Результат интеллектуальной деятельности: Штамм Schizosaccharomyces pombe - продуцент молочной кислоты

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и касается штамма дрожжей Schizosaccharomyces pombe - продуцента молочной кислоты.

Молочная кислота (МК) широко используется в пищевой промышленности для консервирования и ароматизации и в производстве биодеградируемой пластмассы - полилактата. Другая сфера использования молочной кислоты - получение биодеградируемого растворителя этиллактата, который применяется при производстве электротехники, лаков и красок, текстиля, смазок, клеев и т.д. Предполагается, что нетоксичные эфиры молочной кислоты потенциально могут заменить более 80% растворителей, используемых в мире в настоящее время. В связи с этим актуальной становится задача разработки эффективных способов производства молочной кислоты.

Традиционно для получения МК используют микробиологические способы получения, основанные на культивировании бактериальных штаммов молочнокислых бактерий. Недостатком бактериальных штаммов-продуцентов молочной кислоты является их чувствительность к низким значениям рН и высоким концентрациям молочной кислоты, что приводит к замедлению роста культуры, снижению скорости синтеза молочной кислоты и, как следствие, преждевременному завершению процесса ферментации.

В связи с этим особый интерес для создания продуцентов молочной кислоты представляет конструирование штаммов микроорганизмов, в меньшей степени чувствительных к низким значениям рН и высоким концентрациям молочной кислоты.

Перспективным объектом для производства молочной кислоты являются, в частности, дрожжи, многие из которых способны расти и осуществлять брожение в условиях повышенной кислотности [Бабьева И.П, Чернов И.Ю Биология дрожжей, Товарищество научных изданий КМК, М. 2004] и, в отличие от бактерий, не требуют для своего роста сложных по составу сред.

В норме дрожжи не продуцируют значимых количеств молочной кислоты, однако экспрессия гена лактатдегидрогеназы (ldh) в дрожжевых клетках позволяет получить штаммы, продуцирующие молочную кислоту в количествах, сравнимых с производственным уровнем [Biotechnol Genet Eng Rev. - 2010. - V. 27. - №1. - P. 229-256.]. При этом в качестве реципиента используют такие дрожжи, как Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces sp., Pichia sp., Schizosaccharomyces sp. и Hansenula sp., а в качестве источника гена лактатдегидрогеназы - молочнокислые бактерии (Lactobacillus), грибы (Rhizopus oryzae) и ткани млекопитающих (ген ldh из клеток мышечной ткани быка, человека)

Так дрожжи Pichia stipitis, несущие ген лактатдегидрогеназы из Lactobacillus helveticus, способны продуцировать молочную кислоту в количестве 41 г/л [Appl Environ Microbiol. - 2007. - V. 73. - P. 117-123].

Продукция штамма Saccharomyces cerevisiae JnvSc1, содержащего ген лактатдегидрогеназы из гриба Rhizopus oryzae (J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 2003; 30; 22-27), составляет 35-40 г/л молочной кислоты, а его отличительной способностью является неизменная скорость образования молочной кислоты в интервале рН 3,5-6,0.

Известен [Enzyme Microbial Technology. - 2003. - V. 33. - №1. - P. 38-46] штамм Saccharomyces cerevisiae, несущий ген лактатдегидрогеназы из бактерий Lactobacillus plantarum, который продуцирует 58 г/л молочной кислоты при рН 3,6.

Основным недостатком дрожжей Saccharomyces cerevisiae является то, что процесс синтеза молочной кислоты ингибируется ее высокими концентрациями, что отрицательно влияет на эффективность процесса получения молочной кислоты.

В соответствии с [Патент RU 2268304, С12Р 7/56, 2004] высокой устойчивостью к низким значениям рН среды и высоким концентрациям молочной кислоты обладают дрожжи Schizosaccharomyces pombe. Данные дрожжи хорошо генетически изучены, не требуют для своего роста сложных органических сред, удобны для промышленной ферментации и являются перспективным объектом для создания продуцентов молочной кислоты.

