Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНОВ ДЛЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ВИРУСОВ ГРИППА

Способ относится к биотехнологии, иммунологии и медицине и может быть использован для производства гриппозной вакцины, которая может найти применение для профилактики гриппа среди населения с целью снижения риска заболевания и осложнений.

Известен способ получения поверхностных антигенов вируса гриппа по патенту США №4140762, основанный на методе ультрацентрифугирования. Недостатком данного способа является отсутствие в вакцине внутренних антигенов, что снижает ее эффективность, а также использование энергозатратного и капиталоемкого ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы.

Известен способ получения расщепленных антигенов по патенту США №4327182, основанный на методе выделения антигенов с помощью мембранных фильтров с различным диаметром пор. Недостаток данного способа - недостаточная очистка выделенных вакцинных антигенов от примесей вирусных липидов и детергента, хотя метод имеет высокую экономичность.

В настоящее время в практике здравоохранения для массовой профилактики гриппа используется вакцина "Гриппол", представляющая собой стерильный очищенный от балластных веществ комплекс протективных поверхностных белков гемагглютинина и нейраминидазы вирусов гриппа A₁(H1N1), А₂(Н3N2) и В, связанных с синтетическим высокомолекулярным иммуномодулятором полиоксидонием. Способ получения антигенов для этой вакцины по патенту РФ №2164148 и взят за прототип.

Способ осуществляют в следующей последовательности:

1. Получение неочищенного вирусного концентрата.

2. Очистка вирусного концентрата методом ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы.

3. Расщепление вирусного концентрата детергентом тетрадецилтриметил аммоний бромидом (ТТАБ).

4. Выделение вакцинных антигенов методом ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы.

5. Получение стерильного полуфабриката вакцины.

Недостатки способа:

1. В составе вакцины, полученной по способу-прототипу, представлены только поверхностные антигены вируса гриппа, что снижает протективные возможности вакцины, а именно снижают защиту от перекрестных эпидемических штаммов.

2. Для расщепления цельных вирионов используется детергент ТТАБ, обладающий достаточной высокой токсичностью.

4. Способ достаточно длителен по времени. Так, для получения очищенных субъединиц методом ультрацентрифугирования необходимо 72 часа.

5. Способ требует значительных энергозатрат, т.к. использование ультрацентрифуг приводит к значительным затратам энергии.

6. Способ требует значительных капиталозатрат на оборудование в связи с использованием дорогостоящих ультрацентрифуг.

Технический результат - повышение профилактических свойств вакцины, снижение капиталозатрат и энергозатрат, ускорение технологического процесса.

Согласно изобретению технический результат обеспечивается за счет того, что в отличие от известного способа получения антигенов для вакцины против вируса гриппа, включающего получение неочищенного вирусного концентрата, очистку вирусного концентрата, расщепление вирусного концентрата детергентом, выделение вакцинных антигенов, в данном способе очистка вирусного концентрата проводится методом гель-фильтрации на носителе Диол-500, далее вирусный концентрат расщепляют детергентом β-октилглюкозидом, а выделение вакцинных антигенов проводят методом гель-фильтрации на носителе Сефадекс G-50.

Преимущества предложенного способа заключаются в повышении профилактических свойств вакцины за счет увеличения протективных возможностей вакцины и повышения защиты от перекрестных эпидемических штаммов, в использовании не токсичного и высокоэффективного детергента β-октилглюкозида. Кроме того, обеспечено ускорение процесса получения вакцины и снижение энерго- и капиталозатрат.

Причинно-следственная связь между новой совокупностью признаков и техническим результатом.

Для расщепления вирионов вирусов гриппа впервые в мировой производственной практике используется детергент β-октилглюкозид (свидетельство о государственной регистрации серия ВТ №001297), представляющий собой химическое вещество с химической формулой C₁₄H₂₈O₆.

