, vol.7, pp.311-319).

Предпочтительное распространение в препаратах, используемых в заместительной терапии, могут получить липазы, продуцируемые представителями родов Rhizopus, Aspergillus, Penicillium, Mucor, Candida, Yarrowia (WO 9638170, Pancreas, 1992, vol.7, pp.311-319).

В качестве одного из наиболее перспективных микробных продуцентов липазы рассматривают дрожжи Yarrowia lipolytica, у которых выявлено несколько внутриклеточных и секретируемых липаз. В первую очередь это кислотоустойчивая внеклеточная липаза Lip2 - продукт гена LIP2, соответствующая основным требованиям, предъявляемым к липазам, предназначенным, для использования в практике заместительной терапии (ВВА 1771 (2007) 228-237).

Повышенный интерес к созданию высокоэффективных продуцентов липаз на основе Yarrowia lipolytica связан также с достаточно хорошей генетической изученностью этого объекта и тем, что данный вид дрожжей удобен для промышленной ферментации (FEMS Microbiology Reviews, 1997, vol.19, pp.219-237).

Известен дикий штамм Yarrowia lipolytica W29 (АТСС 20460), на основе которого получен (J. Biotechnol., 2004, vol.109 pp.63-81) ряд штаммов реципиентов, в том числе Yarrowia lipolytica Pold (CLIB 139) и Yarrowia lipolytica Polf (ATCC MYA-2613), широко используемых для конструирования продуцентов секретируемых белков. Штамм W29 и производные реципиенты Pold и Polf имеют низкий уровень продукции липазы (не более 28 ЕД/мл), однако последние хорошо охарактеризованы биохимически и генетически и неоднократно использовались как высокоэффективные системы для гомо- и гетерологичной экспрессии, обеспечивая высокий уровень накопления целевого белка и его стабильность благодаря инактивации протеаз.

Так, на основе штамма Yarrowia lipolytica Pold получен генно-инженерный штамм Yarrowia lipolytica YPL 280 (FEMS Yeast Reseach, 2002, vol.2, pp.371-379), который при культивировании в колбах позволяет получить липазу с активностью до 2000 ЕД/мл культуральной жидкости.

Однако ассортимент штаммов Yarrowia lipolytica, которые могут быть использованы в промышленных условиях, ограничен, поэтому создание новых дрожжевых штаммов - продуцентов липазы является актуальной задачей.

Технической задачей настоящего изобретения является расширение арсенала штаммов продуцентов липазы, относящихся к виду Yarrowia lipolytica.

Задача решена путем конструирования рекомбинантного штамма дрожжей Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3323 - продуцента липазы.

Под рекомбинантным штаммом дрожжей понимается линия микроорганизмов производных Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3323, сохраняющих основные мутации и генно-инженерные модификации, обеспечивающие высокую продукцию фермента липазы.

Рекомбинантный штамм Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3323 получен из штамма W29 посредством инактивации гена URA3 с последующей трансформацией полученного трансформанта интегративной плазмидой pZ-lox-ura3d4-hp4d-LIP2.

Плазмида pZ-lox-ura3d4-hp4d-LIP2 получена на основе вектора pUC19 и содержит дефектный маркер ura3d4, способствующий отбору клонов с множественной интеграцией вектора в хромосому, содержит два loх сайта, ограничивающих ura3d4 маркер, благодаря чему при экспрессии рекомбиназы Cre по этим сайтам маркер может вырезаться из каждой интегрированной копии вектора. Также плазмида несет участки для негомологичной интеграции Zeta, различные транскрипционные элементы, в том числе сильный синтетический конститутивный промотор hp4d, и ген липазы Yarrowia lipolytica LIP2. Повышенная копийность гена LIP2 и его измененная регуляция обусловливают способность заявляемого штамма накапливать более высокие количества липазы.

Полученный штамм Yarrowia lipolytica депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) по адресу 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, д.1 и имеет регистрационный номер ВКПМ Y-3323.