Так дрожжи Schizosaccharomyces pombe, содержащие ген лактатдегидрогеназы из грибов Rhizopus oryzae [Патент RU 2268304, С12Р 7/56, 2004], продуцируют 58 г/л молочной кислоты. Однако данный штамм не подходит для промышленного применения, т.к. культивирование осуществляется в две стадии и требует тщательной отмывки клеток, что неосуществимо в промышленных масштабах. Кроме того, время культивирования для достижения указанного количества молочной кислоты очень велико и составляет 8 суток.

В работе [Patent US 20120214214, C12N 1/19, 2012] показано, что Schizosaccharomyces pombe АТСС №2476, несущий ген лактатдегидрогеназы млекопитающих (Homo sapiens), продуцирует молочную кислоту в количестве 88 г/л. Однако для успешного культивирования ферментационная среда должна содержать экзотическую добавку - протеолипиды (белково-липидные соединения, экстрагируемые органическими растворителями из ткани мозга).

Задачей заявляемого изобретения является расширение арсенала рекомбинантных микроорганизмов, продуцирующих молочную кислоту.

Задача решена путем конструирования рекомбинантного штамма дрожжей Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-4224 - продуцента молочной кислоты.

Штамм Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-4224 получен путем последовательного трехкратного введения гена ldh лактатдегидрогеназы из Lactobacillus plantarum [GenBank: ACJ15334.1] в состав хромосомы дрожжей S. pombe, в которой инактивирован ген adh1 алкогольдегидрогеназы путем инсерции гена Cre-рекомбиназы под контролем nmt 1 промотора.

В результате получают трансформанты дрожжей S. pombe, в которых инактивирован ген алкогольдегидрогеназы adh1, а в хромосому интегрировано несколько копий гена лактатдегидрогеназы из Lactobacillus plantarum. Отбирают трансформант, способный продуцировать молочную кислоту в количестве 69 г/л, а этанол - 13 г/л за 48 ч культивирования.

Трансформант депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) как штамм Schizosaccharomyces pombe A4Km- - продуцент молочной кислоты, регистрационный номер ВКПМ Y-4224.

Штамм Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-4224 характеризуется следующими признаками:

Культурально-морфологические признаки

Для описания культурально-морфологических признаков использовали среды "Malt extract", "Malt agar" и картофельно-кукурузный агар [Amsterdam, Elsevier Sci. Publ. B.V., 1984, р. 421].

После трех дней культивирования на среде "Malt extract" культура образует клетки округлые, элипсоидальные и цилиндрические (3,0-5,0)×(5,0-15,0-24,0) мкм. Осадок формируется.

На среде "Malt agar" на 5 сутки образует некрупные колонии белого или слегка кремоватого оттенка. Поверхность колоний гладкая, край ровный. Вегетативное размножение - деление клетки пополам.

Физиолого-биохимические признаки

Культура способна сбраживать глюкозу, сахарозу, мальтозу и раффинозу. Не способна к брожению галактозы, лактозы и мелибиозы. Ассимилирует в качестве единственного источника углерода сахарозу, мальтозу, раффинозу. Не ассимилирует галактозу, целлобиозу, трегалозу, лактозу, ксилозу, арабинозу, рибозу, рамнозу, эритрит, рибитол, маннит, крахмал, янтарную, лимонную кислоты, инозит культура не ассимилирует нитраты, не способна расти на среде без витаминов.

Оптимальные условия для размножения штамма

Температура 30°С, рН 6, полная дрожжевая среда YPD [Захаров А. и др. Сборник методик по генетике дрожжей сахаромицетов. - Л., Наука, 1984, стр. 144].

Штамм хранится в лиофилизированном виде или в парах жидкого азота.

Полученный штамм Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-4224 сохраняет способность к образованию молочной кислоты после 18 последовательных пересевов на полноценной среде.

