Результат интеллектуальной деятельности: ТЕСТ-СИСТЕМА ИММУНОФЕРМЕНТНАЯ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОКЛЮШНЫХ АНТИТЕЛ В СЫВОРОТКАХ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ

Изобретение относится к биотехнологии и иммунологии и касается разработки и использования иммуноферментной тест-системы для определения коклюшных антител в сыворотках крови людей и животных.

Известен способ определения коклюшных антител, применяемый в практике уже более 50 лет, заключающийся в связывании антител корпускулярными антигенами с выпадением в осадок образовавшегося комплекса (реакция агглютинации). Эта реакция, используемая для оценки постинфекционного и поствакцинального иммунитета, обладает рядом существенных недостатков: невозможность получения точного количественного результата, т.к. учет проводится визуально и поэтому достаточно субъективен; тест очень длителен по времени - учет результатов проводится только через сутки после постановки реакции. К тому же реакция агглютинации не применима в случае оценки иммунного статуса людей, иммунизированных вакцинами, содержащими бесклеточный коклюшный компонент.

Известен способ иммуноферментного определения коклюшных антител, включающий сенсибилизацию твердой фазы одним или несколькими индивидуально очищенными антигенами Bordetella pertussis. Существуют импортные иммуноферментные тест-системы (ИФТС):

1. Human Anti-Pertussis IgG ELISA Assay (XpressBio, USA);

2. Enzyme Immunoassay for the detection of human IgG antibodies against Bordetella Pertussis in serum and plasma (MyBioSourse, Inc., USA);

3. Bordetella Pertussis/toxin IgG ELISA (DRG Instruments GmbH, Germany).

Основным недостатком известных способов является выявление антител только к некоторым антигенам Bordetella pertussis (ИФТС фирмы MyBioSourse выявляет антитела только к токсину (ТН), филаментозному гемагглютинину (ФГА) и липополисахариду (ЛПС), ИФТС фирмы DRG - в основном к ТН). До настоящего времени остается не ясна роль отдельных антигенов Bordetella pertussis в развитии заболевания, а также в отношении их вклада в обеспечение протективной функции иммунопрофилактических препаратов. Так, за последние десятилетия в нескольких многоцентровых исследованиях было установлено, что поверхностно расположенные антигены коклюшных бактерий (фимбрии) и пертактин принимают активное участие в патогенезе коклюшной инфекции и формировании противококлюшного иммунитета. Поэтому использование как можно большего количества коклюшных антигенов для фиксации их на твердой фазе позволяет более полно выявлять спектр специфических антител в сыворотках крови людей. Еще одним недостатком известных способов является то, что антитела выявляются только качественно или полуколичественно (ИФТС фирмы DRG). К тому же в инструкциях к некоторым ИФТС (ИФТС фирмы XpressBio) нет раздела интерпретация результатов, что не позволяет оценить полученные результаты анализа, поскольку нет единого международного стандарта количественного содержания антител к Bordetella pertussis. Таким образом, перечисленные тест-системы не обеспечивают полного выявления всего спектра специфических коклюшных антител в сыворотках крови людей. Кроме того, ни одна из данных ИФТС не может быть использована для определения титров коклюшных антител в сыворотках крови животных.

Отечественных иммуноферментных тест-систем для оценки противококлюшного иммунитета нет.

В качестве ближайшего аналога рассматривается известная тест-система для определения коклюшных антител Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) for the semi-quantitative determination of specific IgG antibodies to Bordetella Pertussis in human serum (Savyon Diagnostics Ltd., Israel).

Данная ИФТС определяет антитела только полуколичественно, и только к токсину (ТН) и филаментозному гемагглютинину (ФГА), что не позволяет выявлять весь спектр специфических антител в сыворотках крови людей. Затрудняет постановку реакции наличие в тест-системе трех буферных растворов (отдельно для промывания планшетов, разведения проб и разведения конъюгата), а также наличие нескольких положительных контролей и калибраторов (откалиброванных в неизвестных единицах).

Задача, решаемая изобретением, состоит в повышении эффективности тест-системы для определения коклюшных антител в сыворотках крови человека и животных.

Технический результат, обеспечивающий решение указанной задачи, заключается в расширении спектра выявляемых антител, в повышении точности результатов анализа, в уменьшении количества реагентов и упрощении процедуры анализа.

