Результат интеллектуальной деятельности: РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Schizosaccharomyces pombe - ПРОДУЦЕНТ МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и касается штамма дрожжей Schizosaccharomyces pombe - продуцента молочной кислоты.

Молочная кислота (МК) широко используется в пищевой промышленности для консервирования и ароматизации и в производстве биодеградируемой пластмассы - полилактата. Другая сфера использования молочной кислоты - получение биодеградируемого растворителя этиллактата, который применяется при производстве электротехники, лаков и красок, текстиля, смазок, клеев и т.д. Предполагается, что нетоксичные эфиры молочной кислоты потенциально могут заменить более 80% растворителей, используемых в мире в настоящее время. В связи с этим актуальной становится задача разработки эффективных способов производства молочной кислоты.

Традиционно для получения МК используют микробиологические способы получения, основанные на культивировании бактериальных штаммов молочнокислых бактерий. Недостатком бактериальных штаммов-продуцентов молочной кислоты является их чувствительность к низким значениям pH и высоким концентрациям молочной кислоты, что приводит к замедлению роста культуры, снижению скорости синтеза молочной кислоты и, как следствие, преждевременному завершению процесса ферментации.

В связи с этим особый интерес для создания продуцентов молочной кислоты представляет конструирование штаммов микроорганизмов, в меньшей степени чувствительных к низким значениям pH и высоким концентрациям молочной кислоты.

Перспективным объектом для производства молочной кислоты являются, в частности, дрожжи, многие из которых способны расти и осуществлять брожение в условиях повышенной кислотности [1] и, в отличие от бактерий, не требуют для своего роста сложных по составу сред.

В норме дрожжи не продуцируют значимых количеств молочной кислоты, однако экспрессия гена лактатдегидрогеназы (ldh) в дрожжевых клетках позволяет получить штаммы, продуцирующие молочную кислоту в количествах, сравнимых с производственным уровнем [2]. При этом в качестве реципиента используют такие дрожжи, как Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces sp., Pichia sp., Schizosaccharomyces sp. и Hansenula sp., а в качестве источника гена лактатдегидрогеназы - молочнокислые бактерии (Lactobacillus), грибы (Rhizopus oryzae) и ткани млекопитающих (ген ldh из клеток мышечной ткани быка, человека)

Так, дрожжи Pichia stipitis, несущие ген лактатдегидрогеназы из Lactobacillus helveticus, способны продуцировать молочную кислоту в количестве 41 г/л [3].

Продукция штамма Saccharomyces cerevisiae JnvScI, содержащего ген лактатдегидрогеназы из гриба Rhizopus oryzae (J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 2003; 30; 22-27), составляет 35-40 г/л молочной кислоты, а его отличительной способностью является неизменная скорость образования молочной кислоты в интервале pH 3,5-6,0.

Известен [4] штамм Saccharomyces cerevisiae, несущий ген лактатдегидрогеназы из бактерий Lactobacillus plantarum, который продуцирует 58 г/л молочной кислоты при pH 3,6.

Основным недостатком дрожжей Saccharomyces cerevisiae является то, что процесс синтеза молочной кислоты ингибируется ее высокими концентрациями, что отрицательно влияет на эффективность процесса получения молочной кислоты.

В соответствии с [5] высокой устойчивостью к низким значениям pH среды и высоким концентрациям молочной кислоты обладают дрожжи Schizosaccharomyces pombe. Данные дрожжи хорошо генетически изучены, не требуют для своего роста сложных органических сред, удобны для промышленной ферментации и являются перспективным объектом для создания продуцентов молочной кислоты.

Так, дрожжи Schizosaccharomyces pombe, содержащие ген лактатдегидрогеназы из грибов Rhizopus oryzae [5], продуцируют 58 г/л молочной кислоты. Однако данный штамм не подходит для промышленного применения, т.к. культивирование осуществляется в две стадии и требует тщательной отмывки клеток, что неосуществимо в промышленных масштабах. Кроме того, время культивирования для достижения указанного количества молочной кислоты очень велико и составляет 8 суток.

В работе [6] показано, что Schizosaccharomyces pombe ATCC №2476, несущий ген лактатдегидрогеназы млекопитающих (Homo sapiens), продуцирует молочную кислоту в количестве 88 г/л. Однако для успешного культивирования ферментационная среда должна содержать экзотическую добавку - протеолипиды (белково-липидные соединения, экстрагируемые органическими растворителями из ткани мозга).

Задачей заявляемого изобретения является расширение арсенала рекомбинантных микроорганизмов, продуцирующих молочную кислоту.

Задача решена путем конструирования рекомбинантного штамма дрожжей Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-4041 - продуцента молочной кислоты.

Штамм Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-4041 получен путем трансформации штамма-реципиента Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-3106 плазмидной ДНК pcDNA-Km-leu1-pla, полученной путем клонирования в полилинкер коммерческого вектора pUC19 гена лактатдегидрогеназы ldh1 молочнокислых бактерий Lactobacillus plantarum (pla), гена лейцина (leu1) - генетического локуса для эффективной интеграции гена лактатдегидрогеназы ldh1 в хромосому S. pombe и гена устойчивости к антибиотику канамицину (Km) - селективного маркера.

