Результат интеллектуальной деятельности: ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЙ БИОСЕНСОР ДЛЯ ПРЯМОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИОГЛОБИНА, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ

Изобретение относится к области клинической биохимии и аналитической химии и касается электрохимического биосенсора для прямого определения миоглобина, способа его получения.

Изобретение может быть использовано в медицинской практике для диагностики ранних стадий инфаркта миокарда. Ранняя диагностика сердечно-сосудистых заболеваний, занимающих первое место среди всех случаев смерти, является одним из основных факторов их успешного лечения. Открытие новых биохимических маркеров острого инфаркта миокарда (ОИМ) определило потребность в разработке точных и экспрессных методов их определения, в результате чего были предложены новые биохимические диагностики и стратегии лечения ОИМ [1, 2].

К белковым маркерам ОИМ относят тропонины, сердечную изоформу креатинфосфокиназы и миоглобин (МБ). В настоящее время сердечные тропонины считаются наиболее специфичными маркерами ОИМ-диагностики. Однако МБ является ранним маркером ОИМ, обнаруживается уже через 2 часа. При повреждении сердечной мышцы из-за малой молекулярной массы (17,8 кДа) МБ быстро высвобождается в кровь, выводится в неизменном виде с мочой, поэтому его концентрация зависит от функции почек. При ОИМ концентрация МБ резко повышается от нормы (женщины 12-76 нг/мл, мужчины 19-92 нг/мл) до 1500 нг/мл. По уровню миоглобина можно судить об обширности ОИМ, т.е. при инфаркте миокарда выраженность гипермиоглобинемии находится в прямой зависимости от размеров очага некроза. Однако миоглобин менее специфичен по сравнению с другими сердечными маркерами, его уровень может повышаться не только вследствие ОИМ, но и из-за других факторов, таких как мышечная травма или повреждение почек, поэтому для подтверждения наличия некроза миокарда при повышенной концентрации МБ необходимо проводить дополнительное определение специфичных маркеров ОИМ [3].

Среди методов определения МБ наиболее широко используется иммунохимический подход, реализованный в виде твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с хемилюминесцентной детекцией [4], турбодиметрического метода [5, 6], усиления флуоресценции на пленках серебряных частиц. Амперометрический иммуносенсор для детекции миоглобина в цельной крови был разработан на основе прямого одностадийного и непрямого одностадийного и двустадийного сэндвич-анализа с использованием щелочной фосфатазы в качестве ферментативной метки [7].

Среди коммерчески доступных методов качественного определения миоглобина [8] можно выделить системы для RAMP^® (Response Biomedical Corp., Канада) [9-11], Triage^® (Biosite Inc.), Cardiac M test (Roche Diagnostics) и Status^® CS (Dade Behring). Количественное определение миоглобина может быть осуществлено с помощью коммерчески реализованной системы Cardiac STATus^® (Spectral Diagnostics Inc.) [8].

Однако все вышеперечисленные методы анализа миоглобина обладают недостатками, а именно представленные методики являются достаточно сложными, длительными по времени, кроме того, они не являются безреагентными, и с их помощью удается определить лишь ограниченный диапазон концентраций миоглобина. Использование электрохимических биосенсоров безреагентной регистрации весьма перспективно для решения проблемы определения миоглобина, поскольку в данном случае отсутствуют дополнительные стадии добавления/инкубации, нет необходимости в получении меченых антител миоглобина. Кроме того, данная стратегия перспективна по причине экспрессности анализа, что крайне востребовано в ранней клинической диагностике ОИМ.

Прямой перенос электрона между электродом и редокс-активным белком является не только инструментом их изучения, но и может быть использован для изготовления биосенсоров для определения белка. Среди различных редокс-активных белков гемопротеины являются наиболее исследованными. Для иммобилизации гемопротеинов на поверхности электрода используют водонерастворимые поверхностно-активные вещества (ПАВ) [12], полимерные гидрогели [13], наночастицы [14-16], фиброин шелка [17], липиды [18].

Целью настоящего изобретения является разработка безреагентного электрохимического биосенсора для определения миоглобина в водных растворах.

Электрохимический биосенсор для безреагентного определения миоглобина изготавливается на основе одноразовых электродов, полученных методом трафаретной печати. Метод анализа основан на биоаффинном взаимодействии антител к миоглобину сердечной мышцы человека с миоглобином с последующей электрохимической регистрацией гемопротеина. В соответствии с изобретением описывается электрохимический биосенсор для диагностики ранней стадии инфаркта миокарда путем прямого определения миоглобина из сердечной мышцы человека, представляющий собой одноразовый графитовый электрод, модифицированный коллоидным золотом и моноклональными антителами к миоглобину из сердечной мышцы человека.

Описывается также способ получения электрохимического биосенсора, представляющего собой одноразовый графитовый электрод, модифицированный коллоидным золотом и моноклональными антителами к миоглобину из сердечной мышцы человека.