Технический результат достигается тем, что в известной тест-системе для определения коклюшных антител в сыворотке крови человека путем сенсибилизации 96-луночного планшета смесью антигенов, добавления к нему контрольных и исследуемых образцов, добавления специфического конъюгата, добавления субстрат-индикаторного раствора, добавления стоп-реагента и учета результатов реакции, с инкубацией на каждом этапе постановки реакции и применения промывающего буферного раствора и разводящих растворов для образов и конъюгата согласно изобретению в качестве специфического антигена для сенсибилизации планшета используют смесь природного комплекса антигенов Bordetella pertussis, полученного без разделения компонентов и содержащего фимбриалльные агглютиногены типа 2 и 3, пертактин, коклюшный токсин, филаментозный гемагглютинин, и коклюшной суспензии, в качестве положительного контрольного образца - пул сывороток крови человека или животных, откалиброванный по реакции агглютинации, а в качестве промывающего и разводящего раствора для образцов и конъюгата применяют фосфатно-солевой буферный раствор с твином и блокатором.

При этом использование в качестве антигена для сенсибилизации планшета смеси природного комплекса антигенов Bordetella pertussis и коклюшной суспензии позволяет нанести на планшет максимальное количество антигенов, соответствующих полному антигенному составу Bordetella pertussis, что в итоге расширяет спектр выявляемых антител. Использование в качестве положительного контрольного образца пула сывороток крови человека или животных, откалиброванного по реакции агглютинации, позволяет стандартизовать результаты анализа, что обеспечивает повышение их точности. Применение одного буферного раствора на всех этапах постановки реакции уменьшает количество реагентов и упрощает процедуру анализа.

Состав набора следующий:

Тест-система комплектуется реагентами в различных вариантах, что позволяет потребителю в зависимости от поставленной задачи использовать один из 4-х предлагаемых наборов:

1. Тест-система иммуноферментная для определения коклюшных антител в сыворотках крови людей;

2. Тест-система иммуноферментная для определения коклюшных антител в сыворотках крови кроликов;

3. Тест-система иммуноферментная для определения коклюшных антител в сыворотках крови морских свинок;

4. Тест-система иммуноферментная для определения коклюшных антител в сыворотках крови мышей.

Способ получения ИФТС осуществляется следующим образом:

1. Приготовление иммуносорбента.

Для приготовления иммуносорбента обезвреженную формальдегидом и теплом антигенную фракцию Bordetella pertussis (содержащую комплекс антигенов (фимбриальные агглютиногены типа 2 и 3, пертактин, ТН, ФГА)), очищенную без разделения компонентов (патент РФ №2504399), разводят стерильным карбонат-бикарбонатным буферным раствором концентрацией 0,06 моль/л и pH (9,5±0,1) до содержания белка 10 мкг/мл.

Коклюшную суспензию инактивированную, представляющую собой суспензию убитых формалином коклюшных микробов первой фазы трех штаммов Bordetella pertussis (серовара 1.2.3 - 1 штамм, серовара 1.0.3 - 1 штамм, серовара 1.2.0 - 1 штамм), взятых в равных соотношениях (ЛСР-002909/10-070410), разводят стерильным карбонат-бикарбонатным буферным раствором концентрацией 0,06 моль/л и pH (9,5±0,1) до содержания 5 млрд коклюшных клеток в 1 мл.

Полученные растворы смешивают в соотношении 1:1, вносят в каждую лунку 96-луночного цельного или разборного полистиролового планшета для иммунологических реакций. Планшет герметично закрывают и выдерживают 18-20 часов при температуре 2-8°C. Затем содержимое лунок удаляют сильным встряхиванием, планшет подсушивают постукиванием по сложенной в несколько слоев фильтровальной бумаге.

Для стабилизации антигена на твердой фазе в каждую лунку планшета вносят стерильный 4% раствор сахарозы, содержащий 1 мг/мл БСА. Планшет герметично закрывают и выдерживают 30 минут при температуре 20-22°C. Затем содержимое лунок удаляют сильным встряхиванием, планшет подсушивают постукиванием по сложенной в несколько слоев фильтровальной бумаге.

Планшет помещают в пакет из полиэтиленовой пленки, закладывают осушитель и герметично запаивают. Иммуносорбент хранят при температуре 2-8°C.

2. Приготовление положительного и отрицательного контрольного образца.

Для приготовления положительного контрольного образца используют инактивированные сыворотки крови людей или животных, имеющих титр коклюшных антител по реакции агглютинации не ниже 1:160. Положительный контрольный образец калибруют в условных иммуноферментных единицах (ИЕ/мл) по реакции агглютинации, поскольку в настоящее время нет международного стандарта коклюшных антител, а реакция агглютинации является единственным методом определения коклюшных антител, утвержденным ВОЗ.

Для приготовления отрицательного контрольного образца используют инактивированные сыворотки крови людей или животных, не имеющих коклюшных антител по реакции агглютинации и имеющих оптическую плотность не выше 0,15 в реакции иммуноферментного анализа.