Полученный штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП «ГосНИИгенетика» (ВКПМ) по адресу: 117545 Москва, 1-ый Дорожный проезд, д.1 и имеет регистрационный номер ВКПМ Y-4041.

Штамм Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-4041 характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки

Для описания культурально-морфологических признаков использовали среды “Malt extract”, “Malt agar” и картофельно-кукурузный агар [7].

После трех дней культивирования на среде “Malt extract” культура образует клетки округлые, эллипсоидальные и цилиндрические (3,0-5,0)×(5,0-15,0-24,0) мкм. Осадок формируется.

На среде “Malt agar” на 5 сутки образует некрупные колонии белого или слегка кремоватого оттенка. Поверхность колоний гладкая, край ровный. Вегетативное размножение - деление клетки пополам.

Аски со спорами формируются на картофельно-кукурузном агаре. Конъюгация вегетативных клеток предшествует образованию асков, содержащих от 2-х до 4-х эллипсоидальных аскоспор. Свободные аскоспоры могут объединяться в небольшие группы.

Физиолого-биохимические признаки

Культура способна сбраживать глюкозу, сахарозу, мальтозу и раффинозу. Не способна к брожению галактозы, лактозы и мелибиозы. Ассимилирует в качестве единственного источника углерода сахарозу, мальтозу, раффинозу. Не ассимилирует галактозу, целлобиозу, трегалозу, лактозу, ксилозу, арабинозу, рибозу, рамнозу, эритрит, рибитол, маннит, крахмал, янтарную, лимонную кислоты, инозит культура не ассимилирует нитраты, не способна расти на среде без витаминов.

Оптимальные условия для размножения штамма.

Температура 30°C, pH 6, полная дрожжевая среда [8].

Штамм хранится в лиофилизированном виде или в парах жидкого азота.

Полученный штамм Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-4041 сохраняет способность к образованию молочной кислоты после 18 последовательных пересевов на полноценной среде.

Заявляемый штамм при выращивании в колбах способен продуцировать молочную кислоту в количестве 50 г/л культуральной жидкости.

Изобретение проиллюстрировано следующими фигурами графического изображения:

Фиг.1 Зависимость накопления молочной кислоты от времени культивирования

Фиг.2 Хроматограмма супернатанта культуральной жидкости штамма Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-4041

Пример 1. Получение штамма Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-4041

Трансформацию Schizosaccharomyces pombe осуществляют методом электропорации (http://www-bcf.usc.edu/~forsburg/tfmn.html).

Штамм Schizosaccharomyces pombe Y-3106, используемый для трансформации, предварительно выращивают в среде YPD (мас.%: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2, вода - остальное) до концентрации 1×10⁸ клеток на 1 мл. Клетки центрифугируют, промывают в ледяной стерильной воде, а затем в ледяном растворе 1М сорбитола. Клетки инкубируют в 25 мМ растворе дитиотрейтола в течение 15 минут, затем промывают в ледяном растворе 1М сорбитола. Клетки ресуспендируют в ледяном растворе 1М сорбитола в концентрации 1-5×10⁹ клеток на 1 мл. Аликвоту объемом 40 мкл клеточной суспензии, переносят в охлажденный эппендорф, добавляют 100 нг ДНК плазмиды pcDNA-Km-leu1-pla, линеаризованной рестриктазой BglII, и инкубируют во льду 5 минут. Смесь клеток и ДНК переносят в предварительно охлажденную кювету для электропорации. Электропорацию проводят при следующих условиях: 1,5 кВ, 400 Ом, 25uF. После порации добавляют 1 мл ледяного раствора 1М сорбитола.

Селекцию трансформантов ведут на агаризованной минимальной среде YNB (Himedia) с добавлением глюкозы (2 мас.%) в течение 5 суток при температуре 30°C. В качестве селективного агента добавляют генетицин в количестве 20 мг/мл.

Продукцию молочной кислоты трансформантами первоначально оценивают в чашечном тесте с добавлением мела по зонам гидролиза. В тесте используют агаризованную среду LA (мас.%: дрожжевой экстракт - 0,5, пептон - 1, агар - 2, вода - остальное) с добавлением глюкозы (2 мас.%) и мела (0,5 мас.%). В качестве контроля используют штамм Schizosaccharomyces pombe Y-3106.

Трансформанты, показавшие наибольшее соотношение диаметра зоны гидролиза к диаметру колонии на чашках с мелом, культивируют в жидкой среде в пробирке. Ферментацию проводят при 30°C на качалке с 150 об/мин в питательной среде YPD с добавлением глюкозы (2 мас.%) в пробирках (50 мл) с рабочим объемом 20 мл. Посев осуществляют бактериологической петлей. Ферментацию продолжают в течение 48 часов.