Заявляемый штамм при выращивании в пробирках способен продуцировать молочную кислоту в количестве 69 г/л культуральной жидкости, продукция побочного продукта этанола составляет 13 г/л за 48 ч культивирования.

Пример 1. Получение штамма Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-4224

1.1. Инактивация гена adh1 алкогольдегидрогеназы в дрожжах S. pombe путем инсерции гена Cre-рекомбиназы под контролем nmt 1 промотора

Инактивацию гена adh1 алкогольдегидрогеназы в дрожжах S. pombe путем инсерции гена Cre-рекомбиназы под контролем nmt 1 промотора осуществляют путем трансформации плазмиды padh1-nmt1-Cre в штамм S. pombe ВКПМ Y-3106. Плазмиду padh1-nmt1-Cre получают методом клонирования [Sambrook J., Maniatis Т., Fritsch Е. Molecular cloning: a laboratory manual. - N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory, 1989] в полилинкер коммерческого вектора pUC19 следующих генетических элементов:

- дрожжевой селективный маркер kanMX, фланкированный сайтами lox 66 и lox 71, под контролем дрожжевого TEF промотора;

- ген Cre-рекомбиназы фага Р1 под контролем nmt1 промотора;

- область для интеграции - фрагменты нуклеотидной последовательности гена алкогольдегидрогеназы adh1 дрожжей S. Pombe;

- селективный маркер для клеток E. coli - ген bla, кодирующий β-лактамазу, придающий клеткам устойчивость к ампициллину;

- бактериальный pUC origin.

Дрожжи S. pombe трансформируют плазмидной ДНК padh1-nmt1-Cre, линеаризованной эндонуклеазами рестрикции Sac1, Kpn1, методом электропорации (http://www-bcf.usc.edu/~forsburg/tfmn.html).

Селекцию трансформантов ведут на агаризованной среде YES (http://www-bcf.usc.edu/~forsburg/media.html) с добавлением глюкозы (2 мас. %) в течение 5 суток при температуре 30°С. В качестве селективного агента добавляют антибиотик G418 в количестве 130 мкг/мл.

Отбирают трансформант с отключенным геном adh1 по стандартной методике [http://www-bcf.usc.edu/~forsburg/disruptions.html].

Выщепление маркерного гена kanMX по loxP-сайтам из хромосомы трансформанта S. pombe осуществляют за счет индукции синтеза Cre-рекомбиназы методом [Biosci. Biotechnol. Biochem., 68 (3), 545-550, 2004].

1.2. Последовательное трехкратное введение гена ldh лактатдегидрогеназы из Lactobacillus plantarum в состав хромосомы трансформанта S. pombe

Последовательное трехкратное введение гена ldh лактатдегидрогеназы из Lactobacillus plantarum в состав хромосомы трансформанта S. pombe осуществляют путем трансформации плазмиды pCMV-pla-Tf1. Плазмиду pCMV-pla-Tf1 получают методом клонирования [Sambrook J., Maniatis Т., Fritsch Е. Molecular cloning: a laboratory manual. - N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory, 1989] в полилинкер коммерческого вектора pUC19 следующих генетических элементов:

- дрожжевой селективный маркер kanMX, фланкированный сайтами lox 66 и lox 71, под контролем дрожжевого TEF промотора;

- фрагмент ДНК (ген ldh Lactobacillus plantarum) под контролем CMV промотора;

- область для интеграции - нуклеотидная последовательность ретротранспозона Тf1;

- селективный маркер для клеток E. coli - ген bla, кодирующий β-лактамазу, придающий клеткам устойчивость к ампициллину;

- бактериальный pUC origin.

Клетки трансформанта S. pombe трансформируют плазмидной ДНК pCMV-pla-Tf1, линеаризованной эндонуклеазами рестрикции BamH1, Nae1, методом электропорации (http://www-bcf.usc.edu/~forsburg/tfmn.html).