Данный детергент дает возможность более полно расщепить вирус гриппа, что позволяет одновременно выделять как поверхностные, так и внутренние антигены вируса гриппа. Кроме того, β-октилглюкозид практически не образует мицел в водных растворах и поэтому легко отделяется от антигенов вируса гриппа после расщепления вирионов. Это дает возможность использовать метод гель-фильтрации для выделения вакцинных антигенов, β-октилглюкозид имеет в 10 раз меньшую токсичность по сравнению с детергентом ТТАБ, используемым при производстве вакцины против вируса гриппа "Гриппол", что позволяет снизить реактогенность вакцины.

Увеличился срок протективного действия вакцины за счет увеличения защиты от перекрестных эпидемических штаммов, так как удалось одновременно включить в состав вакцины не только поверхностные антигены вирусов гриппа, но и внутренние антигены, а именно мембранный белок и белок нуклеокапсида, избежав при этом процесса денатурации этих белков.

Для выделения вакцинных антигенов используется метод промышленной гель-фильтрации, что значительно экономичнее, чем ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы за счет резкого снижения энерго- и капиталозатрат. Благодаря этому также сокращено время от расщепления вируса до получения стерильного полуфабриката до 12 часов, тогда как для получения очищенных субъединиц методом ультрацентрифугирования необходимо 72 часа.

Подробное описание способа.

1. Приготовление неочищенного вирусного концентрата.

Для приготовления посевного вирусного материала в бутыль с 0,1% раствором пептона вводят маточный материал. Скорлупу эмбрионов в предбокснике обрабатывают 2% спиртовым раствором йода и обжигают факелом, смоченным в 96% спирте. С помощью шприца через отверстие на тупом конце яйца в каждый эмбрион вводят по 0,2 мл посевного вирусного материала. После парафинирования зараженные эмбрионы поступают в термальные комнаты, где инкубируются в технологическом режиме, указанном в паспорте на соответствующий штамм.

По окончании периода инкубации эмбрионы овоскопируют, отбирают подвижные с хорошо развитой сетью кровеносных сосудов и помещают их в холодильную камеру для охлаждения (t - 2°С, продолжительность 18 часов).

Папки с охлажденными эмбрионами доставляют в предбоксник, где проводят дезинфекцию скорлупы 2% спиртовым раствором йода и обжигают факелом, смоченным в 96% спирте.

В боксе стерильным пинцетом снимают часть скорлупы над воздушным мешком и прилежащий участок хорионаллантоисной оболочки. ВАЖ из зараженных эмбрионов собирают с помощью стерильных пипеток во флаконы, которые затем перекрывают резиновыми пробками и помещают в холодильник.

ВАЖ из флаконов сливают в 10-ти литровые бутыли через воронки с марлевыми фильтрами до 8-ми литровой отметки. В каждую бутыль добавляют формалинизированные эритроциты в объеме, определяемом по титрам гемагглютининов (в дальнейшем ГА) ВАЖ. При титре ВАЖ 1:512 в 0,2 мл добавляют эритроциты в количестве, составляющем 4% от объема ВАЖ. После тщательного перемешивания бутыли помещают в холодильную камеру на 16 часов. По истечению указанного срока декантируют надосадочную жидкость при условии содержания в ней вируса гриппа в титрах не выше 1:8.

В бутыли с осадком эритроцитов добавляют до 8-ми литровой отметки охлажденный до появления кристаллов льда физраствор. После тщательного перемешивания бутыли вновь помещают в холодильную камеру на 18 часов. Если титр ГА в надосадочной жидкости не превышает 1:8, ее вновь декантируют.

В бутыли с осадком эритроцитов добавляют физраствор, подогретый до 37°С в объеме 300 мл. После тщательного перемешивания эритроциты разливают во флаконы по 350 мл, которые помещают в водяную баню (t - 38°С) на 3 часа. Через каждые 10 минут содержимое флаконов энергично встряхивают. Теплые флаконы переносят в центрифугу и центрифугируют при 2,0 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость элюата сливают во флаконы и берут выемки для контрольных исследований.

Концентрированно элюата осуществляют на установке "Сартикон-мини" с двумя кассетными модулями с размером пор 100 нм в тангенциальном потоке. Непосредственно перед работой установку и систему трубопроводов стерилизуют 3% раствором формалина, отмывают стерильной дистиллированной водой и восстанавливают рН с помощью трис-буфера до 7,2.