Штамм Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3323 характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки. Суточная культура в жидкой YPD среде (мас.%: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2, глюкоза - 2, вода - остальное) представлена овальными, удлиненно-овальными, округлыми клетками размером 4,6-6,0×4,5-12,5 мкм. Почкование полярное или латеральное, на узком основании. К третьим суткам большинство клеток почкуются и образуют псевдомицелий.

Клетки хорошо растут на простых питательных средах. Колонии на мальтоагаре (J.A.Barnett et al. "Yeasts characteristics and identification", Cambridge, 1983) (возраст 1 неделя) кремового цвета, пастообразные, слегка приподнятые в центре, морщинистые, с фестончатым краем. Штрих на мальтоагаре непрерывный, плоский, блестящий, кремово-белого цвета, пастообразный, края ровные, со временем становится складчатым. Спор не образует.

Физиолого-биохимические признаки. Облигатный аэроб. Сахара не сбраживает. Ассимилирует: сахарозу, глюкозу, D-галактозу (медленно), L-сорбозу, D-рибозу, этанол, глицерин, эритрит, адонит, D-маннит, сорбит и молочную, янтарную, лимонную, глюконовую кислоты. Не ассимилирует: мальтозу, лактозу, целлобиозу, трегалозу, мелибиозу, раффинозу, мелицитозу, инулин, крахмал, D-ксилозу, L- и D-арабинозу, раммозу, дульцит, инозит, D-глюкозамин и глюкуроновую, 2-кетоглюконовую, 5-кетоглюконовую кислоты. Не ассимилирует нитраты. Не растет в безвитаминной среде, требует присутствия в среде тиамина, не требует биотина.

Оптимальное значение рН для роста 5,5-7,0. Не растет при 37°C. Максимальная температура роста 35°C. Разжижает желатин. Растет на алканах. Гидролизует мочевину.

Заявляемый штамм при выращивании в колбах способен продуцировать липазу с активностью до 9000 ЕД/мл культуральной жидкости.

Изобретение проиллюстрировано следующими фигурами графического изображения:

Фиг.1. Схема плазмиды pU3-XPR-SUC,

Фиг.2. Схема плазмиды pZ-lox-ura3d4-hp4d-LIP2,

Фиг.3. График зависимости липазной активности культуральной жидкости штамма Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3323 от времени ферментации.

Получение и культивирование штамма Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3323 подтверждено следующими примерами.

Пример 1: Конструирование интеграционной плазмиды pU3-XPR-SUC

ДНК последовательность, содержащую области гомологии к гену URA3 Yarrowia lipolytica получают методом ПЦР, используя в качестве матрицы геномную ДНК, выделенную из штамма Yarrowia lipolytica W29 по методу, описанному в (Methods in Yeast Genetics. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory, 1994).

ПЦР-продукт получают с помощью приведенной ниже сшивки двух фрагментов, полученных по двум парам праймеров:

Фрагменты ДНК размером 1121 и 1737 п.о. получают с использованием Pfu-полимеразы.

В работе используют праймеры для ПЦР, синтезированые фирмой Syntol (Москва), и ферменты фирмы Fermentas Inc.

Для реакции амплификации используют приблизительно 100 нмолей каждого праймера. Оба фрагмента амплифицированной ДНК после электрофореза в 1% агарозном геле очищают методом экстракции ДНК. Очищенные фрагменты ДНК в количестве по 0,05 мкг используют в качестве матрицы для ПЦР по праймерам URA-upstream-F и URA-downstream-R, с использованием Pfu-полимеразы. Около 0,5 мкг конечной амплифицированной ДНК размером 2839 п.о. после экстракции из агарозы (Kit #K0513, Fermentas Inc.) обрабатывают эндонуклеазами рестрикции SacI и SdaI и лигируют с 0,2 мкг ДНК плазмиды pUC19, расщепленной аналогичным образом. Полученной плазмидой трансформируют штамм E.coli XL1 (Blue) методом электропорации (Molecular Cloning, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, N.Y. (1989)). Клоны, содержащие необходимую вставку амплифицированной ДНК, отбирают на чашках с агаризованной средой LB (мас.%): триптон - 1, дрожжевой экстракт - 0,5, NaCl - 0,5, вода - остальное) по устойчивости к ампициллину и стандартному тесту на отсутствие активности бета-галактозидазы.