Селекцию трансформантов осуществляют, как описано в п. 1.1.

Продукцию молочной кислоты трансформантами первоначально оценивают в чашечном тесте с добавлением мела по зонам гидролиза. В тесте используют агаризованную среду LA (мас. %: дрожжевой экстракт - 0,5, пептон - 1, агар - 2, вода - остальное) с добавлением глюкозы (2 мас. %) и мела (0,5 мас. %). В качестве контроля используют штамм Schizosaccharomyces pombe Y-3106.

Наиболее продуктивные трансформанты, показавшие наибольшее соотношение диаметра зоны гидролиза к диаметру колонии на чашках с мелом, отбирают и используют для выщепления маркерного гена kanMX по способу [Biosci. Biotechnol. Biochem., 68 (3), 545-550, 2004].

Трансформанты, потерявшие маркерный ген, культивируют в жидкой питательной среде для определения продукции молочной кислоты.

Посевную культуру выращивают в пробирках (50 мл) с 10 мл жидкой питательной среды YPD с добавлением глюкозы (2 мас.%) при 30°С в течение 24 ч на качалке с 250 об/мин. Посев ферментационной среды осуществляют в соотношении 1/10 об.

Ферментацию проводят при 30°С на качалке с 150 об/мин в питательной среде состава (мас.%): дрожжевой экстракт - 0,5, пептон - 1, вода - остальное, с добавлением глюкозы (18 мас.%) в пробирках (50 мл) с рабочим объемом 5 мл. Ферментацию продолжают в течение 48 часов.

Концентрацию молочной кислоты определяют согласно методу ВЭЖХ [Acta Biotechnol. 1990. v. 10 (5) p. 459-468]. Концентрацию этанола определяют согласно методу ГХ [Chromatogr. Sci. 2009. v. 47 (4). p. 272-278].

По результатам ферментации отбирают наиболее продуктивный трансформант.

Введение фрагмента ДНК, кодирующего аминокислотную последовательность гена ldh Lactobacillus plantarum, в состав хромосомы дрожжей S. pombe проводят последовательно еще дважды способом, описанным выше. Однако для трансформации на каждом этапе используют клетки наиболее продуктивного трансформанта, отобранного в конце каждого этапа.

В результате получают трансформанты, в которых инактивирован ген алкогольдегидрогеназы adh1, а в хромосому интегрировано несколько копий гена лактатдегидрогеназы из Lactobacillus plantarum. Отбирают трансформант, способный продуцировать молочную кислоту в количестве 69 г/л, а этанол - 13 г/л за 48 ч культивирования. Трансформант депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) как штамм Schizosaccharomyces pombe A4Km- - продуцент молочной кислоты, регистрационный номер ВКПМ Y-4224.

Пример 2. Культивирование штамма Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-2424

Посевную культуру выращивают при 30°С в течение 2 суток на чашках Петри на агаризованной среде YPD с добавлением глюкозы (2 мас. %).

Для получения инокулята пробирки (50 мл) с 10 мл жидкой питательной среды YPD с добавлением глюкозы (2 мас. %) засевают посевной культурой. Пробирки инкубируют на качалке (250 об/мин) при 30°С в течение 24 ч.

Колбу объемом 750 мл, содержащую 95 мл жидкой среды состава (мас. %): дрожжевой экстракт - 0,5, пептон - 1, вода - остальное с добавлением глюкозы (18 мас. %), засевают 5 мл инокулята.

Культивирование осуществляют на качалке со скоростью 250 об/мин при температуре 30°С в течение 96 часов. Пробы отбирают каждые 12 часов стерильно по 1 мл для определения концентрации биомассы и молочной кислоты в культуральной жидкости, а также контроля стерильности. Штамм Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-4224 секретирует молочную кислоту в количестве 100 г/л культуральной жидкости культивирования, продукция побочного продукта этанола составляет 8 г/л.