Стерильный элюат сливают в 5-ти литровую бутыль, которую через насос подключают на вход системы, возврат ультрафильтрационной системы с кассетными модулями подсоединяют к этой же бутыли.

2. Очистка вирусного концентрата.

Очистку проводят методом гель-фильтрации на хромотографическом носителе Диол-500 (фирма "БиоХимМак", Россия.).

Колонку с носителем Диол-500 отмывают от 3% раствора формалина дистиллированной водой. Уровень рН восстанавливают трис-буферным раствором до 7,2. К "входу" колонки через сифон присоединяют флакон с концентратом элюата. Скорость фильтрации 0,12 л/м² в минуту. В процессе пропускания через колонку хромотографического буфера на "выходе" отбирают пробу. Контроль белковых пиков проводится по прибору "Увикорд" (фирма "LKB", Швеция).

3. Расщепление вирусного концентрата.

Очищенный вирусный концентрат обрабатывают детергентом β-октилглюкозидом следующим образом. Предварительно определяют количество белка в концентрате. Затем в зависимости от количества белка делают навеску детергента в соотношении 1:10 к вирусному белку.

Время контакта - 25 мин при постоянном перемешивании, температура инкубации - комнатная.

4. Выделение вакцинных антигенов.

Выделение вакцинных антигенов проводят методом гель-фильтрации на хромотографическом носителе Сефадекс G-50 (фирма "Pharmacea" Швеция) следующим образом. Колонку с Сефадексом отмывают от 3% раствора формалина дистиллированной водой. Уровень рН восстанавливают фосфатно-буферным раствором до рН 7,2. К "входу" колонки через сифон присоединяют флакон с раствором разрушенного концентрата вируса. Скорость фильтрации 0,12 л/м² в минуту. В процессе пропускания через колонку хромотографического буфера на "выходе" отбирают пробу. Контроль белковых пиков проводят по прибору "Увикорд" (фирма "LKB", Швеция).

5. Получение стерильного полуфабриката для вакцины.

Выделенные вакцинные антигены для получения стерильного полуфабриката стерилизуются через фильтр "Сартобран" фирмы "Владисарт" (Россия). Для этого бутыль с раствором антигенов подсоединяют к "входу" установки. Давление подается в бутыль аквариумным насосом. Отбор проб ведется с "выхода" установки во флаконы под колпаком.

Время проведения стерильной фильтрации 2 часа. Время от расщепления вируса до получения полуфабриката не более 12 часов.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Пример. Получение полуфабрикатов (антигенов) для проведения Государственных клинических испытаний на добровольцах.

Получение полуфабриката А₁

7200 штук 10-ти дневных куриных эмбрионов были заражены маточным материалом штамма A₁. После инкубирования в термальной комнате 48 часов при температуре 37°С и охлаждения 18 часов в холодильной камере при температуре 4°С был получена вируссодержащая аллантоисная жидкость (ВАЖ) в количестве 48 литров с титром гемагглютинирующей активности (ГА) 1:512.

Этот объем ВАЖ слит в 10 литровые бутыли по 8 литров в каждую и добавлены эритроциты, в объеме 4% от объема ВАЖ. После декантации надосадочной жидкости через 18 часов и отмывки физраствором со льдинками в осадок эритроцитов добавлено по 300 мл теплого 37°С физраствора, розлито во флаконы по 350 мл. Флаконы помещены в водяную баню при температуре 37°С на 3 часа. Прогретые флаконы центрифугировались при 2,0 тыс. об/минуту в течение 30 минут. После центрифугирования надосадочная жидкость была слита в бутыль и в ней определена ГА, которая составила 1:8000. Объем элюата составил 2,7 л.

Элюат концентрировался на установке "Сартикон-мини" с кассетными модулями размером пор 100 нм до 300 мл. Очистка от примесных белков была проведена на хроматографической колонке с носителем Диол-500 с объемом 2,0 литра. Объем очищенного концентрата составил 400 мл. Содержание белка в нем было 200 мкг/мл, концентрация гемагглютинина составляла по ОРИД 100 мкг/мл, овальбумин отсутствовал.