Нуклеотидную последовательность плазмидной ДНК, выделенной из отобранных клонов, подтверждают рестрикционным анализом. Полученная плазмида, размером 5533 п.о. названа pUC-ura-updown.

ПЦР продукт, содержащий SUC2 ген, амплифицируют с использованием Taq-полимеразы по праймерам

Pxpr-suc-R-PaeI 5'-TATATAGCATGCGACAGTTAGAGCAGCAACG-3',

Term-suc-F-SdaI 5'-ТATACCTGCAGGCTCTAGAGGATCTCGCTTG-3'.

Матрицей для ПЦР служит тотальная геномная ДНК Yarrowia lipolytica Polf (АТСС MYA-2613). ДНК-фрагмент размером 1193 п.о. после электрофореза в 1% агарозном геле очищают методом экстракции и обрабатывают рестриктазами PaeI и SdaI. Далее 0,5 мкг фрагмента лигируют с 0,2 мкг ДНК плазмиды pUC-ura-updown, обработанной сходным образом и дополнительно дефосфорилированной щелочной фосфатазой (CIAP). Полученной плазмидой трансформируют E.coli XL1 (Blue) методом электропорации. Клоны отбирают на чашках с агаризованной средой LB по устойчивости к ампициллину. Наличие необходимой вставки амплифицированной ДНК в плазмидной ДНК, выделенной из отобранных клонов, проверяют методом рестрикционного анализа. Полученная плазмида размером 6690 п.о. названа pU3-XPR-SUC и содержит селективный маркер SUC2, фланги интеграции в последовательность гена URA3 (фиг.1).

Пример 2: Получение штамма Yarrowia lipolytica W29Δura.

Делецию гена URA3 в хромосоме штамма Yarrowia lipolytica W29 получают путем трансформации интегративной плазмидой pU3-XPR-SUC. Трансформацию Yarrowia lipolytica осуществляют литийацетатным методом (Current Genetic, 1989, vol 16, pp.253-260). Трансформанты отбирают по способности утилизировать сахарозу на минимальной среде YNB (Himedia, cat. #M139) с добавлением сахарозы (2 мас.%) и урацила (0,01 мас.%). Фенотип трансформантов подтверждают рассевом на той же среде.

Далее отобранные трансформанты пересевают на среду YNB с добавлением глюкозы (2 мас.%) и урацила (0,01 мас.%). Отсутствие селективного давления обеспечивает выщепление плазмиды pU3-XPR-SUC из генома за счет рекомбинации по прямым повторам между хромосомальной копией и upstream флангом гена URA3. В результате в хромосоме образуется делеция гена URA3, а клоны теряют способность утилизировать сахарозу за счет потери гена SUC2. Наличие ауксотрофности по урацилу определяют путем пересева трансформантов на среду YNB с добавлением 5-FOA (Fermentas Inc., cat #R0811) (0,1 мас %), урацила (0,01 мас %) и глюкозы (2 мас.%). Среди полученных трансформантов отобран штамм W29Δura, делеция гена URA3 у которого подтверждена ПЦР анализом по праймерам:

Пример 3: Получение плазмиды pZ-ura3d4

Для получения плазмиды pZ-ura3d4 используют последовательность Zeta, представляющую собой длинный концевой повтор ретротранспозона YLt1 (US6582951).

Модифицированную последовательность Zeta, содержащую в центре сайты рестрикции Bsu15I, NheI, XmaJI, получают методом ПЦР, используя в качестве матрицы геномную ДНК, выделенную из штамма Yarrowia lipolytica CLIB 122.