Все человеческие сыворотки, используемые для приготовления стандартных образцов, контролируют на отсутствие антител к вирусам иммунодефицита человека ВИЧ-1, ВИЧ-2, вирусу гепатита C и отсутствие поверхностного антигена вируса гепатита B (HBsAg).

Контрольные образцы лиофильно высушивают с добавлением 2% сахарозы.

3. В качестве конъюгата используют коммерческие препараты (антитела против IgG человека или животных, меченные пероксидазой).

4. В качестве субстратного буферного раствора (ТМБ) используется коммерческий субстрат ТМБ (Subs ТМВ).

5. В ИФТС используют также 0,01 моль/л фосфатно-солевой буферный раствор (pH 7,2-7,4), содержащий 0,5% Твина-20 и блокатор (белково-солевой раствор (патент РФ №2206095)) - ФСБ-Т-Б, а также стоп-реагент - 5% раствор серной кислоты.

Постановка ИФА

1. Перед постановкой реакции все реагенты набора выдерживают при комнатной температуре не менее 30 минут.

2. Иммуносорбент трехкратно промывают раствором ФСБ-Т-Б, внося в каждую лунку планшета по 0,3 мл раствора и отсасывая содержимое лунок в сосуд для слива, в который налит 6% раствор перекиси водорода. По окончании промывки из лунок планшета тщательно удаляют остатки жидкости, постукивая по сложенной в несколько слоев фильтровальной бумаге, помещенной на поддон.

3. В лунки иммуносорбента вносят:

- двукратные разведения положительного контрольного образца (лунки: A1; B1; C1; D1; E1; F1);

- разведения контрольного отрицательного образца (лунки G1 и H1);

- исследуемые образцы (лунки А2…Н12).

Планшет герметично закрывают и инкубируют при температуре (37±1)°C в течение (60±5) мин.

4. После удаления образцов и пятикратного промывания планшета раствором ФСБ-Т-Б, в лунки вносят конъюгат в рабочем разведении. Планшет герметично закрывают и инкубируют при температуре (37±1)°C в течение (60±5) мин.

5. После удаления несвязавшегося конъюгата и пятикратного промывания планшета раствором ФСБ-Т-Б, в лунки вносят субстратный буферный раствор (ТМБ). Планшеты закрывают и инкубируют при комнатной температуре в течение 20 минут в защищенном от света месте. Реакцию останавливают добавлением в лунки планшета стоп-реагента.

6. Учет результатов.

Учет результатов производят спектрофотометрически в двухволновом режиме: основной фильтр - 450 нм, референс-фильтр 620 нм.

Определение уровня коклюшных антител в положительных образцах сывороток проводят по градуировочному графику, построенному в координатах: y - lg ОП К⁺, x - log₂ кратности его разведения (см. рисунок). График строят по результатам измерения ОП для пяти разведений К⁺, начиная с того разведения, ОП которого ближе к 1.000.

Зная ОП исследуемого образца (например, 0,647 - в разведении 1:100), находят lg этого числа (lg 0,647=-0,19) и через точку на оси ординат, соответствующую его значению (-0,19), проводят прямую, параллельную оси абсцисс. Через точку пересечения прямой и линейного участка графика опускают перпендикуляр на ось абсцисс и определяют log₂ кратности разведения положительного контрольного образца (Х=1,7), соответствующий значению ОП данного разведения исследуемого образца.

Затем по таблице 3 находят кратность разведения контрольного положительного образца, соответствующую этому логарифму (А=3,25).

После этого проводят расчет титра антител в исследуемом образце по формуле

, где Т - титр исследуемого образца, ИЕ/мл; T₁ - титр положительного контрольного образца (указан на этикетке); А - кратность разведения положительного контрольного образца, найденная по таблице 2; 100 - разведение положительного контрольного образца, кратность которого равна 1; В - разведение исследуемой сыворотки, в котором определялась оптическая плотность.

Пример расчета: Если титр положительного контрольного образца равен 400 ИЕ/мл коклюшных антител, то титр исследуемой сыворотки в нашем примере (табл. 4)

ИЕ/мл коклюшных антител

Образцы 200 сывороток крови были проанализированы параллельно в ИФА с использованием разработанной тест-системы и реакции агглютинации. Согласованность значений характеризовали коэффициентом корреляции (Кк).

Установлена высокая степень корреляции (Кк=0,80) результатов измерения концентрации коклюшных антител с помощью разработанной тест-системы и реакции агглютинации.

Область применения набора - оценка иммунного статуса населения; оценка эффективности иммунизации вакцинными препаратами, содержащими коклюшный компонент (цельноклеточный и бесклеточный); диагностика коклюшной инфекции по нарастанию титров антител в парных сыворотках крови; оценка иммуногенности вакцин на животных; научные исследования.