На разрушение вируса было взято 200 мл глицеринового концентрата и добавлено 400 мг β-октилглюкозида. Выделение вакцинных антигенов (сплита) проводили на колонке с сефадексом с объемом 1 литр, объем выделенного сплита составил 290 мл. Для проведения стерилизующей фильтрации были использованы фильтры-капсулы "Сартобран". Содержание общего белка в полуфабрикате было 180 мкг/мл, гемагглютинина по ОРИД было 88 мкг/мл.

Время от разрушения вируса до получения полуфабрикатов 11 часов.

Получение полуфабриката А₂

7200 штук 10-ти дневных куриных эмбрионов были заражены маточным материалом штамма А₂. После инкубирования в термальной комнате 48 часов при температуре 37°С и охлаждения 18 часов в холодильной камере при температуре 4°С была получена вируссодержащая аллантоисная жидкость (ВАЖ) в количестве 48 литров с титром гемагглютинирующей активности (ГА) 1:256.

Этот объем ВАЖ слит в 10 литровые бутыли по 8 литров в каждую и добавлены эритроциты, в объеме 2% от объема ВАЖ. После декантации надосадочной жидкости через 18 часов и отмывки физраствором со льдинками в осадок эритроцитов добавлено по 300 мл теплого 37°С физраствора, розлито во флаконы по 350 мл. Флаконы помещены в водяную баню при температуре 37°С на 3 часа. Прогретые флаконы центрифугировались при 2,0 тыс. об/минуту в течение 30 минут. После центрифугирования надосадочная жидкость была слита в бутыль и в ней определена ГА, которая составила 1:4000. Объем элюата составил 3,4 л.

Элюат концентрировался на установке "Сартикон-мини" с кассетными модулями размером пор 100 нм до 300 мл. Очистка от примесных белков была проведена на хроматографической колонке с носителем Диол-500 с объемом 2 литра. Объем очищенного концентрата составил 400 мл. Содержание белка в нем было 250 мкг/мл, гемагглютинина было по ОРИД 151 мкг/мл, овальбумин отсутствовал.

На разрушение вируса было взято 200 мл глицеринового концентрата и добавлено 500 мг β-октилглюкозида. Выделение вакцинных антигенов проводилось на хромотографической колонке с Сефадекс G-50 с объемом 1,0 литр, объем выделенного сплита составил 300 мл. Для проведения стерилизующей фильтрации были использованы фильтры-капсулы "Сартобран". Содержание белка в полуфабрикате было 270 мкг/мл, Гемаглютинина по ОРИД было 130 мкг/м.

Время от разрушения вируса до получения полуфабрикатов - 11 часов.

Получение полуфабриката В

8260 штук 10-ти дневных куриных эмбрионов были заражены маточным материалом штамма А₂. После инкубирования в термальной комнате 72 часа при температуре 33°С и охлаждения 18 часов в холодильной камере при температуре 4°С была получена вируссодержащая аллантоисная жидкость (ВАЖ) в количестве 40 литров с титром гемагглютинирующей активности (ГА) 1:256.

Этот объем ВАЖ слит в 10 литровые бутыли по 8 литров в каждую и добавлены эритроциты, в объеме 2% от объема ВАЖ. После декантации надосадочной жидкости через 18 часов и отмывки физраствором со льдинками в осадок эритроцитов добавлено по 300 мл теплого 37°С физраствора, розлито во флаконы по 350 мл. Флаконы помещены в водяную баню при температуре 37°С на 3 часа. Прогретые флаконы центрифугировались при 2,0 тыс. об/минуту в течение 30 минут. После центрифугирования надосадочная жидкость была слита в бутыль и в ней определена ГА, которая составила 1:4000. Объем элюата составил 2,0 л.

Элюат концентрировался на установке "Сартикон-мини" с кассетными модулями размером пор 100 нм до 300 мл. Очистка от примесных белков была проведена на хроматографической колонке с носителем Диол-500 с объемом 2 литра. Объем очищенного концентрата составил 400 мл. Содержание белка в нем 290 мкг/мл, гемагглютина по ОРИД было 150 мкг/мл, овальбумин отсутствовал.