ПЦР продукт получают с помощью приведенной ниже сшивки двух фрагментов, полученных по двум парам праймеров:

Zeta-F1, 5'-TGCCTAGGCGCTAGCCATCGATAAAGTGCTTTGTGCGTACC-3',

Zeta-R1, 5'-GCGGCCGCTGTCGGGAACCGCGTT-3' и

Zeta-F2, 5'-GCGGCCGCACTGAAGGGCTTTGTGAGG-3',

Zeta-R2, 5'-ATCGATGGCTAGCGCCTAGGCATGTGTAACACTCGCTCTGGAG-3'.

Фрагменты ДНК размером 333 и 422 п.о. получают с использованием Pfu-полимеразы.

Для реакции амплификации используют 100 нмолей каждого праймера. Оба фрагмента амплифицированной ДНК после электрофореза в 1% агарозном геле очищают методом экстракции ДНК (Kit #K0513, Fermentas Inc.). Очищенные фрагменты ДНК в количестве по 0,05 мкг используют в качестве матрицы для ПЦР по праймерам Zeta-R1 и Zeta-F2, с использованием Pfu-полимеразы. Около 0,5 мкг конечной амплифицированной ДНК размером 733 п.о. после экстракции из агарозы лигируют с 0,2 мкг ДНК плазмиды pUC19, расщепленной эндонуклеазами PaeI и HindIII и обработанной полимеразой Pfu для получения тупых концов. Полученной плазмидой трансформируют E.coli XL1 (Blue) методом электропорации. Клоны, содержащие необходимую вставку амплифицированной ДНК, отбирают на чашках с агаризованной средой LB по устойчивости к ампициллину и стандартному тесту на отсутствие активности бета-галактозидазы. Нуклеотидную последовательность плазмидной ДНК, выделенной из отобранных клонов, определяют методом рестрикционного анализа. Полученная плазмида размером 3413 п.о. названа pUC-Zeta.

Для уменьшения pUC-Zeta 0,5 мкг плазмиды последовательно обрабатывают эндонуклеазой SdaI, и в условиях неполной рестрикции эндонуклеазой AatII. Затем, после переосаждения этиловым спиртом (Sambrook et al., Molecular Cloning, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, N.Y. (1989)) обрабатывают Pfu-полимеразой для получения тупых концов. ДНК-фрагмент размером 2905 п.о. после электрофореза в 1% агарозном геле очищают методом экстракции и лигируют лигазой фага Т4. Полученной плазмидой трансформируют E.coli XL1 (Blue) методом электропорации. Клоны отбирают на чашках с агаризованной средой LB по устойчивости к ампициллину. Нуклеотидную последовательность плазмидной ДНК, выделенной из отобранных клонов, определяют методом рестрикционного анализа. Полученная плазмида размером 2905 п.о. названа pZ.

ПЦР продукт, содержащий дефектный ura3d4 ген, фланкированный loх сайтами, амплифицируют с использованием Taq-полимеразы по праймерам

URA-71-F(NheI)

5'-TTTGCTAGCTACCGTTCGTATAGCАТАСATTATACGAAGTTATGCCCTCCTACGAAGCTC-3' и

URA-66-R(Bsu15I)

5'-TCGATACCGTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCGACAAAGGCCTGTTTC-3'.

Матрицей для ПЦР служит тотальная геномная ДНК Yarrowia lipolytica W29. Фрагмент ДНК размером 1393 п.о. после электрофореза в 1% агарозном геле очищают методом экстракции и обрабатывают рестриктазами Bsu15I и NheI. Далее 0,5 мкг фрагмента лигируют с 0,2 мкг ДНК плазмиды pZ, обработанной сходным образом, и дополнительно дефосфорилированой щелочной фосфатазой (CIAP). Полученной плазмидой трансформируют E.coli XL1 (Blue) методом электропорации. Клоны отбирают на чашках с агаризованной средой LB по устойчивости к ампициллину. Плазмидную ДНК, выделенную из отобранных клонов, оценивают методом рестрикционного анализа на наличие необходимой вставки амплифицированной ДНК. Полученная плазмида размером 4283 п.о. названа pZ-lox-ura3d4 и содержит селективный маркер ura3d4, фланкированный 1ох сайтами и фрагментами последовательности Zeta, отделенными от последовательности pUC19 сайтами NotI.