Концентрацию молочной кислоты в культуральной жидкости определяют методом ВЭЖХ [9].

По результатам ферментации отобран трансформант №24, который при культивировании в пробирках позволяет получить молочную кислоту в количестве 19 г/л культуральной жидкости.

Полученный штамм Schizosaccharomyces pombe (pcDNA-Km-leul-pla) депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под регистрационным номером ВКПМ Y-4041.

Пример 2. Культивирование штамма Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-4041

Посевную культуру выращивают при 30°C в течение 1 суток на чашках Петри на агаризованной среде YPD (мас.%: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2, агар - 2, вода - остальное) с добавлением глюкозы (2 мас.%).

Для получения инокулята пробирки (50 мл) с 10 мл жидкой питательной среды YPD засевают посевной культурой. Пробирки инкубируют на качалке (240 об/мин) при 30°C в течение 24 ч.

Колбу, объемом 750 мл, содержащую 95 мл среды YPD с добавлением глюкозы (15 мас.%) засевают 5 мл инокулята.

Культивирование осуществляют на качалке со скоростью 100 об/мин при температуре 30°C в течение 48 часов. Пробы отбирают каждые 12 часов стерильно по 1 мл для определения концентрации биомассы и молочной кислоты в культуральной жидкости, а также контроля стерильности. Штамм ВКПМ Y-4041 секретирует молочную кислоту в количестве 50 г/л культуральной жидкости (фиг.1).

Пример 3. Определение молочной кислоты в культуральной жидкости методом ВЭЖХ

После окончания ферментации биомассу осаждают цетрифугированием, при этом доля супернатанта в культуральной жидкости составляет 60-75%.

Супернатант разводят водой Super - Q в 10 раз, центрифугируют при 18000 об/мин в течение 2 мин и анализируют методом ВЭЖХ на хроматографе системы “alliance” (Separations Module Waters 2695, Photodiode Array detector Waters 2996).

Для проведения ВЭЖХ 5 мкл модельной смеси вводят в хроматограф, снабженный фотометрическим детектором с длинной волны 210 нм. Разделение ведут на колонке, ReproSil-Pur C18-AQ, 5 µm, длиной 250 мм и внутренним диаметром 4,6 мм. В качестве элюента используют систему с содержанием 0,5% метанола, 0,5% ацетонитрила, H₃PO₄ (85%) 1 мл/л. Температура хроматографической колонки - 30°C. Объемная скорость элюента 1,0 мл/мин. Разделение молочной кислоты от остальных органических кислот при выбранном режиме хроматографического анализа проходит полностью. Наложения пиков и пиков «всадников» не отмечается. Время выхода стандарта молочной кислоты составляет 7 минут.

Результаты хроматографического анализа содержания молочной кислоты в супернатанте представлены на фиг.2. Наличие в культуральной жидкости молочной кислоты подтверждается присутствием доминантного пика, время выхода которого составляет 7 минут, что соответствует времени выхода стандарта молочной кислоты.

Использованные источники информации

[1] Бабьева И.П., Чернов И.Ю. Биология дрожжей, Товарищество научных изданий КМК, М. 2004.

[2] Sauer M., Porro D., Mattanovich D., Branduardi P. 16 years research on lactic acid production with yeast - ready for the market? // Biotechnol Genet Eng Rev. - 2010. - V.27. - №1. - Р.229-256.

[3] Ilmen M., Koivuranta К., Ruohonen L., Suominen P., Penttila M. Efficient production of L-lactic acid from xylose by Pichia stipitis // Appl Environ Microbiol. - 2007. - V.73. - P.117-123.

[4] Colombie S., Dequin S., Sablayrolles J.M. Control of lactate production by Saccharomyces cerevisiae expressing a bacterial LDH gene // Enzyme Microbial Technology. - 2003. - V.33. - №1. - P.38-46.

[5] Синеокий С.П., Вустин М.М., Юзбашев Т.В. и др. Способ микробиологического синтеза молочной кислоты и рекомбинантный штамм дрожжей Schizosaccharomyces pombe для его осуществления // Патент RU 2268304, C12P 7/56, 2004.

[6] Futoshi H., Hideki Т., Yuko H., Chihiro H. Transformant And Process For Production Thereof, And Process For Production Of Lactic Acid // Patent US 20120214214, C12N 1/19, 2012.

[7] The yeasts of toponomic study. Ed. N.J.W. Kreger-van Rij, Amsterdam, Elsevier Sci. Publ. B.V., 1984, p.421.

[8] Захаров А. и др. Сборник методик по генетике дрожжей сахаромицетов. - Л., Наука, 1984, стр.144.

[9] П.Н. Нестеренко, П.А. Кебе Определение молочной кислоты методом ионоэксклюзионной хроматографии на сульфированном сверхсшитом полистироле // ВЕСТНИК МОСК. УН-ТА, сер. 2. химия. - 2002. - т.43 - №1 - стр.34-36.