Способ заключается в том, что на трехконтактный графитовый рабочий электрод наносят раствор коллоидного золота, стабилизированный дидодецилдиметиламмоний бромидом в хлороформе, и сушат при комнатной температуре с последующей модификацией электродной структуры антителами против миоглобина из сердечной мышци человека путем помещения на модифицированный дидодецилдиметиламмоний бромидом и коллоидным золотом рабочий графитовый электрод моноклональных антител против миоглобина из сердечной мышцы человека с последующей сушкой, выдерживанием при 2÷6°С, промывкой водой, обработкой блокирующим буфером, сушкой, выдерживанием при комнатной температуре и промывкой водой.

В качестве блокирующего буфера используют 1% альбумин, 0,05% Твин-21 в 0,1М калий-фосфатном буфере, рН 7,4.

Описывается также способ диагностики ранних стадий инфаркта миокарда путем прямого определения миоглобина из сердечной мышцы человека.

Диагностирование острого инфаркта миокарда на ранней стадии основано на том, что в крови пациентов резко возрастает концентрация миоглобина из сердечной мышцы. По разным данным концентрация миоглобина может возрасти в среднем от нормального значения 10-200 нг/мл до 1000-1500 нг/мл.

Предложенный метод определения миоглобина основан:

1) на использовании заранее приготовленных электродов с нанесенными специфическими моноклональными антителами к миоглобину из сердечной мышцы человека;

2) на нанесении на такой электрод с антителами анализируемой биологической жидкости (например, плазмы или сыворотки крови пациента);

3) на измерении максимальной амплитуды тока квадратноволновых вольтамперограмм;

4) на определении концентрации миоглобина по калибровочному графику (<200 нг/мл - норма; >200 нг/мл - патология ОИМ).

При модификации электрода мембраноподобным поверхностно-активным дидодецилдиметиламмоний бромидом (ДДАБ), наночастицами золота и антителами против миоглобина из сердечной мышцы человека регистрируется прямое электрохимическое восстановление активного центра миоглобина при определении гемопротеина. Модификация электрода открыла возможность использования антител к миоглобину сердечной мышцы человека в качестве элемента биораспознавания биосенсора. Исследование аналитических характеристик разработанного устройства показало, что биосенсор обладает специфичностью, высокой стабильностью и низким пределом обнаружения 0,25 нМ (4,4 нг/мл) миоглобина. Разработанный биосенсор характеризовался широким рабочим диапазоном определяемых концентраций, достигающим 0,1 мкм (1750 нг/мл) и покрывающим клинический диапазон концентраций.

ПРИМЕР 1. Способ получения биосенсора

Для приготовления биосенсоров используют трехконтактные электродные структуры, полученные методом трафаретной печати (ООО НИИ «ЭЛКОМ», Россия) с графитовыми рабочим и вспомогательным электродами и хлорсеребряным внутренним электродом сравнения. Диаметр рабочего электрода 2 мм.

На первом этапе проводят модификацию графитового рабочего электрода коллоидным золотом. Для этого на рабочий графитовый электрод помещают 2 мкл раствора коллоидного золота, стабилизированного ДДАБ (Sigma-Aldrich) в хлороформе (ДДАБ/Au). Метод получения раствора коллоидного золота описан в

[19]. Затем электрод сушат в течение 30 минут на воздухе при комнатной температуре. Далее проводят модификацию электрода антителами против миоглобина из сердечной мышцы человека. Для этого на рабочий электрод, модифицированный ДДАБ/Au, помещают 2 мкл раствора моноклональных антител против миоглобина из сердца человека (Biodesign International) нужной концентрации. Далее электрод сушат в течение 10 минут и выдерживают в течение 12 часов при 2÷6°С. Затем электрод промывают 3 раза дистиллированной водой для удаления избытка антител. В завершение электрод обрабатывают блокирующим буфером (1% альбумин (CalBioChem), 0,05% Твин-21 в 0,1 М калий-фосфатном буфере, рН 7,4) для снижения влияния неспецифического связывания. Для этого на модифицированный антителами электрод наносят 2 мкл блокирующего буфера. Затем электрод сушат в течение 10 минут и выдерживают в течение 12 часов при 2÷6°С или 2 часа при комнатной температуре. В завершение электрод промывают 3 раза дистиллированной водой.

ПРИМЕР 2. Проведение реакции связывания миоглобина

Для проведения реакции связывания антигена на электрод с иммобилизованными антителами наносят 2 мкл раствора миоглобина из миокарда человека (Sigma-Aldrich, чистота 95%) или миоглобина скелетных мышц кита (Sigma), или цитохром С из сердца быка (Merck) нужной концентрации (0-1750 нг/мл, 0-100 нМ). Далее электрод помещают в закрытую емкость и выдерживают 30 минут при 37°С. Затем электрод промывают 3 раза дистиллированной водой для удаления несвязанных с антителами молекул.

ПРИМЕР 3. Исследование специфичности откликов биосенсора

Для исследования аналитических характеристик использовали вольтамперные отклики датчика, регистрируемые с помощью квадратно-волновой вольтамперометрии (амплитуда 50 мВ, частота 10 Гц). На фиг.1 представлены кривые, зарегистрированные после инкубации электродов, модифицированных антителами (2 мкл раствора антител с концентрацией 70 мкг/мл), в растворах с концентрацией 1 мкм миоглобина из сердца человека (1), миоглобина из скелетных мышц кита (2), в растворе цитохрома С (3).