Пример 4: Получение плазмиды pZ-ura3d4-hp4d-LIP2

Гибридный промотор hp4d конструируют, как описано в патенте (US 6083717). В результате получают плазмиду pUC-hp4d, в которой промотор фланкирован сайтами NheI и XmaJI. Плазмиду pUC-hp4d обрабатывают рестриктазами NheI и XmaJI. Фрагмент, содержащий hp4d промотор размером 558 и.о., после электрофореза в 1% агарозном геле очищают методом экстракции и 0,5 мкг его лигируют с 0,2 мкг ДНК плазмиды pZ-ura3d4, обработанной сходным образом и дополнительно дефосфорилированой щелочной фосфатазой (CIAP). Полученной плазмидой трансформируют E.coli XL1 (Blue) методом электропорации. Клоны отбирают на чашках с агаризованной средой LB по устойчивости к ампициллину. Наличие необходимой вставки амплифицированной ДНК в плазмидной ДНК, выделенной из отобранных клонов, подтверждают методом рестрикционного анализа. Полученная плазмида размером 4834 п.о. названа pZ-lox-ura3d4-hp4d.

ПЦР продукт, содержащий терминатор гена XPR2 Yarrowia lipolytica, амплифицируют с использованием Taq-полимеразы по праймерам

xprT-F 5'-atcctaggtaggcaattaacag-3' и

xprT-R 5'-tatctagagccacctacaagccag-3'.

Матрицей для ПЦР служит тотальная геномная ДНК Yarrowia lipolytica W29. Фрагмент ДНК размером 150 п.о. после электрофореза в 1% агарозном геле очищают методом экстракции и обрабатывают рестриктазами XbaI и XmaJI. Далее 0,5 мкг фрагмента лигируют с 0,2 мкг ДНК плазмиды pZ-lox-ura3d4-hp4d, обработанной сходным образом и дополнительно дефосфорилированой щелочной фосфатазой (CIAP). Полученной плазмидой трансформируют штамм E.coli XL1 (Blue) методом электропорации. Клоны отбирают на чашках с агаризованной средой LB по устойчивости к ампициллину. Наличие необходимой вставки амплифицированной ДНК в плазмидной ДНК, выделенной из отобранных клонов, подтверждают методом рестрикционного анализа. Полученная плазмида размером 4973 п.о. названа pZ-lox-ura3d4-hp4d-Txpr.

ПЦР продукт, содержащий ген LIP2, амплифицируют с использованием Pfu-полимеразы по праймерам

LIP2-F 5'-GAAGACACAATGAAGCTTTCCACCATCCT-3' и

LIP2-R 5'-ССТAGGCC ATTCGATCGC ATGCTG-3'.

Матрицей для ПЦР служит тотальная геномная ДНК Yarrowia lipolytica W29. ДНК-фрагмент размером 1147 п.о. после электрофореза в 1% агарозном геле очищают методом экстракции и обрабатывают рестриктазами BpiI и XmaJI. Далее 0,5 мкг фрагмента лигируют с 0,2 мкг ДНК плазмиды pZ-ura3d4-hp4d-Txpr, обработанной сходным образом и дополнительно дефосфорилированой щелочной фосфатазой (CIAP). Полученной плазмидой трансформируют E.coli XL1 (Blue) методом электропорации. Клоны отбирают на чашках с агаризованной средой LB по устойчивости к ампициллину. Плазмидную ДНК, выделенную из отобранных клонов, оценивают методом рестрикционного анализа на наличие необходимой вставки амплифицированной ДНК. Последовательность гена LIP2 подтверждают методом секвенирования. Полученная плазмида размером 6092 п.о. названа pZ-lox-ura3d4-hp4d-LIP2 (фиг.2).