На разрушение вируса было взято 200 мл глицеринового концентрата и добавлено 580 мг β-октилглюкозида. Выделение антигенов проводили на колонке с сефадексом объемом 1,0 литра. Объем сплита составил 310 мл.

Для проведения стерилизующей фильтрации были использованы фильтры-капсулы "Сартобран". Содержание белка в полуфабрикате было 400 мкг/мл, Гемаглютинина по ОРИД было 200 мкг/мл.

Время от разрушения вируса до получения полуфабрикатов - 12 часов.

Государственные клинические испытания на добровольцах полученных полуфабрикатов (антигенов) в составе экспериментальной вакцины

Добровольцы методом случайной выборки были распределены на II группы, лица одной группы (133 человека) были вакцинированы экспериментальной вакциной, состоящей из трех полученных полуфабрикатов. Одна вакцинирующая доза этой вакцины содержала 10 мкг по гемагглютинину полуфабриката A₁, 10 мкг по гемагглютинину полуфабриката А₂ и 15 мкг по гемагглютинину полуфабриката В. Лица второй контрольной группы (132 человека) были вакцинированы препаратом "плацебо" (контрольная группа). Перед испытанием вакцина и плацебо были зашифрованы сотрудником ГИСКа им. Л.А.Тарасевича. Добровольцы, отобранные для проведения клинических испытаний, были однократно вакцинированы внутримышечно зашифрованным препаратом в объеме 0,5 мл (объем одной вакцинирующей дозы) в верхнюю треть плеча с помощью шприца.

Реактогенность полученных полуфабрикатов в составе экспериментальной вакцины

Все добровольцы до введения экспериментальной вакцины и препарата "плацебо" были опрошены и осмотрены врачами терапевтами. На каждого была заведена индивидуальная карта наблюдений, в которую вносились результаты ежедневных медицинских осмотров, опросов, измерений температуры тела, общие и местные реакции. Особое внимание обращалось на симптомы, соответствующие клиническим проявлениям гриппа, аллергическим реакциям. Местные реакции оценивались по диаметру гиперемированного участка кожи в месте введения препарата, болезненности, припухлости кожи, наличию инфильтратов, лимфоаденитов, абсцесса.

Наблюдения за привитыми проводились ежедневно в течение 5-ти дней с момента вакцинации. За лицами, давшими отклонения, наблюдения велись до полного исчезновения этих реакций. Наряду с этим в течении 6 месяцев за привитыми вакциной и контрольной группой проводилась ежемесячная регистрация соматической, инфекционной и аллергической заболеваемости среди наблюдаемого контингента.

Полученные результаты приведены в табл.1, 2, 3.

При сборе анамнеза до вакцинации выявлено, что никто из добровольцев жалоб не предъявлял, кожные покровы и слизистые были чистыми. Температура тела и артериальное давление у всех испытуемых были нормальными. Непосредственно после введения вакцины и "плацебо" местных реакций не отмечалось.

При ежедневной термометрии и осмотре врачом-терапевтом привитые "плацебо" отмечали: недомогание, головную боль, насморк, гиперемию зева, тошноту, боль в животе, что в абсолютных числах составило 6 человек. Из местных реакций болезненность в месте инъекции предъявил 1 человек (табл.1).

У привитых вакциной были жалобы на головную боль, насморк, заложенность носа, всего 3 человека (по одной жалобе). Местные реакции: болезненность в месте инъекции отметили 3 человека и болезненность при надавливании 9 (табл.2).

Повышение температуры от 37,1 до 37,4°С отмечено у 2-х привитых в группе "плацебо", а у 5-ти человек, привитых вакциной, была температура от 37 до 37,3°С. У 4-х человек повышение температуры отмечалось на второй день, на третий день температура свыше 37°С выявлена не была (табл.3).

Из данных, представленных в таблицах, следует, что экспериментальная вакцина обладает слабой реактогенностью.