В случае инкубации с раствором миоглобина из сердца человека наблюдается катодный максимум тока, соответствующий редокс-активности миоглобина. В остальных случаях появления максимума не наблюдается. Таким образом, разрабатываемый датчик обладает достаточной специфичностью для определения миоглобина из сердца человека. Исследование устойчивости отклика разработанного электрохимического биосенсора показало удовлетворительную стабильность: после трех дней хранения при 4°С отклик датчика снизился на 4%.

ПРИМЕР 4. Построение калибровочного графика для определения концентрации миоглобина в водных растворах

На фиг.2 представлен калибровочный график определения миоглобина с помощью разработанного электрохимического биосенсора. Приведена максимальная амплитуда тока квадратноволновых вольтамперограмм, скорректированная по базовой линии. Нижний предел обнаружения, определяемый как концентрация, при которой измеряемый отклик трехкратно превышает стандартное отклонение единичного измерения на предельно низкой концентрации, составил 0,25 нМ (4,4 нг/мл), что существенно лучше, чем аналитические характеристики систем для определения миоглобина на основе капиллярного электрофореза и одноразовых иммунохроматографических полосок с флуоресцентной регистрацией. В отличие от прямого сэндвич-анализа с амперометрической регистрацией рабочий диапазон разработанного датчика находится в области 4,4-1750 нг/мл и вполне перекрывает клинический диапазон определяемых концентраций миоглобина 80-800 нг/мл.

ПРИМЕР 5. Определение концентрации миоглобина

Готовят раствор миоглобина известной концентрации (1750 нг/мл). На рабочий электрод с моноклональными антителами к миоглобину из сердца человека, полученный по примеру 1, наносят 2 мкл раствора миоглобина, приготовленного разведением исходного раствора. Далее электрод помещают в закрытую емкость и выдерживают 30 минут при 37°С. Затем электрод промывают 3 раза дистиллированной водой для удаления несвязанных с антителами молекул. Измеряют максимальную амплитуду тока квадратноволновых вольтамперограмм. По полученному в примере 4 калибровочному графику определяют содержание миоглобина в пробе.

Литература

1. V.Bhayana and A.R.Henderson, Clin. Biochem. 28:1 (1995).

2. H.Keffer, Am. J. Clin. Pathol. 105:305 (1996).

3. J.Alpert and K. Thygesen, J. Am. Coil. Cardiol. 36:959 (2000).

4. M.Рубцова, Г.В.Преснова, Т.А.Пастухова, Е.М.Гаврилова, A.M.Егоров, ЗАО "НИИ Иммунотех", Москва.

5. J.М.Singer and С.М.Plotz, Amer. J. Med. 21:888 (1956).

6. J.P.Galvin, in Clin. Lab. Assays 4th, 1983, p.73.

7. Т.M.O'Regan, L.J.O'Riordan, M.Pravda, С.K.O'Sullivan, and G.G.Guilbault, Analytica Chimica Acta 460:141 (2002).

8. Z.Yang and D.M.Zhou, Clinical Biochemistry 39:771 (2006).

9. D.E.Brooks, D.V.Devine, P.C.Harris, J.E.Harris, M.E.Miller, A.D.Olal, L.J.Spiller and Z.C.Xie, Clin. Chem. 45:1676 (1999).

10. D.Rogic, M.Radic, G.Fressl and M.Fucek, Point of care: the journal of near-patient testing and technology 4:24 (2005).

11. A.H.B.Wu, A.Smith, R.H.Christenson, M.M.Murakami and F.S.Apple, Clin. Chim. Acta 346:211 (2004).

12. J.F.Rusling and A.F.Nassar, J.Am. Chem. Soc. 115:11891 (1993).

13. L. Shen, R.Huang and N.Hu, Talanta 56:1131-1139 (2002).

14. X.J.Han, W.L.Cheng, Z.L.Zhang, S.J.Dong, and E.K.Wang, Biochimica et biophysica acta-bioenergetics 1556:273 (2002).

15. G.C.Zhao, L.Zhang, X.W.Wei and Z.S.Yang, Electrochem. Commun. 5:825 (2003).

16. S.Q.Liu, Z.H.Dai, H.Y.Chen, and H.X.Ju, Biosens. Bioelectron. 19:963 (2004).

17. Y.Wu, Q.Shen and S.Hu, Analytica Chimica Acta 558:179 (2006).

18. A.E.F.Nassar, Y.Narikiyo, T.Sagara, N.Nakashima and J.F.Rusling, Journal of the chemical society-faraday transactions 91:1775 (1995).

19. V.V.Shumyantseva, T.V.Bulko, Yu.O.Rudakov, G.P.Kuznetsova, N.F.Samenkova, A.V.Lisitsa, I.I.Karuzina, A.I.Archakov, J. Inorg. Biochem., 101:859-865 (2007).