Пример 4: Получение штамма Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3323.

Трансформацию Yarrowia lipolytica осуществляют литийацетатным методом (Current Genetic, 1989, vol 16, рр.253-260). Трансформанты отбирают на минимальной среде YNB с добавлением глюкозы (2 мас.%) и урацила (0,01 мас.%). Фенотип трансформантов подтверждают рассевом на той же среде.

В качестве ДНК при трансформации штамма Yarrowia lipolytica W29Δura используют 1 мкг ДНК, полученной после экстракции из агарозного геля большего из фрагментов, образованных при обработке плазмиды pZ-lox-ura3d4-hp4d-LIP2 эндонуклеазой NotI. Селекцию трансформантов ведут по комплементации ауксотрофности по урацилу на агаризованной минимальной среде YNB с добавлением глюкозы (2 мас.%).

Липазную активность трансформантов первоначально оценивают в чашечном тесте с трибутиратом по зонам прояснения. В тесте используют минимальную среду YNB с добавлением глюкозы (5 мас.%) и трибутирата (2 мас.%). В качестве контроля, используют штамм Yarrowia lipolytica W29.

20 трансформантов, показавших наибольшее соотношение диаметра зоны прояснения к диаметру колонии на чашках с трибутиратом, культивируют в жидкой среде в пробирках. Ферментацию проводят при 30°C на качалке в минимальной среде YNB с добавлением оливкового масла (5 мас.%), мочевины (0,8 мас.%) и глюкозы (5 мас.%) в пробирках (50 мл) с рабочим объемом 10 мл. Посев осуществляют бактериологической петлей. Ферментацию продолжают в течение 3 суток.

Липазную активность в культуральной жидкости определяют титриметрическим методом, основанным на гидролизе эмульсии оливкового масла, с образованием свободных жирных кислот и глицерина. За единицу липолитической активности принимают такое количество фермента, которое за 1 мин в определенных условиях (рН 7,0 и температура 37°C) гидролизует 1 мкмоль субстрата с выделением эквимолярного количества жирных кислот. Настоящая методика разработана на основе методики Европейской Фармакопеи, адаптированной для определения липолитической активности микробной липазы.

По результатам ферментации отобран заявляемый штамм ВКПМ Y-3323, который является трансформантом №2 Yarrowia lipolytica W29Δura (pZ-lox-ura3d4-hp4d-LIP2) и при культивировании в пробирках позволяет получать липазу с активностью 6000 ЕД/мл культуральной жидкости.

Пример 5: Культивирование штамма Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3323.

Культуру выращивают при 30°C в течение 1 суток в чашках Петри с агаризованной средой YPD (мас.%: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2, глюкоза -2, агар - 2%, вода - остальное).

Инокулят (жидкую посевную культуру) выращивают в колбах (750 мл) с 50 мл жидкой питательной среды для инокулята (среда YNB с добавлением глюкозы (5 мас.%) и мочевины (0,8 мас.%)). Засев колб осуществляют петлей культуры, выращенной на твердой агаризованной среде YPD. Колбы инкубируют на качалке (250 об/мин) при 30°C в течение 24 ч.

В колбу с 50 мл ферментационной среды (YNB с добавлением глюкозы (5 мас.%), оливкового масла (5 мас.%) и мочевины (0,8 мас.%)) засевают 0,5 мл посевного материала.

Культивирование осуществляют на качалке со скоростью 250 об/мин при температуре 30°C. Пробы отбирают каждый день стерильно по 1 мл для определения концентрации биомассы, активности липазы в культуральной жидкости, контроля стерильности. Ферментацию проводят в течение 3 суток.

При ферментации в колбах в минимальной среде штамм Y-3323 синтезирует липазу с активностью 9000 ЕД/мл культуральной жидкости (фиг.3).