Антигенная активность полученных полуфабрикатов в составе экспериментальной вакцины

Антигенную активность оценивали в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) по общепринятой методике на основе результатов исследования крови, собранной до вакцинации и после вакцинации через 28 дней. В качестве антигенов для постановки серологических реакций использовали коммерческие диагностикумы, созданные на основе штаммов вирусов гриппа A₁(H₁N₁); A₂(Н₃N₂) и В, которые были рекомендованы ГИСК им. Л.А.Тарасевича.

Антигенная активность вакцин была охарактеризована по следующим показателям:

- четырехкратным сероконверсиям по сравнению с фоновой сывороткой;

- уровню антигенного ответа до и через 28 дней после вакцинации, при этом определяли средние геометрические титры антител (СГТА), кратность нарастания титров по сравнению с фоновой сывороткой;

- уровню серологической защиты путем определения процента лиц с защитным титром антител до и через 28 дней после вакцинации.

Все собранные количественные показатели обрабатывали методами вариационной статистики. Достоверность различий определяли по критерию Стъюдента-Фишера, достоверно значимыми считали различия при Р<0,05.

Полученные результаты при исследовании парных сывороток крови привитых "плацебо" и экспериментальной вакциной с использованием коммерческих диагностикумов представлены в табл.4, 5, 6. Из таблиц видно, что в сыворотках привитых экспериментальной вакциной статистически достоверное (р<0,05) нарастание титров антител выражено у лиц с низким исходным уровнем (<20). Кратность нарастания титров антител к штамму вируса H₁N₁ составляет - 27,9, к Н₃Н₂ - 7,5, к штамму вируса В - 6,5.

В группе с высоким исходным уровнем антител (>40) показатели ниже: к штамму вируса H₁N₁ - 3,7, к штамму вируса H₃N₂ - 3,0 и к штамму вируса В - 2,1.

Частота четырехкратного прироста антител через 28 дней после вакцинации составила для штамма вируса H₁N₁ - 93,7% для штамма вируса H₃N₂ - 90,0% и штамма В - 77,3%. В группе "плацебо" уровень антител в сыворотках крови, взятых до вакцинации и через 28 дней, остался практически без изменений.

Процент лиц с защитным титром антител (>40) (табл.7) составил у привитых вакциной для штамма вируса H₁N₁ до вакцинации - 47,1%, после вакцинации - 95%; для штамма вируса H₃N₂ до вакцинации - 66,4%, после вакцинации - 97,5% и для штамма вируса В до вакцинации - 26,1%, после вакцинации - 88,2%.

В группе "плацебо" защитный титр антител к штамму вируса H₁N₁ до вакцинации составил - 38,9%, после вакцинации - 41,6%; для штамма вируса H₃N₂ до вакцинации - 79,6%, после вакцинации - 82,3% и для штамма вируса В до вакцинации - 32,7%, после вакцинации - 35,4%. Процент лиц с титром >40 для всех штаммов стал несколько выше, чем до вакцинации, но разница между этими показателями статистически не достоверна.

Таким образом, результаты показывают, что экспериментальная вакцина, состоящая из полученных полуфабрикатов A₁, A₂ и В, обладает высокой антигенной активностью для штаммов вирусов A₁, А₂ и В.

Заключение по результатам государственных клинических испытаний на добровольцах полученных полуфабрикатов в составе экспериментальной вакцины

В результате проведенных полевых испытаний в условиях строго контролируемого эпидемиологического опыта установлено, что экспериментальная вакцина, состоящая из полученных полуфабрикатов A₁, А₂ и В, обладает слабой реактогенностью и высокой антигенной активностью в отношении вирусов гриппа A₁, A₂ и В. Полученные результаты позволяют рекомендовать данную экспериментальную вакцину для профилактики гриппа у людей.

Способполученияантигеновдлявакциныпротиввирусагриппа,включающийполучениенеочищенноговирусногоконцентрата,очисткувирусногоконцентрата,расщеплениеегодетергентом,выделениевакцинныхантигенов,отличающийсятем,чтоочисткувирусногоконцентратаосуществляютметодомгель-фильтрациинаносителеДиол-500,вирусныйконцентратрасщепляютдетергентомβ-октилглюкозидом,авыделениевакцинныхантигеновосуществляютметодомгель-фильтрациинаносителеСефадексG-50.